ISSN 1676-7667

Cultura, Crescimento e Identificao de Bactrias do Gnero Staphylococcus aureus em Leite de Cabra

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Introduo
O leite de cabra um alimento que fornece importantes nutrientes para a alimentao humana. Quando produzido sem os cuidados necessrios pode ser capaz de permitir o desenvolvimento de interferentes indesejveis, como microrganismos patognicos. Tais problemas causam grandes prejuzos aos produtores (bactrias causadoras da mastite causam diminuio na produo de leite), a indstria (diminuio do rendimento e sabor desagradvel nos produtos) e aos consumidores (doenas transmitidas por alimentos DTAs). A qualidade do produto inicia-se na produo primria e depende da adoo de Boas Prticas Agropecurias (BPA) em todas as etapas de produo. Tais medidas visam garantir a higiene, a segurana e a qualidade do produto, alm de incluir cuidados com a sade dos trabalhadores envolvidos na produo. O estado sanitrio do rebanho, a higiene do ordenhador e as condies das instalaes e dos equipamentos so alguns dos fatores que afetam a qualidade higinico-sanitria do leite, permitindo a presena ou no de microrganismos no produto final.

On line
Sobral, CE Dezembro, 2009

Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus um microrganismo classificado como coco Gram positivo, ananerbico facultativo; uma bactria no mvel e tambm catalase e coagulase positiva. As clulas so esfricas e aparecem sozinhas ou pareadas, ou apresentam formaes semelhantes a cachos de uva. A parede celular resistente a lisozima sensvel a lisoestafina, a qual especificamente lisa as pontes de pentaglicina de Staphylococcus spp. Algumas cepas de S. aureus esto aptas produzir enterotoxinas estafiloccicas (SEs), agentes responsveis por intoxicaes alimentares estafiloccicas. S. aureus no formam esporos. Desta forma a contaminao pode ser prontamente evitada pelo tratamento atravs do calor. Contudo, este passo permanece como sendo a maior causa de DTA, pois pode acarretar na contaminao de produtos alimentares durante o preparo e o processamento. Staphylococcus aureus encontrado nas narinas, na pele e plos de animais de sangue quente. Mais de 30-50% da populao humana portadora natural desssa bacteria. Staphylococcus aureus capaz de se desenvolver em uma ampla faixa de temperatura (7 a 48,5C com uma temperatura tima de 30 a 37C; SCHIMITT et al., 1990), pH (4,2 at 9,3 com timo entre 7 a 7,5; BERGDOLL, 1989) e em altas concentraes de cloreto de sdio (acima de 15% de NaCl). Estas caractersticas permitem ao S. aureus crescer em uma grande variedade de alimentos e somadas ao seu habitat, podem facilmente explicar sua incidncia em alimentos que requerem manipulao durante o processamento, incluindo produtos alimentcios fermentados, tais como queijos. A avaliao do risco em alimentos baseia-se na clssica deteco e quantificao microbiana de estafilococos coagulase positivos em meio seletivo BairdParker, o qual possui composio padronizada. A sensitividade destes mtodos de rotina gira em torno de 102 UFC/mL para alimentos slidos e 10 UFC/mL para os lquidos (LE LOIR et al., 2003). Os diferentes meios utilizados para a deteco e quantificao de S. aureus tm sido revisados por Baird & Lee (1995). Em muitos pases, baixos nveis de contaminao por S. aureus so tolerados em vrios alimentos (acima de 103 UFC/mL em queijos feitos a partir de leite cru, por exemplo, na Frana), sendo que estes, no so considerados como risco para sade pblica.

Autores
Lea Chapaval
Md. Vet., D. Sc.; Pesquisadora da Embrapa Caprinos e Ovinos. Estrada Sobral/Groaras, Km 04 Zona Rural - Cx Postal 145 CEP: 62010-970 - Sobral/CE lea@cnpc.embrapa.br

Valdanya Mara Pereira Aguiar

Graduanda de Biologia Universidade Estadual Vale do Acara

Ana Paula Brando de Sousa

Biloga, Ps-graduanda em Vigilncia Sanitria Faculdade INTA

Keslley Pereira de Miranda

Graduando de Medicina Veterinria Faculdades INTA

Alan Martins Moror

Zootec., Ps-graduando em Vigilncia Sanitria, Faculdades INTA, Bolsista Embrapa Caprinos e Ovinos.

Daniele Cristina Timb Magalhes

Md. Vet., Ps-graduanda em Sade Pblica, Faculdades INTA

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Coleta do Leite
As amostras de leite devem ser coletadas em recipientes apropriados, limpos e esterilizados, conforme o tipo de exame a ser realizado e devem ser enviadas ao laboratrio em isopor contendo gelo, com temperatura em torno de 4C. As amostras de leite devem ser representativas do volume total de leite que se pretende avaliar, por exemplo, para a coleta de leite em animais individualmente deve-se obter uma amostra de 50 mL dos dois meios mamrios.

Estufa incubadora regulada a 35-37C com termmetro calibrado. Placas ou lminas com gar Azul de Toluidina DNA. gar Dnase Teste Base sem DNA DNA Azul de bromotimol Manitol

Acondicionamento e Armazenagem das Amostras de Leite no Laboratrio

Ao chegar ao laboratrio as amostras devem ser transferidas para freezer no intuito de manter a temperatura entre 2 e 4C.

Procedimentos de Laboratrio
Preparao das Amostras e Diluies Seriadas
A preparao das amostras para anlise envolve a retirada de uma unidade analtica que seja representativa do contedo da amostra de leite e a preparao das diluies decimais seriadas. Utilizar gua peptonada que um diluente para homogeneizao e diluio de amostras para anlise e transferir 9 (nove) mL para cada tubo. No caso de alimentos lquidos (leite) transferir assepticamente a unidade analtica (1 mL) diretamente para os tubos contendo 9 (nove) mL de diluente (gua Peptonada). Antes de retirar o volume a ser transferido, agitar vigorosamente o tubo manualmente ou com auxilio de um agitador tipo vortex. Para obter diluies subsequentes proceder transferindo 1 (um) mL da diluio anterior para 9 (nove) mL de diluente.

Material Requerido Para Anlise

Preparaco das Amostras e Diluies Seriadas
Diluente- gua peptonada Tubos de diluio com 9 (nove) mL de gua peptonada Pipetas automticas de 1 (um) mL

Contagem Direta em Placas

Placas com gar Baird-Parker (BP) Estufa incubadora regulada a 35-37C com termmetro calibrado

Contagem Direta em Placas

Preparaco das Placas
Para o plaqueamento em superfcie as placas devem ser previamente preparadas, com 15 a 20 mL do meio de acordo com o grupo de microorganismos que se objetiva contar. No caso do Staphylococcus aureus o meio mais amplamente utilizado o gar Baird-Parker (BP), no entanto este no capaz de suprimir completamente o crescimento de competidores do S. aureus, outras espcies no patognicas do gnero Staphylococcus podem crescer, produzindo colnias semelhantes, havendo a necessidade de submeter s colnias tpicas ao teste de coagulase para confirmao.

Confirmao
Tubos com Caldo Infuso Crebro Corao (BHI) Reagentes para colorao de Gram leo mineral estril Coagulase Plasma-EDTA Perxido de Hidrognio 3% Soluo Salina 0,85%

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Inoculao
Selecionar trs diluies adequadas da amostra. Inocular 0,1 mL de cada diluio na superfcie de placas com gar Baird-Parker (BP), previamente preparadas e secas. Espalhar o inculo com ala de Drigalski, das placas de maior diluio para as de menor diluio, at que todo o excesso de lquido seja absorvido.

Coloraco de Gram
Emulsionar uma alada de uma colnia tpica de S. aureus em uma gota de soluo salina numa lmina de vidro, em seguida secar a lmina usando a chama de um bico de bunsen.

Procedimento de colorao
1. Cobrir a lmina com Cristal Violeta e deixar agir por 1 minuto. 2. Sem lavar a lmina, adicionar Lugol, deixando agir por 1 minuto. 3. Ainda sem lavar proceder descolorao com lcool acetona por no mximo 5 segundos, at que a colorao violeta no se desprenda mais da lmina. 4. Enxaguar imediatamente com gua destilada. 5. Adicionar Fucsina e deixar agir por 20 segundos. 6. Enxaguar em gua destilada. 7. Deixar secar e observar em objetiva de imerso (100x). A colorao de Gram uma tcnica que cora os microrganismos com base na integridade e na composio qumica da parede celular. De acordo com a cor adquirida, roxo ou rosa, as bactrias so consideradas Gram positivas ou Gram negativas, respectivamente. Staphylococcus aureus so tipicamente Gram positivas (Fig. 2).

Incubaco
Aguardar que as placas sequem completamente e incubar invertidas a 35C por 48 horas.

Contagem das Colnias Presuntivas

Selecionar para a contagem as placas com 20 a 200 colnias. Contar apenas as colnias tpicas de S. aureus que so circulares pretas ou cinza escura, com 2-3 cm de dimetro, lisas, convexas, com bordas perfeitas, com massa de clulas esbranquiada nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e ou um halo transparente se estendendo para alm da zona opaca (Fig. 1). Eventualmente, colnias atpicas podem se apresentar cinzentas, sem um ou ambos os halos tpicos. Se a placa apresentar colnias suspeitas de mais de um tipo, contar separadamente e anotar o resultado.

Fig. 1. Placa de Petri com colnias tpicas de S. aureus.

Confirmao das Colnias Tpicas

Selecionar no mnimo cinco colnias tpicas para o teste de coagulase, havendo menos de cinco, tomar todas. Se a placa apresentar colnias suspeitas, tpicas e atpicas, selecionar pelo menos cinco de cada tipo, ou um nmero proporcional a distribuio dos diferentes tipos na placa. Transferir cada colnia para tubos de Caldo Infuso Crebro Corao (BHI).

Fig. 2. Colnias de S. aureus Gram positivas.

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Catalase
Emulsionar uma alada de uma colnia tpica de S.aureus em uma gota de gua oxigenada (perxido de hidrognio) em uma lmina de vidro (Fig. 3). Observar a ocorrncia de borbulhamento imediato (teste positivo) ou no (teste negativo). As cepas de S. aureus so catalase positivas.

Colocar as lminas dentro de placas de Petri recobertas com papel filtro umidificado e selar as placas com fita crepe. Incubar a 35-37C 4h ou 50C 2h e observar aps a incubao se h formao de um halo rseo (Fig. 5). Se o halo estender-se por cerca de 1 mm ao redor das perfuraes inoculadas, considera-se teste positivo, na ausncia do halo indica teste negativo.

Fig. 3. Teste de Catalase.

Coagulase
Transferir 3 mL de cada cultura obtida em BHI, para um tubo estril em seguida adicionar 3 mL de Coagulase plasma-EDTA (plasma de coelho com EDTA). Misturar com movimentos de rotao, sem agitar os tubos para no interferir na coagulao. Incubar a 35-37C e observar ao final de seis horas se h formao de cogulo firme que no se rompe quando o tubo virado para baixo (Fig. 4). Quando ocorre a coagulao, considera-se teste de coagulase positivo.

Fig. 5. Teste de Termonuclease: Formao de halo rseo ao redor do inoculo.

DNAse
O gar Dnase Teste Base sem DNA usado pela deteco da atividade da desoxirribonuclease de bactrias e fungos e particularmente da identificao de Staphylococcus patognicos. Dissolver 40 gramas em 1000 mL de gua destilada em seguida adicionar 2 gramas de DNA, 0.025 gramas de azul de bromotimol e 10 gramas de manitol. Ferver para dissolver o meio completamente. Esterilizar autoclavando entre 12 e 15lbs de presso entre 118 e 121C por 15 minutos. Resfriar at 45C e despejar em placas de Petri estreis. Avaliao de Resultados (Fig. 6): Caractersticas da cultura depois de 18-24 horas a 35-37C.

Fig. 4. Teste de Coagulase: aps a formao de cogulo.

Termonuclease
A partir do caldo BHI, transferir uma poro da cultura para um tubo estril e ferver em banho-maria por 15 minutos. Inocular a cultura fervida e resfriada nos orifcios previamente preparados em lminas de Agar Azul de Toluidina DNA. Usar uma das perfuraes para uma cepa padro termonuclease positiva e a outra para uma cepa padro termonuclease negativa.

Fig. 6. Atividade da DNAse positiva.

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Referncias
BAIRD, R. M.; LEE, W. H. Media used in the detection and enumeration of Staphylococcus aureus. International Journal Food Microbiology, v. 26, p. 1524, 1995. BERGDOLL, M. S. Staphylococcus aureus. In: DOYLE, M. P. (Ed.). Foodbome bacterial pathogens. New York: Marcel Dekker, 1989. p. 463-523. (Food science and technology, 31). LE LOIR, Y.; BARON, F.; GAUTIER, M. Staphylococcus aureus and food poisoning. Genetics and Molecular Research, Ribeiro Preto, v. 2, n. 1, p. 63-76, jan., 2003. SCHMIDT, M.; SCHULER-SCHMID, U.; SCMIDTLORENZ, W. Temperature limits of growth,TNase, and enterotoxin production on of Staphylococcus aureus strains isolated from foods. International Journal Food Microbiology, v. 11, p. 1-19, 1990.

CHAPAVAL, L.. Deteco de enterotoxinas estafiloccicas produzidas por Staphylococcus aureus no leite bovino por eletroforese capilar e identificao dos isolados enterotoxigenicos via PCR. 2003. Tese (Doutorado em Energia Nuclear na Agricultura) Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Piracicaba. OLIVINDO, C. S. Deteco de microrganismos utilizando a tcnica de PCR em sequncias palindrnicas extragnicas repetidas (REP-PCR) no monitoramento da qualidade do leite de cabra em sala de ordenha. 2007. 54 f. Dissertao (Mestrado em Zootecnia) Universidade Federal do Cear, Fortaleza. SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A; SILVEIRA, N. F. A.; TANIWAKI, M. H.; SANTOS, R. F. S.; GOMES, R. A. R. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. 3. ed. So Paulo: Varela, 2007. 552 p. STREITFELD, M. M.; HOFFMAN, E. M.; JANKLOW, H. M. Evaluation of extracellular deoxirybonuclease activity in Pseudomonas. Journal of Bacteriology, v. 84, p. 77, 1962. WECKMAN, B. G.; CATLIN, W. B. Deoxirybonuclease activity of micrococci from clinical sources, Journal of Bacteriology, v. 73, p. 747, 1957.

Literatura Recomendada
BRITO, J. R. F.; SOUZA, G. N. de; FARIA, C. G. de; MORAES, L. C. D. Procedimentos para coleta e envio de amostras de leite para determinao da composio e das contagens de clulas somticas e de bactrias. Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, 2007. 7 p. (Embrapa Gado de Leite. Circular Tcnica, 92.).

Circular Tcnica, 41 On line

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