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Cromatografia em Fase Gasosa

A Cromatografia
Mtodo fsico de separao As espcies a serem separadas encontram-se distribudas entre duas fases ; Uma fase estacionria , fixa e com grande rea superficial relativa Uma fase mvel , um fluido que percola atravs da fase estacionria .

Classificao dos mtodos Cromatogrficos

O Processo de Separao
A separao ocorre em funo da distribuio da amostra entre as duas fases A fase estacionria e a fase (gasosa) mvel ,chamada de gs de arraste , um gs inerte com a funo de transportar os componentes de uma amostra atravs da coluna para serem separados .

Em funo da caracterstica da fase estacionria temos : A Cromatografia gs liquido (CGL) e A Cromatografia gs slido (CGS) , onde Fase Estacionria um slido adsorvente de grande rea superficial Ex. slica gel , zeolita sinttica (peneira molecular) , carvo ativo (vegetal) . A Separao se d atravs da adsoro diferencial dos componentes da amostra geralmente empregada na separao de gases como o N2, O2 , CO2 etc.

A Cromatografia gs liquido (CGL) A fase estacionria uma fina camada liquida que reveste um suporte inerte e slido . A Separao se d atravs da distribuio da amostra dentro e fora desta camada , ou seja , a Partio da amostra entre as fases mvel e estacionria (liquida) .

A Separao

- No tempo t1 A e B , entram na coluna tal como se encontram na amostra (uma mistura) - No tempo t2 as molculas de B, com maior interao com a fase liquida (estacionria) , comeam a se retardar . - No tempo t3 as molculas de A j separadas de B , comeam a deixar a coluna . - O componente A (menos retido) deixa a coluna em tempo inferior ao B (mais retido) e aps a separao A e B podem ser identificados e ou quantificados .

TEORIA BSICA Fatores que governam o desempenho de uma separao cromatogrfica .

Cromatograma um registro grfico da analise , que indica O tempo de reteno e rea do pico A concentrao de cada um destes componentes na amostra Qualquer aumento na concentrao dos componentes da amostra causar um aumento proporcional na rea do pico referente ao componente Trs informaes importantes sobre o desempenho da separao

A teoria nos permite determinar duas caractersticas ; a posio do mximo do pico e sua velocidade de alargamento .
- No momento da injeo = perfil estreito de concentrao (t0) - Partio entre as duas fases e arraste atravs da coluna = gaussiana (tempo t1) - Maior Tempo na coluna = gaussiana de forma larga e baixa ( tempo t2) .

O tempo de reteno tR = tempo transcorrido desde de o momento da injeo at que o mximo do pico seja obtido tR uma caracterstica do soluto , da fase liquida , do fluxo do gs e da temperatura de trabalho na coluna , Mantendo-se todas as condies de trabalho o tR ser sempre o mesmo tM = o tempo desde a injeo at obter-se o pico inerte (ex. ar ) . O tempo t M uma medida do tempo em cada componente permanece na fase gasosa .

Posio do Pico
dada pela velocidade de fluxo do gs de arraste e pelo fator de reteno k ( tambm denominado de relao de partio ou de distribuio ) :

k=

m m'

a relao entre a quantidade de amostra na fase liquida (m) e a quantidade de amostra na fase gasosa (m) e esta relacionada com o tR :

tR = t M + t M k
O fator de Reteno (k) tambm pode ser relacionado com a constante de Distribuio (K) K=k Onde : = volume.de.liquido (relao de fases) Assim ; K = concentrao.da.amostra. fase.gasosa
concentrao.da.amostra. fase.liquida volume.de.gas

Volume de Reteno, VR . O volume de gs de arraste necessrio para eluir uma amostra da coluna o volume de gs que flui desde o momento da injeo at a eluio do pico Como fluxo FC constante no transcorrer de uma analise cromatografica em fase gasosa VR = tR x FC ou VR = VR - VM VR = tR x FC

Reteno Relativa
O fator de reteno ( ) a relao existente entre o tempo que dois picos permanecem na fase liquida , sendo proporcional aos coeficientes de partio ,
R = t ' ( A) = K ( A) R

t ' ( B)

K ( B)

- a medida da seletividade da fase liquida com relao a dois componentes . - Para = 1 os dois componentes tero a mesma solubilidade na fase estacionria e no apresentaro separao nesta fase . quanto maior for o valor de , maior a seletividade da fase liquida , melhor a separao entre os picos .

Determinao Grfica de ( )

Eficincia da Coluna
A eficincia de uma coluna cromatogrfica = nmero de pratos tericos (N) Definio = o equilbrio de distribuio do soluto entre as duas fases , quanto maior o numero de pratos tericos , mais equilbrios existiro e melhor ser a separao. Na prtica se calcula o N a partir do prprio cromatograma obtido . tR o tempo de reteno e Wb a largura da base do pico , obtido a partir das tangentes da curva gaussiana interceptando a linha de base ,

N = 16

tR W b

Alternativamente N pode ser calculado a partir da meia altura do pico , Wh ;

N = 5,545

tR W h

ou

Uma unidade derivada de N , o nmero de pratos tericos efetivos (Nef) , que dizer , o numero de pratos calculados a partir do tempo de reteno ajustado .
t'R Nef = 16 W b 2
t'R ou = 5,545 W h
2

Altura Equivalente a Um Prato Terico (A.E.P.T. ou H ) * Diversos fatores afetam o nmero de pretos tericos ; Tempo de reteno , Comprimento da coluna , Temperatura da coluna , Soluto , Fluxo do gs , Tamanho da amostra , Tcnicas de injeo e etc. Assim uma coluna pode ser melhor avaliada operacionalmente a partir de um artificio chamado de Altura Equivalente a Um Prato Terico (A.E.P.T. ou H ) , que esta relacionado com o comprimento da coluna ,L ( cm ou mm ) e o nmero de pratos tericos N . H=
L N

Portanto H o comprimento necessrio de uma coluna para gerar um prato terico , quanto maior N menor ser o H e mais eficiente ser a coluna .

EQUAO DE VAN DEEMTER

Os fatores que governam o alargamento das bandas de um pico podem ser melhor entendidos ,considerando-se a equao de Vai Deemter , assim chamada em homenagem ao autor do primeiro trabalho sobre o assunto em 1956 . Em sua forma mais simples a equao ; H=A+ Onde ; H = A.E.P.T. A = Efeito dos Mltiplos Caminhos (empacotamento) B = Difuso Molecular C = Resistncia a transferencia de massa _ = Velocidade linear mdia do gs de arraste = L / tM Os termos A,B,C no sero aqui abordados , eles contem os fatores que determinam a eficincia da coluna e demonstram que as colunas mais eficientes so obtidas quando se tem, suportes slidos pequenos e uniformes , so utilizadas pequenas percentagens de fase estacionria liquida (em CGL) e se utilizam baixas temperaturas para operar a coluna .
B
_

+C+

Resoluo

A resoluo (RS) uma medida quantitativa da separao de dois picos consecutivos , sendo determinada por dois fatores : tR e Wb
R RS = 1 ( W + W ) = W + W b1 b2 b1 b2

t R

2t

tR uma medida da separao dos mximos dos picos ( tR1 - tR2) , poder ser aumentado reduzindo-se a temperatura ou escolhendo-se uma fase mais seletiva ( maior ) . Wb uma medida da eficincia da coluna , relacionando-se com a velocidade de alargamento da banda, pode ser medido pelo nmero de pratos tericos N ou por H . A figura abaixo mostra a influencia de N e na resoluo .

Alem de N e , a resoluo depende da posio relativa dos dois picos no cromatograma . Uma equao geral ilustrando esta dependncia denominada de equao mestra da Resoluo .
N k +1 RS = 4 k +1

INSTRUMENTAO

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Cilindro de Gases Reguladores de Presso Injetor Seringa Coluna Forno Detector Registrador GS DE ARRASTE

Idealmente : No interagir com a Fase Estacionria e nem com a Amostra Adequado ao Detector Barato e estar Disponvel no Mercado Tipo de Detector Condutividade Trmica Ionizao de Chama Captura de Eltrons Gs de Arraste Ideal H2 , He H2 , He , N2 N2 ultra puro ou Argnio + 5% Metano

Para se ter Picos Ideais a Forma de Introduzir a Amostra na Coluna muito importante

Introduo da Amostra

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Vaporizao da Amostra Amostras Gasosas : Seringas Gas Tight ou Vlvulas Amostras Lquidas : Micro Seringas ( 1, 2, 3, 5, 25 e 100 L ) , o Injetor esta aquecido a 20 ou 30 C acima da P.ebulio da amostra Amostras Slidas : Preparar uma Soluo e Injetar como um Lquido Coluna Seleo Corao do Sistema Cromatogrfico
Destaca-se os parmetros ; 1. A Fase Estacionria ( O suporte Slido e a Fase Lquida ) 2. O Tubo ( Material , comprimento e Dimetro ) Cobre : Baixo custo , Fcil preparo e Manipulao , Pouco Inerte ( aminas , esteroides ) Vidro : Baixo custo , Inerte , Frgil Ao Inox : De largo uso na forma de espirais compactas de baixo volume , relativamente inerte , mais caro . 3. Dimenses ideais : Definida pelo propsito do experimento e eficincia desejada Colunas Empacotadas : Forma de espirais at 3 m com dimetro de 2 a 4 mm , preenchidas integralmente com partculas da fase estacionria Colunas Capilares : At 100 m ( usual 15 a 30 m ) , dimetro de 0,50 a 0,10 mm , com um fino filme da fase liquida depositado sobre as paredes do tubo . 4. Escolha da Fase Liquida : Processo difcil no existe procedimento bsico ,

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Alternativa : Obter o mximo de informao sobre a amostra , Componentes Provveis , Faixa de ebulio , Polaridades , estrutura qumica . O ponto de partida sempre a velha regra , Similar dissolve Similar , Maior a similaridade entre a fase Liquida e a amostra , mais simples a separao maior a eficincia 5. Limite de Temperatura da Fase Liquida : FASE 1 . Esqualano 2 . OV-1 ; SE-30 ; SP-2100 3. DEXSIL-300 4. OV-17 ; SP-2250 5. QF-1 ; OV-210 ; SP-2401 6. CARBOWAX-20M 7. DEGS 8. OV-275 6. Escolha do Suporte Slido : Ideal ; Grande rea superficial , alta resistncia mecnica ; inrcia e tamanho uniforme O mais popular suporte do mercado o Chromosorb produzido por Jhons Manville Co e encontrado em diversas granulometrias ( A , G , F , T , W ) Limite de Temperatura C 0 125 100 350 50 350 0 350 0 275 60 225 20 200 20 250

Controle de temperatura De Suma Importncia no processo de Separao ; O instrumento de ter controles independentes
Para : Temperatura de Injeo : Suficiente para Vaporizar a amostra Rapidamente Suficiente para no Decompor a amostra Temperatura da coluna : Suficiente para se obter tempos curtos de analise Operar dentro dos limites da fase estacionria Na maioria das vezes , menores temperaturas , maior Razo dos Coeficientes de Partio , melhor a separao Temperatura do Detector : Aquecido o Suficiente para evitar condensao de amostra Efeito , alargamento dos picos

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Detector Funo :
Indicar a Presena e Quantificar os Componentes no Efluente da Coluna Classificao : ( de acordo com a Resposta e Seletividade )

Universal :
Quando responde a todos os componentes presentes na amostra

Seletivo :
Quando responde apenas a determinadas classes de compostos

Especficos :
Quando responde apenas a Um ou um Especfico grupo componentes com caractersticas qumicas similares

Caractersticas desejveis :
Sensibilidade elevada Baixo nvel de Rudo Ampla faixa de Linearidade Detectabilidade Mnima Baixo Custo Durabilidade Elevada Simplicidade e disponibilidade no Mercado

Registradores Potenciomtricos Funo :

Imprimir na forma de uma Gaussiana o sinal eltrico proveniente do Detector proporcional a quantidade de amostra injetada no sistema

Integradores Eletrnicos :
Alem de representarem o Cromatograma , permitem registrar , tempo de reteno , altura do pico e a rea do pico .

Computadores :
Alem dos registros de dados , permite o controle de todas as funes do Cromatografo

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DETECTORES

BASES FSICAS DO FUNCIONAMENTO Velocidade da Perda de Calor de um Corpo quente para os Gases na sua vizinhana Em Condies Analticas Ideais podemos utilizar isto para medir a composio de uma Amostra O Corpo Quente , so Filamentos Metlicos ( Platina , Ouro , Tungstnio ) inserido numa Cavidade de um bloco metlico grande Com o Choque das Molculas vaporizadas com o Filamento Quente , esta transfere calor para o Gs Em funo de sua Mobilidade ( Velocidade de Difuso ) O Gs apresenta maior ou menor Condutividade Trmica C.R.T 100 128 18 17,5 13,5 10,8 14 2,7 9,9 P.M 4 2 28 30 58 128 58 46 119

Compostos Gs de Arraste Hlio Hidrognio Nitrognio Solutos Etano n-Butano n-Nonano i-Butano Etanol Clorofrmio

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Vantagens
Detector de construo simples , barato Faixa de Linearidade razovel e boa estabilidade No Destrutivo pode ser usado para escalas preparativas No apresenta Restries para a natureza qumica dos compostos

Restries de Uso
Faixa de detectabilidade apenas razovel 10-6 g

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BASES FSICAS DO FUNCIONAMENTO Principio , a Condutividade eltrica de um Gs Diretamente Proporcional a quantidade de Partculas Carregadas , nele presente Quando somente o gs de arraste passa pela chama a corrente emitida muito pequena , 10-14 Amps . Quando Compostos Orgnicos Vaporizados passam pela Chama , o resultado da queima so Partculas Carregadas , a Corrente gerada proporcional ao analito eluindo da coluna , da ordem de 10-8 a 10-12 Amps Alguns compostos no detectados (Visto) pelo FID ; O 2 , N2 , NO , NO2 , CO , CO2 , CS2 , H2S , SO2 , H2O O Detector requer um gs como combustvel H2 e outro como comburente O2 (Ar) O desempenho do Detector tambm esta relacionado com a relao dos gases para a queima , normalmente 1:1:10 ( H2 , gs de arraste , Ar )

Vantagens
Detector de construo simples , barato Ampla Faixa de Linearidade e excelente estabilidade Seletivo a compostos Orgnicos Boa detectabilidade 10-12 g Excelente para analises a nvel de traos

Restries de Uso
Detector destrutivo Requer trs fontes de gases limitado na analises de compostos Inorgnicos (mesmo que volteis ) tomos eletronegativos presentes em compostos orgnicos ( O , P , S , halognios), podem diminuir a sensibilidade do detector

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SELEO da COLUNA Cromatografia Gs Slido (Adsorso)

Fase Estacionria : Slido Separao : Adsorso seletiva nas Partculas do suporte Uso mais Freqente : Anlise de Gases e compostos de baixo ponto de ebulio , especialmente utilizada na analise de poluentes a nvel de traos

Principais Adsorventes : Peneiras Moleculares , Zeolitas

Composio : Alumino-Silicatos ; 1,00 Al2O3 . 1,92 SiO2 . x H2O Apresentao : 5 A (poro de dimetro 5 ) 13 X (poro de dimetro 10 ) Uso mais Freqente : O2 , N2 , H2 , CH4 , CO , Ar ( a baixas temperaturas ) Dificuldades : Os gases CO2 , Cl2 , HCl , SO2 , e H2S so adsorvidos na coluna , precisa ser ativada a 300 c por 2 horas .

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SILICA GEL
Composio : Polmero amorfo , grupo principal Si-OH Apresentao : Spherosil (Rhone-Progil) e Porasil ( Waters ) Uso mais Freqente : Ar, H2 , CH4 , CO e etano ( a baixas temperaturas ) Spherosil
Tipo rea superficial m2/g Dimetro mdio dos poros XOA400 400 80 XOA200 185 150 XOB075 100 300 XOB030 100 600 XOB015 50 1250 XOC005 10 3000

Porasil
Tipo rea superficial m2/g Dimetro mdio dos poros A 350 - 500 100 B 125 - 200 100 -120 C 50 -100 200 400 D 25 - 45 400 800 E 10 20 800 - 1500 F 2-6 1500

* Atualmente esta praticamente substituda por Chromosrob 102 um polmero poroso

ALUMINA
Composio : xido de Alumnio ( -Al2O3- ) Uso mais Freqente : Apresenta boa Separao para Hidrocarbonetos Insaturados Dificuldades : um adsorvente mais fraco que a slica , requer ativao antes do uso * Atualmente esta praticamente substituda por polmeros porosos

CARVO VEGETAL
Composio :Carvo Apresentao : Carbosieve B (carvo ) , Carbopack (carvo grafitizado) Uso mais Freqente : Analise de compostos polares , H2O , lcoois , e compostos carbonlicos ao nvel de ppm e ppb Dificuldades : Produz picos com longa cauda (Carbosieve B) problema foi diminuindo com a introduo do Carbopack

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POLIMEROS POROSOS
Composio : Polmero Sinttico poroso , Etilvinilbenzeno entrecruzado com Divinilbenzeno Apresentao : Porapack e Chromosorb srie 100 e Tenax-GC (xido de 2,6 difenil-p-fenileno) Uso mais Freqente : Gases e Compostos de baixo ponto de Ebulio Porapack Separao de ; Temperatura Nota : P Compostos de polaridade intermediaria estvel at 250 c Menos Polar P-S Compostos de polares ( Cetonas ) 250 c Polar S = Silanizado Q Gases , metano , CO2 , Ar , etano e.t.c 250 c Mais utilizado deles Q-S Para compostos altamente polares 250 c ( cidos orgnicos) R Compostos reativos (cidos caboxilicos) 250 c S lcoois de cadeia ramificada e normal 250 c N Acetileno e outros Hidrocarbonetos 225 c T 200 c O mais polar da srie Chromosorb Tipo 101 S-D 102 103 104 105 S-D PE A-D P-A rea m/g 50 300 400 15 25 100 200 600 700

Poros

Temp. c Algumas Aplicao 0,3 0,4 275 cidos Glaxos, Aldedos, Cegonhas , Glicois ,teres , Esteres 0,0085 250 Compostos de Baixo peso Molecular, Apresenta cauda . 0,3 0,4 275 Hidrazinas ,aminas , amidas 0,06 0,08 250 Nitrilos , Amnia , xidos de Nitrognio , Xilenois 0,04 0,06 250 Misturas Aquosas de Formaldedo , Acetileno e gases Leves

* S = Estireno , D = Divinilbenzeno , PE = Poliestireno , A = Acetonitrilo , PA = Poliaromtico Tenax Separao de Composto Decanol-1 Dodecanol-1 Hexadecanol-1 Fenol m-Cresol o-Aminofenol m-Aminofenol Ebulio c 260 265 290 210 220 245 260 Reteno min. 1,5 2,5 7,0 2,5 4,0 9,0 11,5

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Cromatografia Gs - Lquido (Partio)

Caracterstica ideal para o suporte Slido rea Superficial Tamanho das Partculas Uniformidade dos Poros Inrcia Forma das Partculas Resistncia Mecnica 1 20 m / g Menor com melhor distribuio 10 m Atividade zero Regular Elevada

Alguns Suportes Slidos de maior Uso

Tipo Chromosorb P Chromosorb A Chromosorb W Chromosorb G Chromosorb T

rea m / g 4,0 2,7 1,0

0,5 7,8

So produzidos a partir de tijolos refratrios de terras diatomaceas , triturados e separados de acordo com sua granulometria , os mais rgidos e com maior rea so os mais comumente empregados T = resinas de Teflon

TRATAMENTO dos SUPORTES SLIDOS

Problema com Terras Diatomaceas : Grupos Si-OH ( Preparados a base de Diatomitas ) interferem na separao e apresentam problemas de adsorso , causando alargamento de banda . xidos minerais contidos nestes suportes podem catalisar reaes com a Amostra

TRATAMENTO CIDO : Consiste em lavagens do suporte com um cido Mineral para remover as impurezas e desativar a superfcie sem alterar sua composio , precisa ser removido aps o tratamento

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TRATAMENTO com SILANOS : 1 Reao entre o Suporte e DimetildicloroSilano (DMCS) envolvendo apenas um grupo Hidroxil

CH3 Si OH

+ (CH3)2SiCl2
DMCS

Si

Si CH3

Cl

CH3 Si O Si CH3 Cl

CH3

+ CH3OH

Si

Si CH3

CH3

A FASE LQUIDA Em CGL a Fase Lquida tem a funo de exibir capacidade necessria a separao dos componentes Caractersticas Ideais Ser Inerte Apresentar boa Solubilidade diferencial entre os componentes da Amostra ( elevado ) Ser Estvel em ampla faixa de temperatura No ser Voltil na faixa de temperatura de trabalho

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Estar facilmente disponvel , ser reprodutvel e de baixo custo

Escolha da Fase Lquida A Solubilidade diferencial entre os componentes da Amostra ( ) a caractersticas mais importante . Quanto maior for o valor de , reteno relativa , melhor ser a separao =
tR ( B ) tR ( A)

Influencia de sobre o n de pratos tericos (reteno relativa) N (n pratos tericos) 1,60 485 1,37 940 1,07 7400 1,015 160000 A seletividade ou fator de separao depende das interaes entre o soluto e fase lquida ou foras coesivas de Van der Walls Dipolo-Dipolo , Dipolo-Dipolo Induzido , Dipolo Induzido-Dipolo Induzido Na prtica a escolha da Fase liquida depende da composio da amostra : Quanto mais se souber a cerca da amostra em estudo ( componentes , ponto de ebulio , estrutura ) , mais fcil ser a seleo da coluna e das condies de operao . Para uma eficiente e normal separao a Fase Liquida deve possuir estrutura qumica similar aos componentes da amostra

Classificao de Solutos Classe III Classe IV Classe V Intermediaria Baixa Polaridade No Polar teres CHCl3 Hidrocarbonetos saturados Glicois, Glicerol c. Graxos Cetonas CH2Cl2 CS2 Amino lcoois Fenois Aldedos CH3CHCl2 Mercapitanas c. Carboxlicos Aminas primrias Esteres Hidrocarbonetos Sulfitos e secundarias aromticos PoliFenois Nitrilas c/ - H Aminas terciarias Hidrocarbonetos Outros oleifinicos Hidrocarbonetos Classe I Muito Polar gua Classe II Polar lcoois

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Classe I , Compostos capazes de formar pontes de Hidrognio Classe II, Compostos que contem um tomo doador (O,N,F) e hidrognio ativo Classe III, Compostos que contem um tomo doador (O,N,F) sem hidrognio ativo Classe IV, Compostos que contem hidrognio ativo e no tomo doadores Classe V , Compostos que no exibem capacidade de ligao com o hidrognio Classe I FFAP 20M-TPA Carbowaxes Ucons Versamid 900 Hallcomid Quadrol Theed Manitol Diglicerol Castorwax Fases Lquidas , Classificao Classe II Classe III Tetracianoetil penta- Todos os poli - Esteres eritriol Zonyl E-7 Dibutil tetrafitalato Ethofat SAID , Benzil cianeto Oxidipropiononitrila XE-60 Lexam XF-1150 Carbonato de propileno Amine 220 QF-1 Epon 1001 Poli Fenilester Cyanoetilsucrose OV - 17 Classe IV & V SE 30 SF 96 DC 200 Dow 11 Squalane Hexadecano Apiezons OV 1

Soluto Lquido III C IV D V C ou D IV C I II A ou B III II - D

Efeito das classes sobre a Reteno Sistema quase ideal , solutos separados de acordo com seus pontos de ebulio Soluto bem retido pela fase liquida Soluto geralmente retido pela fase liquida Soluto no bem retido pela fase liquida

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IV B V I - D IV A V

Soluto no retido pela fase liquida , Solubilidade normalmente limitada Algumas Fases Liquidas
SE-30 DOW-11 DB-1 OV-1 SP-2100

CH

CH 3 CH

CH O Si CH

Si O Si O CH
3 3

CH O Si

CH 3 O Si O CH
3

SE-52 OV-73 DB-5 n DOW-710

Polidimetilsiloxana

Polimetilfenilsiloxana 5% fenila

Carbowax OH CH
2

CH

O H n

PEG-20 PPG Durabond Wax

CH 3 Si(CH3 )
3

XF-1150 O Si(CH3 )
3

O Si CH 2 CH 2 C N

Polipropilenoglicol

n Polimetilcianoetilsiloxana

Colunas Capilares Cromatografia gasosa de alta resoluo (HRGC)

Tipos de colunas SCOT ; Coluna de tubo aberto com suporte recoberto WCOT ; Coluna de tubo Aberto com parede interna recoberta

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As colunas tubulares abertas foram introduzidas por J.E.Golay no inicio dos anos 60 , revolucionado a tcnica de CG , que passou a chamar HRGC . E foram popularizadas uma dcada aps os trabalhos de Horvth . Comparao entre Colunas Capilares e Empacotadas Parmetro Capilar Empacotada Comprimento m 5 50 26 Dimetro mm 0,1 0,5 24 Fluxo ml /min. 0,5 10 10 60 Pratos tericos 150000 ( 30 m ) 5000 ( 3 m ) Pratos efetivos / m 3000 2500 Capacidade do pico 50 ng 10 g Espessura do Filme 0,2 5 m 10 m

Sistemas de Injeo para HRGC Por possuir uma capacidade volume muito menor torna-se necessrio reduzir o volume de amostra injetado ; SPLIT INJECTION , Injeo com Diviso , Exemplo ; Para um fluxo de 100ml/min e um fluxo de coluna de 1 ml/min , se introduzirmos 2 l de amostra o volume que entra na coluna 0,02 l

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Injeo na Coluna On Column Injection ; Recentemente apareceram no mercado seringas com agulhas de 0,30 mm de dimetro em slica fundida , permitindo o uso desta tcnica ate para as colunas WCOT . Um Cromatograma de HRCG

Analise Quantitativa Etapas do Procedimento Analtico em CG

1 . Amostragem 2 . Preparo da amostra 3 . Anlise Cromatogrfica 4 . Integrao

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5 . Clculos 6 . Reportar o resultado Amostragem : A tomada de amostra deve ser representativa , isolar uma pequena alquota do total da populao . Preparo da Amostra : Dependendo da caracterstica da amostra , esta devera sofrer uma srie de processamentos qumicos e fsicos ate apresentar forma adequada para ser cromatografada . ( triturao , filtrao , extrao , diluio , concentrao ) Analise Cromatogrfica : Gs de Arraste O Injetor A Coluna O Detector O Registrador Integrao : A integrao de pico cromatogrfico visa relacionar o tamanho do pico com a concentrao da amostra . Principais Mtodos de Integrao

Manual
Altura do Pico rea do Pico Altura x Largura na meia Altura Triangulao Planimetria Cortar e pesar o Papel

Mecnico
Integrador tipo Bola e Disco

Eletrnico
Integrador Digital e Computadores

Integrao Manual
A integrao manual dispe de duas alternativas : Medir a altura do Pico , ou seja , a distncia entre seu mximo e a linha de base Medir a rea sob o Pico

Altura do Pico

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Vantagem , procedimento bastante simples e rpido Limitaes , Picos mal resolvidos , muito pequenos , alteraes na linha de base

rea do Pico
Existem quatro modos bsicos para se integrar manualmente a rea do pico

1) Altura x Largura a meia Altura ,

Procedimento bastante til para picos simtricos com forma similar ao tringulo ,

A = H x Wh
Resultados aceitveis so obtidos quando picos simtricos e de largura razovel so obtidos

2) Triangulao
Neste caso a Altura (H) medida da linha de base at o encontro com as tangentes dos lados do pico , onde tambm se determina o valor da Base (B) do tringulo ;

A=BxH/2
A tcnica conduz a resultados satisfatrios desde que com picos de forma gaussiana

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3) Planimetria
Neste caso a rea do pico obtida com um dispositivo para medir o permetro do Pico , um Planmetro , um contador digital mede a distancia percorrida que proporcional a rea .

Tcnica bastante verstil , mede qualquer tipo de pico , limitada a habilidade da pessoa que esta efetuando a medida .

4 ) Cortar e pesar o Papel

Apesar de enfadonho e lento um dos melhores mtodos de integrao manual , desde que a umidade e gramatura do papel integrador sejam constante .

29

Integrao Eletrnica
Detetor envia um sinal em pulsos a um conversor analgico digital (interface A/D) A integrao efetuada somando-se estes pulsos . Um circuito lgico determina , o mximo e fim do pico , calculando ainda a inclinao Um microprocessador calcula o tempo de reteno a rea e reporta os resultados obtidos

Diagrama genrico Integrador Eletrnico

Algumas das vantagens da Integrao Eletrnica ; ampla faixa dinmica de sinais ( desde microvolts ata volts ) , Boa sensibilidade , tima preciso e exatido . * A integrao eletrnica , atualmente substituiu todos os outros mtodos

Comparao entre mtodos de integrao Mtodo Tempo de Anlise ( para um pico) Planimetria Lento ( 1 min ) Triangulao Lento ( 1 min ) Altura x Largura Lento ( 1 min ) Cortar e Pesar Eletrnico Bastante Lento ( 2 min ) Rpido ( 10 seg. )

Preciso Sr 4,06 4,06 2,58 1,74 0,44

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Clculos Normalizao :
Consiste no clculo da % de um comente da amostra ( A ) , a partir da % de rea que este pico representa na rea total do Cromatograma ,

%A=

AreaA x100 AreaTotal

Limitaes : Assume que todos os picos foram eluidos e detectados , e que o detector apresenta a mesma resposta para todos os picos . Normalizao de rea Corrigida / Fator de Resposta : ( Ou Fator de Resposta do Detector ) So Fatores utilizados para converter as reas obtidas em valores proporcionais a % das massas . Preparam-se solues de Massa (m) conhecida para cada um dos Componentes de Interesse Aps obter a rea (A) de cada um dos picos , ccula-se a razo A/m , fator de resposta para aquele pico A rea corrigida do componente obtida , dividindo-se a rea do Cromatograma pelo fator de resposta Ento a % em massa do componente dada por
Area( A)corrigida x100 Areascorrigidas

%A=

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Pico A B C D

Clculo para Normalizao de rea Corrigida Massa rea A Fator de rea Injetada Cm resposta Corrigida m A/m A / ( A/m) 10 100 10 10 10 150 15 10 10 300 30 10 10 600 60 10

% massa pico 25 25 25 25

%A= %A=

Area( A) / F x100 AreaTotal / F

10 x100 40

= 25 %

Apesar de melhor que a Normalizao simples este mtodo ainda assume que todos os picos eluiram da coluna Padronizao Externa A % em massa de uma amostra desconhecida determinada a partir de um grfico de calibraro Prepara-se a curva de Calibrao lanando-se as reas obtidas a partir de solues de padres de massas conhecidas A % em massa da amostra dada por
md x100 ma

% massa =

Este mtodo melhor que os mtodos anteriores , mas requer o uso de padres de alta pureza e controle exato dos volumes injetados .

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Padronizao Interna
Padro Interno (PI) um Composto que se adiciona a amostra e deve ; No estar presente na amostra No interferir na analise Possuir alto grau de pureza Ser adicionado em concentraes similares ao composto de interesse Ser bem resolvido em relao aos outros picos

Preparo da curva de Calibrao Prepara-se varias solues com o padro do componente a ser analisado e o PI Construir a curva de calibrao de rea x massa ; Lanar no Grfico : A rea do Padro (Ap) dividida pela rea do PI (API ) contra a massa do Padro (mp ) dividida pela massa do PI (mPI ) A seguir , adiciona-se um a quantidade de PI a Amostra (desconhecida) , Cromatografando-se a mistura tem-se , Aa e API Calcula-se a razo Aa / API e obtm-se um valor Este valor interpolado no grfico de calibrao para se encontrar a razo das massas da amostra e do PI ( ma / mPI ) Multiplicando-se este valor ( ma / mPI ) pela massa do padro interno conhecido , temos a massa do componente em questo
a ma = m xm PI PI

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Efeitos da Temperatura em Cromatografia Gasosa

Analise Isotrmica : Temperatura constante do forno do inicio ao final da analise Programao de Temperatura : Temperatura do forno alterada durante a analise

Separao de uma mistura complexa ( hipottico)

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A Programao de Temperatura

A temperatura inicial : normalmente inferior ( de 50 a 90 C ) ao ponto de ebulio do componente mais voltil presente na amostra A velocidade do Aquecimento : O Valor timo um compromisso entre a Resoluo e o Tempo de Analise . Na prtica tipicamente variamos de 5 a 10 C / min. a rampa de temperatura A temperatura final : Deve ser prxima ao ponto de ebulio do componente mais voltil , levando-se em conta a temperatura mxima de operao da coluna

Requisitos necessrios para a P.T.C.G.

A . Programador de temperatura para o Forno B . Aquecedores separados para , injetor , Forno e detector C . Forno de pequeno volume com capacidade de refrigerao rpida D . Fase estacionria adequada a temperatura final de trabalho Comparao entre uma Analise Isotrmica e com P.T.C.G. Caracterstica Analise Isotrmica P.T.C.G. Preciso na medida dos picos Varia com a forma do Pico Pequena Variao Intervalo de ebulio da Limite : 100 C At 450 C amostra Fase estacionria Muitas limitada Controle de Fluxo Simples Controle diferencial Fornos separados Conveniente Necessrio Separao Depende dos componentes Pode ser Otimizado

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Cromatografia Lquida de Alta Eficincia ( HPLC )

1 Reservatrio de Fase Mvel , frascos de vidro de 1 a 3 litros , volume suficiente para um dia de trabalho 2 Bombas ; Aspectos mais importantes p/ o sistema de bombeamento Presso mxima de operao de 600 bars Vazo continua sem pulsos , ou com amortecedor de pulsos Intervalo de vazes entre 0,01 e 10 ml / min. Reprodutibilidade de constncia de vazo de 1,0 % Pequeno volume de bombeado , 0,5 ml para sistemas de bombas com pisto e eleuio com gradiente Tipos de Bombas mais utilizadas ; Bombas reciprocas e Bombas tipo seringa 3 Medidores de Presso ; ajudam a diagnosticar problemas com o sistema , como vazamentos e entupimentos 4 Vlvulas de Amostragem ; Com uma nicro-seringa injeta-se a amostra dentro de uma pequena cmara , onde dilucida e arrastada pela fase mvel , o volume deste loop varia entre 1 e 100 L .

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5 Colunas Colunas empacotadas geralmente com comprimento de 15 a 25 cm e 4,5 mm de dimetro Existem algumas fases estacionrias diferentes , que implicam em alguns mecanismo de separao

5.1 - Lquido Slido ou Adsorso Baseia-se na competio entre as molculas da amostra na fase mvel e os stios ativos da fase estacionria ( Suporte slido ) Adsorvente

Solvente

Soluto

5.2 Lquido Lquido ou por Partio ( Fase normal e Fase Reversa ) Baseia-se nas diferentes solubilidades existentes entre os componentes da amostra na fase mvel e fase estacionria , Assim ; componentes mais solveis na fase estacionria so seletivamente retidas por ela , enquanto as menos seletivas so transportadas mais rapidamente pela fase mvel . 5.3 por Excluso Efetua a separao de acordo com o tamanho efetivo das molculas , as molculas pequenas penetram mais nos poros do suporte , enquanto que as maiores so excludas de todos os poros , movendo-se mais rapidamente e as molculas pequenas so eludas mais lentamente . 5.4 por Troca Inica A fase estacionria uma resina de poliestireno entrecruzada com divinil benzeno ligados a grupos inicos , - SO-3 para trocadores de ctions e NR+3 no caso de trocadores de nions . M+ + R-SO-3 Na+ 6 Detectores ; idealmente devem exibir Alta sensibilidade e baixo limite de deteco Resposta rpida a todos os solutos Insensibilidade a mudanas de temperatura e vazo de fase mvel Pequena contribuio ao alargamento do pico em funo do volume da clula do detector Resposta linear as mudanas de massa do soluto Na+ + R-SO-3M+

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No destruio do soluto e Segurana e convenincia para o uso

Alguns Detectores mais populares em HPLC :

1 - Detector de aborvmcia Ultravioleta e no Visvel Baseia-se na absorvncia da luz por parte da amostra ao passar atravs duma radiao eletromagntica . Faixa do Ultravioleta at o infravermelho (em um dado comprimento de onda) Resposta seletiva aos compostos que absorvem no comprimento de onda de operao Existem dois tipos de Detectores , os de comprimento de onda varivel , espectroftometos e os fotomtricos , que funcionam com um ou dois comprimentos de onda fixos .

2 Detector por ndice de Refrao E o segundo detector de maior uso em HPLC Acompanha continuamente a diferena no ndice de Refrao da fase mvel pura e do efluente da coluna Para substncias que no absorvem no UV VIS , este sua melhor escolha Resposta universal com sensibilidade razovel da ordem de g ( 10-6 g ) O detector sensvel a variaes de temperatura , vazo e composio da fase mvel

Vantagens da HPLC

Menor tempo de anlise , Consegue-se anlises em alguns minutos , devido as rpidas

vazes de fase mvel e eficincia da coluna . Alta Resoluo ; possvel anlise de misturas complexa , checa a separar at duzentos compostos diferentes Resultados quantitativos ; exibem grande preciso para a maioria dos mtodos , com desvios inferiores a 0,5% Boa sensibilidade ; possvel utilizar-se detectores que permitem medidas de at 10-9 g Versatilidade ; a grande vantagem da HPLC , pode-se ser utilizada na anlise compostos orgnicos, inorgnicos e as amostras podem ser lquidas , slidas , inicas ou covalentes , sua nica limitao so os gases . Automao ; ampla possibilidade de automao

Limitaes da HPLC

Alto custo da Instrumentao ; os sistemas mais simples custam de U$ 7,000 a 20,000

e os mais automatizados atingem mais de U$ 50,000 Alto Custo de Operao ; Reagentes de alta pureza , colunas de reposio peridica , manuteno especializada e peas de reposio peridica , etc. Falta de um Detector Universal Seletivo ; Ainda no se dispe de um detector simultaneamente sensvel e universal . O de ndice de refrao universal porem sua sensibilidade bem limitada , o de UV VIS bem sensvel mas seletivo .

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Necessidade de Experincia na sua Operao ; Um operador necessita de pelo

menos seis meses de treinamentos .

Principais fases estacionrias em HPLC

ALGUNS ADSORVESTES SLIDOS DISPINVEIS COMERCIALMENTE Adsorvente Forma
Slica Gel M M M M P P M M M M M M M M M P P

Dimetro m
4 5 10 20 40 40 5,10,30 5,10,15,20 40 5,10,20 10 5,10 10 5,10,30 40 40 40

Marca Comercial
Microsil Slica Gel Porasil 5 Porasil 10 Porasil 20 HS Pellosil HC Pellosil LiChrosorb S1-60 Polygosil 60 Chromosorb LC-1 LiChrosfere S1-100 Vydac 101 IR Spherisorb S-W Porasil LiChrosorb Alox-T Chromosorb LC-3 HS Pellumina Pellamidon

Fabricante
Micromeritic Instruments Whatman Inc. Whatman Inc. Whatman Inc. Whatman Inc. Whatman Inc. E. Merck MacHerey - Nagel Johns - Manvile E. Merck Separations Group Phase Separations Limited Waters Associates E. Merck Johns - Manvile Whatman Inc. Whatman Inc.

Alumina Poliamida

M = micro partculas porosas , P = Pelicular

Idealmente o material slido deve exibir :

Em menor tempo possvel de separao Apresentar mxima capacidade de amostra Apresentar a melhor resoluo na separao da mistura Apresentar fcil capacidade de empacotamento Apresentar pequena que de presso e de baixo custo

Na Prtica temos Os empacotamentos com Slica so os mais utilizados atualmente resistem a altas presses, produzem um enchimento estvel e colunas eficientes de partculas pequenas e ainda possvel ligar-se vrios grupos funcionais a superfcie da slica . Conforme se diminui o tamanho das partculas a profundidade dos poros tambm diminui e a sada da amostra dos poros de forma mais rpida , obtendo-se assim anlises mais rpidas sem perda de eficincia , assim em HPLC matrias com partculas de at 10 m so preferidos .

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Fase estacionria para HPLC com Fase Ligada ALGUNS LQUIDOS DISPINVEIS COMERCIALMENTE
Grupos Tipo de Dimetro Marca Comercial Fabricante fase m Waters Associates Amina Normal 10 MicroSil NH2 E. Merck 10 LiChrosorb NH2 MacHerey - Nagel 5,10 Polygosil 60-D NH2 MacHerey - Nagel 5,10 Nucleosil NH2 Waters Associates 10 Bondapack NH2 Phase Separations Limited 10 Spherisorb S5 NH Micromeritic Instruments Nitrila Normal 10 Microsil CN MacHerey - Nagel 5,10 Polygosil 60-D-CN Separations Group 10 Vydac 501 TP Phase Separations Limited 5 Spherisorb S5 CN MacHerey - Nagel 5,10 Nucleosil CN Chromosorb LC-8 Johns - Manville 10 Waters Associates 10 Bondapack CN Whatman Inc. Amina & Nitrila Normal 10 Partisil 10 PAC Whatman Inc. 40 Co:Pell PAC Waters Associates Octyl ( C8H17 ) Reversa 4 Microsil C8 E. Merck 5,10 LiChrosorb RP-8 MacHerey - Nagel 5,10 Polygosil 60-D C8 MacHerey - Nagel 5,10 Nucleosil C8 Separations Group 10 Vydac 2081 R Micromeritic Instruments Octadecyl ( C18H37 ) Reversa 4 Microsil C18 MacHerey - Nagel 5,10 Polygosil 60-D C18 E. Merck 5,10 LiChrosorb RP-18 MacHerey - Nagel 5,10 Nucleosil C18 Waters Associates 10 Bondapack C18 Separations Group 10 Vydac 201 IR Whatman Inc. 5 Partisil 5 ODS Whatman Inc. 10 Partisil 10 ODS Whatman Inc. 40 Co:Pell ODS A superfcie da Slica o suporte mais utilizado e pode ser modificado por alguns tratamentos qumicos : Formao da ligao siloxano ( Si-O-SiR ) com o grupo silanol e um organoclorossilano

Si-OH + ROH

Si-O-SiR3 + HCl

Ligao Silcio Carbono por tratamento com Tionla e um Organo metlico

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Si-OH + SOCl2 Si-Cl + RLi

Si-Cl + HCl + SO2 SiR + LiCl Fase estacionria para HPLC de Troca Inica ALGUNS FASES COMERCIALMENTE

Tipo Troca Aninica

Dimetro m 10 10 10 10 5,10 10 10 10 10 5,10

Troca Cationica

Marca Comercial Partisil 10 SAX LiChrosorb NA Ionex SB 10 Vydac 301 TP Nucleosil SB Partisil 10 SCX LiChrosorb KAT Ionex SA 10 Vydac 401 TP Nucleosil SA

Fabricante
Whatman Inc. E. Merck MacHerey - Nagel Separations Group MacHerey - Nagel Whatman Inc. E. Merck MacHerey - Nagel Separations Group MacHerey - Nagel

O empacotamento utilizado em Troca Inica , possui grupos de ctions ou nions quimicamente ligados a : Partculas Porosas de Resinas Polimricas Slica com Camada Pelicular Micro Partculas porosas de Slica e Micro Particular porosas Resinas Polimricas

O material geralmente utilizado para a troca inoca o copolimero poliestireno-divinil benzeno que contm grupos ativos trocadores de ions ;

-SO-3 ( Trocadores forte de Ctions ) -CO-2 ( Trocadores fracos de Ctions ) -NR+3 ( Trocadores forte de nions ) -NH2R+ ( Trocadores fracos de nions )

As fases Catinicas so adquiridas comercialmente na forma de sais de Sdio ( Na+ ) As fases Aninicas so adquiridas comercialmente na forma de sais de Sdio ( Cl - ) Nota : Os processos de troca inica dependem muito da temperatura , assim recomenda-se um controle desta condio durante a analise .

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