Cromatografia

MTODOS DE ANLISE - CROMATOGRAFIA
Curso: Cincias Farmacuticas Disciplina: Farmacognosia
Mtodos de anlise Cromatografia
Cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio desses componentes em duas fases, que esto em contato ntimo. Fase estacionria Fase mvel
Gabriela Maia
Mtodo moderno de anlise Facilidade de separao Identificao das espcies p qumicas q Quantificao
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Classificao
Vrios critrios:
Forma fsica
Tcnica geral
Cromatografia em coluna
Cromatografia planar
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Classificao
Vrios critrios:
Fase mvel
Lquido
Gs
Fluido supercrtico
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Classificao
Vrios critrios:
Mecanismo de separao
Fsico
Qumico
Mecnico
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Classificao
Adsoro
Baseia-se na adsoro dos componentes de uma soluo sobre a fase estacionria slida o componente que for mais fortemente atrado pelo adsorvente ser deslocado pela fase mvel de forma mais lenta.
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Classificao
Partio Separao dos componentes de uma mistura com base nos seus coeficientes de partio entre dois solventes imiscveis que constituem as fases mvel e estacionria.
Coeficiente de partio (logP) uma medida de solubilidade diferencial de compostos qumicos em dois solventes.
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Classificao
Troca inica
Fase estacionria constituda por um suporte, ou matriz, onde so adicionadas grupos funcionais ionizveis
+ +
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Classificao
Excluso
Baseia-se no tamanho das molculas do soluto que passam atravs da fase estacionria, constituda por um gel poroso: as molculas maiores no conseguem penetrar nos poros e so arrastadas pela fase mvel, enquanto que molculas de menor tamanho, capazes de entrar nos poros da fase estacionria so retidos por mais tempo no interior da coluna.
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Cromatografia em camada delgada
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Consiste na separao dos componentes de uma mistura g diferencial sobre uma camada delgada g atravs da migrao de adsorvente retido sobre uma superfcies plana.
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Preparao das placas

Preparao por espalhamento
Limpar as placas para eliminar gordura Tamanho da placa 20 x 20 cm Espalhadores aplicador ou basto de vidro uniforme Secar ao ar Placas pequenas mergulhar a placa na soluo de adsorvente.
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Placas pr-fabricadas.
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Ativao da placa
Depois de secar ao ar livre As placas pr-fabricadas geralmente no precisa ser ativadas Ativao depende do adsorvente Slica, alumina, terra diatomceas: 105-110 0C por 30 a 60 minutos Celulose: 105 0C por 10 minutos Aps ativao conservar em dessecadores ou caixas fechadas.
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Fase estacionria adsorvente

Slica (SiO2): cido de silcio amorfo Altamente poroso cido
Diversos tipos: Merck G aglutinante (gesso, amido, talco) para
reter a slica sobre a placa H sem aglutinante F Fluorescncia R Extrapuro P preparativa

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Slica (SiO2): cido de silcio amorfo
Emprego
Separao de compostos lipoflicos como aldedos, cetonas, fenis, cidos graxos, alcalides, etc.
Preparao
- 30 g de slica em 60-70 mL de gua destilada - 5 placas 20 x 20 cm - Agitao
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Alumina (Al2O3)
Alcalina Neutra cida
Uso
- Separao de compostos lipoflicos e pelo fato de poder ser preparada com caractersticas cida, neutra ou alcalina, bastante til na separao de substncias que apresentem variaes dessas caractersticas. Ex: Alcalides, aminas e vitaminas lipossolveis - 30 g de alumina em 40 ml de gua destilada
Preparao
- 5 placas 20x20 cm - agitao

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Outros adsorventes:
Celulose Poliamida Terra diatomcea
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Processo: adsoro
- Competio da fase mvel e da amostra, pela superfcie do adsorvente.
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Fase mvel - Devemos considerar a natureza qumica das substncias a serem separadas e a polaridade da fase mvel
Srie eluotrpica polaridade poder de eluio. Se a fase mvel pura no separa usa usa-se se misturas de solventes solventes.
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Fase mvel T t Teste
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Formas de aplicao das amostras nas cromatoplacas.

Solues, em solventes volteis Micropipetas ou microsseringas Capilares de vidro Aplicadores automticos
Placas analticas
Gotas ou manchas 1 a 2 cm acima da borda inferior Entre as gotas 1 cm
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Placas preparativas
Aplicao na forma de faixas ou linhas, cerca de 2 cm acima da borda inferior Faixa horizontal uniforme Retirar a faixa da placa
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Formas de desenvolvimento
Cromatografia ascendente
Solvente deve cobrir a base da placa em regio inferior a aplicao da amostra Cuba bem vedada: evaporao/condensao Mltiplo desenvolvimento: diversas subidas
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Formas de desenvolvimento
Desenvolvimento ascendente bidimensional - Sobe uma vez, retira, secar e girar 90 graus e subir novamente em outro sistema de solvente
Desenvolvimento circular Posio horizontal Amostra em um crculo ao redor do centro Chromatotron Preparativa
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Revelao - Consiste C i t em tornar t visvel i l as substncias b t i i incolores l presentes na amostra
Mtodos : Fsicos Qumicos Biolgicos

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Reativos Universais: reagem com a maioria dos compostos orgnicos, indiferente a classe ou a funo qumica.
Fsicos Lmpada de Ultra-violeta compostos que absorvem (cromforos) tornam-se fluorescentes quando excitados por essas radiaes, comprimento de onda selecionado (254 a 360 nm) emitem manchas escuras (arroxeadas).
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Vapores de iodo - formam complexos com os compostos orgnicos,

geralmente de cor marrom. - Vantagem: que o iodo pode ser eliminado por aquecimento da placa, podendose borrifar a placa com outro revelador. - Isso possvel porque o iodo se une apenas fisicamente s substncias, exceto em compostos insaturados, pode se somar as insaturaes.
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cido sulfrico/metanol- oxida todos os compostos orgnicos, produzindo d i d manchas h coloridas l id aps aquecimento(~100 i ( 100 0C)
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Reativos especficos Anisaldedo sulfrico - usado na deteco de esterides e terpenides. Apresentam manchas rosadas aps aquecimento (~100 oC).
Cloreto frrico C f i ( C 3) - deteco (FeCl d d grupo hidroxila de hid il (OH) (O ) aromtico, como compostos fenlicos em geral (flavonides, taninos, fenis, etc). Produz manchas coloridas (azul, verde, marrom, etc).
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Reativos especficos Reativo de Dragendorff - usado para deteco de alcalides. Produz manchas alaranjadas intensas.
OBS: Devido este reativo dar falso positivo com sesquiterpenos e outros compostos, deve-se confirmar a presena de alcalides usando outros reativos( p. ex. Mayer, Wagner, etc.)
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DETERMEINAO DO FATOR DE RETENO (RF)
Rf = distncia percorrida pela mancha desde a origem (b)

distncia percorrida pelo solvente desde a origem (a)
Rf adequado ~ 0,4 - 0,6
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Rf= distncia percorrida pela mancha desde a origem (b)

distncia percorrida pelo solvente desde a origem (a)
Linha do solvente
b3 b2 b1
a
Origem
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Vantagens
- Fcil F il compreenso e execuo - Separaes em breve espao de tempo - Repetitividade - Baixo custo
Aplicaes
- Presente em todos os laboratrios de qumica ou biologia - Anlise de substncias orgnicas e inorgnicas - Acompanhamento de reaes de sntese e de processos de purificaes
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1) Um acadmico realizou uma reao entre os compostos A e B, procurando obter C. Verificou experimentalmente os seguintes perfis em CCD, visualizados por lmpada de UV. Discuta os resultados.
10 min. 30 min. 1 hora 2 horas
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1) Um acadmico realizou uma reao entre os compostos A e B, procurando obter C. Verificou experimentalmente os seguintes perfis em CCD, visualizados por lmpada de UV. Discuta os resultados.
10 min. 30 min. 1 hora 2 horas
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Cromatografia em papel
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um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, em funo do deslocamento diferencial do soluto arrastados por uma fase mvel, sendo retidos seletivamente por uma fase estacionria lq id lquida.
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A separao: relaciona-se com as diferentes solubilidades l bilid d na fase f mvel l e na fase f estacionria. A celulose(suporte): mais de 2000 unidades de acar anidro ligadas por oxignio. A gua tem afinidade pelo oxignio e forma pontes de hidrognio com o acar, ficando retido e funcionando como fase estacionria.
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Cromatografia ascendente
Utiliza tira de papel Marca-se com lpis o ponto de aplicao da amostra (2 cm da margem) e o ponto de chegada da fase mvel. A tira de papel deve ser suspensa na vertical dentro de uma cuba, com solvente que deve ficar abaixo do ponto de aplicao da amostra e estar bem vedada. A fase mvel move-se por capilaridade Verifica-se o Rf.
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Papel
Suporte Deve ser uniforme em composio e superfcie. Existem vrios tipos e a escolha depende das caractersticas da amostra. Tambm podem ser modificados: Papel acetilado: til para separar substncias hidrofbicas Papel impregnado com silicona, parafina etc.: para separao de substncias moderadamente hidrfobas.
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Fase mvel - Influencia muito na separao - Deve ser escolhida de acordo com a natureza qumica das substncias da amostra, assim como pela viscosidade e polaridade da fases mvel. Ex: ter de petrleo, hexano, tolueno, acetona etc.
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Fases estacionria
Fase estacionria normal - Fases aquosa: o papel saturado com vapor de gua ou vapor de gua mais outro solvente, no interior de uma cuba fechada antes de iniciar o desenvolvimento. - Fase estacionria no-aquosa: trata-se o papel em soluo de acetona e dimetilformamida, por 10 a 15 min e depois deixa-se secar.
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Fases estacionria - Fases estacionria fase reversa O papel tratado com substncias hidrofbicas (parafina lquida, leo etc)
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Aplicaes Identificao e separao de compostos polares, substncias hidrofbicas como antibiticos hidrossolveis, cidos orgnicos e ons metlicos Mais pratica que cromatografia em camada delgada e de fcil reproduo do Rf para caracterizao. til para acompanhar a seqncia de uma reao qumica
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Cromatografia em Coluna
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- Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plstico, preenchida com um adsorvente adequado.
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Coluna
Vidro
Extremidade aberta
Torneira
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Coluna
Metal
Torneira
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Coluna
Dimenses Depende da quantidade do material a ser cromatografado Dimetro interno Preparativas (6- 50 mm) Anliticas (2-6 mm) Microdimetro (HPLC) (1-2 mm) Capilares (CG) (< 1 mm)
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Adsorventes
Os mesmos da cromatografia plana: A dif diferena est t no tamanho t h das d partculas t l (63 a 200 m) ) enquanto que na cromatografia planar ( 5 a 40 m)
Ex: slica, alumina, sephadex
Silicato de magnsio propriedades intermedirias entre a slica e a alumina; separao de esterides, lipdios e derivados de acar acar. Carvo uma mistura de carvo grafitizado, cuja superfcies so polares. carvo ativo obtido pela oxidao de material orgnico baixa temperatura, que contm grupos funcionais apolares.
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Processo de adsoro
As substncias eluiro da coluna segundo a polaridade. Sli e alumina: Slica l i polares l retm t substncias b t i polares l
CO2H > OH > NH2>SH > CHO >C=O > CO2R > OCH3> CH=CH
Apolar
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POLAR
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Processo de adsoro - Deve-se Deve se evitar que o movimento da substncia adsorvida na coluna seja lento e que a banda se torne larga
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Reaes na coluna
Adsorventes podem catalizar reaes Exemplos: Alumina alcalina condensao de aldedos e cetonas Slica pode levar a isomerizao de terpenos e esterides
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Fase mvel
Funo do solvente: devem ser levadas em considerao as relaes d solubilidade de l bilid d dos d componentes t da d mistura i t a ser cromatografada. t f d
Funo de eluente: promover o desenvolvimento da mistura na coluna e remover esses componentes do adsorvente seletivamente.
Devem ter baixo ponto de ebulio (35-85 C) para que sejam evaporados facilmente.
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A escolha do eluente pode ser baseada em CCD

Eluentes : ordem crescente de polaridade
Hexano ter de petrleo Cicloexano Tolueno Diclorometano Clorofrmio ter etlico Acetato de etila Piridina Acetona Etanol Metanol cido actico
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Enchimento da coluna
Uniformidade= eficincia
Dificuldades ar retido: forma canais Para evitar agitar o adsorvente num frasco com a fase mvel at formar uma pasta Coloca-se a pasta na coluna contendo pelo menos um tero de solvente sob vibrao As partculas da fase estacionria devem ser o mais homogneo possvel Evitar deixar a coluna secar
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Aplicao da amostra
Colocada no topo da coluna Slida ou lquida Aps adiciona-se fase mvel E fase estacionria
Proporo de fase estacionria no mnimo 25/1 da amostra
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Eluio
- Conveniente fixar a coluna na posio vertical - Ao da gravidade e evita canais de ar
- A fase mvel passa pelo adsorvente e trs consigo os componentes da amostra
- Quanto mais fracamente o componente for adsorvido mais rapidamente passar pela coluna
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Gabriela Maia
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Gabriela Maia
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Gabriela Maia
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Para ocorrer uma completa separao, a fase mvel deve ser :

Fracamente adsorvida No ser afetada q quimicamente Possibilitar realmente o desenvolvimento de uma corrida cromatogrfica, ocasionando por um determinado grau de adsoro.
Visualizao
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Gabriela Maia
Vantagens
- Tecnicamente simples - Facilmente aplicada para fins preparativos
Desvantagens:
- Produo de caudas - No totalmente reprodutvel
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Aplicaes:
Laboratrio de qumica orgnica: separao e purificao de reagentes e materiais obtidos por sntese Laboratrios de produtos naturais: escala preparativa Laboratrio de anlise clnicas: para separar esterides da urina ou do sangue
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Gabriela Maia
Cromatografia por excluso
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A cromatografia por excluso promove uma seletiva e dinmica distribuio das molculas do soluto entre duas fases lquidas separadas, dependentes de uma estrutura estacionria contendo poros de tamanho controlado.
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Gabriela Maia
O recheio ou gel constitudo por macromolculas que

tem ligaes cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que nele l so insolveis. i l i Fase estacionria gel, no-carregado, e inchado com o mesmo lquido. Uma molcula dentro da fase estacionria no se move na direo do fluxo do lquido.
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Gabriela Maia
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Fases
O gel no realmente uma fase estacionria, ele apenas fornece os poros nos quais se d o mecanismo de distribuio, essa distribuio do soluto entre a fase mvel dentro e fora dos poros. Gel material elstico, contendo gua, com estrutura tridimensional contendo ligaes cruzadas. Homogneo mais moles e permitem entrada de partculas com baixo peso molar Heterogneo regies concentradas e outras quase vazias, entrada de molculas maiores.
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Gabriela Maia
Caractersticas de um gel adequado

Inrcia qumica Estabilidade b l d d (pH ( e temperatura) ) Baixo teor de ons Quimicamente definido, permitindo variaes para o fracionamento de diferentes intervalos de massa molar. Deve conter partculas de tamanho e distribuio controlados Rigidez mecnica para no se deformar pelas foras do fluxo
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Tipos de gel Gel de dextrana

- um polissacardeo com unidades de glicose, obtido por fermentao da sacarose. - Em contato com a gua incha e forma um gel.
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Sephadex (PHARMACIA)
Quimicamente estvel; Vrios graus cruzadas; de ligaes
G-10 ou G-25 peptdeos; G-50 G 50 LH-20 pode ser usado com solventes polares, fracionamento de pequenas molculas.
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Gabriela Maia
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Gel de gar e agarose

Indicados para separao de substncias de alta massa molar, com vantagem de apresentar estabilidade mecnica. gar Obtido de algas, contm grupos carregados negativamente. Agarose um componente do gar, sem grupos carregados. So sensveis a temperatura.
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Equipamento
Coluna cromatogrfica Amostra lquida No empacotar a coluna Sistema de solvente
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Vantagens
Simplicidade tcnica Insensibilidade a temperatura e solvente Versatilidade
Aplicaes
Separao de molculas que diferem no tamanho Remoo de fenol de preparaes de cidos nuclicos Remoo de substncias radio ativas Determinao da massa molar
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Cromatografia por Bioafinidade
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Baseia-se nas propriedades biolgicas ou funcionais das espcies que interagem: a substncia a ser separada e a fase estacionria. t i i Princpio do mtodo Isolamento seletivo de macromolculas, atravs das propriedades dessas substncias de unirem-se reversivelmente a ligantes especficos
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Suporte insolvel ou matriz

Ser mecnica e quimicamente estveis Uniformes Propriedades Rgidas Esfricas Porosas Interagir fracamente com as macromolculas
Exemplos: celulose, agarose, dextrana etc

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Preparao das fases estacionrias

Ativao ao da matriz a ligao gao de g grupos upos reativos ea os a matriz a inerte e e
M-OH + A-R-B M-OR-B + HA

Acoplamento do ligante matriz ativada. Tempo de acoplamento de poucas horas, horas a temperatura ambiente.
M-OR-B +H-Ligante M-OR-Ligante + HB

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Preparao da coluna
Montagem igual aos demais Preferir plstico ou ao inox Colunas pequenas (seletiva) 3x0,8 cm
Preparao da amostra
Dissolvida no eluente que iniciar o processo Vazo alta pode diminuir a eficincia A temperatura diminui a afinidade
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Aplicaes
Purificao de macromolculas (protenas, enzimas, anticorpos, receptores)
Purificao de micromolculas (peptdeos)
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Cromatografia de troca inica
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A fase estacionria altamente carregada, e solutos com cargas de sinais contrrios a esta so seletivamente adsorvidos da fase mvel. Os solutos adsorvidos podem ser subseqentemente eludos, por deslocamento com outros ons, com o mesmo sinal, mas maior fora de interao com a fase estacionria. A diferena de afinidade entre os ons da fase mvel e a matriz devido a diferena de cargas e pode ser controlada utilizando fatores como o pH e a fora inica.
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Matriz
Material poroso Inerte Insolvel em gua e em solventes orgnicos Apresentando ligaes covalentes a grupos trocadores inicos Podem ser inorgnica, g , orgnica, g , naturais ou sintticas Ex:Celulose, dextrana, agarose etc
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Trocadores
Liga-se covalentemente a matriz Aninico trocam nions e apresentam grupos positivos ligados a matriz Catinico trocam ctions e apresentam grupos negativos ligados g a matriz
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Aplicaes
Laboratrios de pesquisa Desionizao da gua e de muitos licores aucarados de frutos e sua despigmentao Anlise e eliminao de ons quando estes est o interferindo na dosagem de determinada substncia Laboratrios bioqumicos: dosagem de aminocidos Separao de frmacos
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Referncias
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Fundamentos de Cromatografia. Editora Unicamp. 2007.
Na pr prxima ima a aula la tem mais cromatografia...

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