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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO RIO GRANDE DO SUL ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA GENTICA GERAL ALUNA: VANESSA SCHMIDT DATA: 05/09/13

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01: A vida faz parte dos chamados sistemas complexos, para os quais o tempo irreversvel e construtivo, ou seja, pode-se reconstruir a histria da evoluo dos seres vivos e da prpria vida, mas impossvel definir sua trajetria futura. A vida ainda um sistema altamente organizado em contraste com um universo que sempre tende ao aumento da desordem (entropia), como afirma a segunda lei da termodinmica. A contradio, porm, apenas aparente. O aumento da organizao do mundo vivo local: diz respeito s aos seres vivos e no a todo o universo. Assim, tais seres absorvem do meio a energia (alimentos, no caso dos heterotrficos, e luz solar, no caso dos autotrficos) necessria para suas atividades e para manter sua organizao, mas no balano final o universo continua tendendo desordem. 02: Pesquisadores buscavam descobrir como funcionava o mecanismo de transmisso da informao gentica e como as protenas eram sintetizadas. Em 1944 os canadenses Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty , do Instituto Rockefeller (EUA), mostram que o DNA, e no as protenas, que capaz de transformar bactrias no-patognicas em patognicas. Isso sugere que o DNA que armazena a informao gentica. O DNA a molcula informacional. Em 1950, o austraco Erwin Chargaff, descobre, nos Estados Unidos, uma relao quantitativa entre as bases nitrogenadas do DNA. A proporo (razo molar) entre adenina e timina sempre igual, e o mesmo ocorre entre guanina e citosina. A relao de bases A=T e C=G constante em DNA das mais variadas espcies e tecidos.

Rosalin Franklin e Maurice Wilkins, em 1951, obtm imagens de DNA de excelente qualidade, por difrao de raios X, onde foi possvel determinar a periodicidade regular que ocorria na molcula de DNA. A cada dez nucleotdeos uma distncia de 34 , sendo que cada nucleotdeo tem 3,4 .

03: A experincia de Griffith foi o passo inicial para se pudesse afirmar que os cidos nucleicos so as molculas da hereditariedade. Antes achava-se que quem guardava as informaes genticas eram as protenas e no o DNA. Nessa experincia foram usadas bactrias em 4 estados: Bactrias patognicas vivas Bactrias no patognicas vivas Bactrias patognicas morta Bactrias no patognicas mortas

O primeiro passo foi inocular em ratos uma certa quantidade de bactrias patognicas (S) vivas. Como se esperava, esses ratos morreram. Outro grupo de ratos foi inoculado com bactria no patognica (R) viva, como esperado, nada aconteceu com eles. Um terceiro grupo de ratos oi inoculado com bactrias patognicas mortas aquecidas pelo calor e todos sobreviveram. J o quarto grupo foi inoculado com bactrias patognicas (s) mortas misturadas com bactrias no patognicas (R) vivas e isso causou a morte desses animais.

Esse experimento foi repetido inmeras vezes. No exame de sangue do quarto grupo de ratos mortos indicava a presena de bactrias patognicas (S) vivas. Mas como, se apenas patgenas mortas foram injetadas nesse grupo ? Assim Griffith concluiu que alguma parte da clula das bactrias patgenas mortas era contaminou as clulas das no patgenas vivas. Bastava-se saber ento que parte da clula era essa. Qual a parte da clula das patgenas mortas que transmitiu o gene da patogenicidade para as bactrias vivas ? Mais tarde, Avery, MacLeod e MacCrt repetiram o experimento inoculando separadamente cada organela celular individualmente para descobrir qual

deles era responsvel pela transformao da patogenicidade das bactrias. Injetou as protenas das patgenas mortas e algumas bactrias no patgenas vivas. Nada aconteceu. Repetiu com o RNA, e com vrias organelas, mas s ocorreram mortes dos ratos quando foi injetado DNA das patgenas mortas misturados s no patgenas vivas. Assim esse DNA deveria carregar o gene da patogenicidade e que transformavas as bactrias em patgenas.

04: A prova que a molcula responsvel por esta transferncia de mensagem gentica era o DNA, foi dada pelo experimento realizado na dcada de 40 por Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn MacCarty, no Rockefeller Institute de Nova York. Esse ensaio teve como objetivo avaliar qual molcula presente em extratos de bactrias patognicas era responsvel pela transformao de bactrias no patognicas em patognicas. Eles realizaram uma srie de experimentos no qual o extrato de bactrias patognicas era submetido a diferentes tratamentos que degradavam especificamente certas classes de macromolculas. Quando os pesquisadores extraam esse material das bactrias patognicas, tratavam com proteases e, posteriormente, incubavam o extrato tratado com bactrias no-patognicas, essas passavam a ser patognicas. Esse mesmo resultado foi encontrado quando eles utilizaram RNAses, o que levou a concluso que o material gentico no era nem protico nem ribonuclico. Entretanto, o tratamento com DNAses destruiu

completamente a capacidade transformadora, levando os pesquisadores a concluir que o princpio transformante era a molcula de DNA.

05: Para resolver definitivamente a questo do DNA, em 1952, Alfred Hershey e Martha Chase utilizaram vrus que infectam bactrias, por isso chamados bacterigrafos, para realizarm experincias que contribuiram para confirmar que a molcula de DNA o suporte fsico da informao gentica. Note-se que uma vez no interior da bactria, o DNA do vrus multiplica-se e, por outro lado, a bactria passa a produzir protenas virais, que vo constituir a cpsula dos novos vrus, ou seja, a bactra passa a "obedecer a ordens do vrus". Antes de iniciarem as suas experincias, estes investigadores consideraram que:

Os vrus so seres simples que no apresentam metabolismo prprio, no sendo, por isso, considerados seres vivos. - Dependem de outros seres que infectam.

Os vrus no penetram nas clulas (a cpsula fica no exterior); As protenas da cpsula do vrus no tm fsforo (P), mas apresentam enxofre (S);

O DNA apresenta na sua constituio fsforo (P), mas no enxofre (S).

Isolaram, ento, dois lotes de bacterifagos (vrus que utilizam bactrias para se multiplicarem), que marcaram radioactivamente, parase conseguir seguir o seu trajectrio ao microcpio. Num dos lotes, marcaram s o enxofre das protenas (35S) e no outro somente o fsforo do DNA (32P). Os bacterifagos fixam-se na parede da bactria, perfuram-na e introduzem nela o seu DNA. As protenas da cpsula ficam no exterior. O DNA do vrus multiplica-se vrias vezes no interior das bactrias. A bactria "ao servio do vrus" passa a produzir protenas virais. Passado algum tempo, a parede da bactria rompe e libertam-se para o exteior os vrus recm-formados. Como apenas o DNA viral penetra nas bactrias e no as protenas, pode concluir-se que o DNA que contm a informao gentica necessria para a produo de novos vrus

06: Para entender melhor o DNA como material hereditrio, um dos primeiros passos em suas pesquisas foi investigar se havia diferenas entre o DNA de diferentes espcies. A partir desses estudos ele chegou a duas concluses principais: Que a composio de nucleotdeos do DNA varia entre as espcies, isto , os mesmos nucleotdeos no se repetiam na mesma ordem como proposto por Levene em suas pesquisas. Que quase todo o DNA, independentemente de qual organismo ou tecido tenha sido extrado, mantm algumas propriedades mesmo que sua composio seja varivel. Em particular, ele demonstrou que a quantidade do nucleotdeo adenina (A) sempre similar quantidade do

nucleotdeo timina (T), enquanto a quantidade de citosina (C) similar de guanina (G). Em outras palavras, Chargaff descobriu que o total de purinas (A+G) e o total de pirimidinas (C+T) eram geralmente iguais. Essas observaes ficaram conhecidas como as Regras de Chargaff e so resumidas no quadrinho abaixo: A pesquisa de Chargaff foi vital para o trabalho de Watson e Crick. Foram as relaes entre as bases nitrogenadas descobertas por ele que deram a Watson a ideia do pareamento dos nucleotdeos que constituem uma molcula de DNA em uma dupla-hlice. 07: A molcula de cido desoxirribonuclico (DNA) constituda por duas cadeias ou fitas de nucleotdeos que se mantm unidas em dupla hlice por pontes de hidrognio entre as bases dos nucleotdeos. Esses, por sua vez, so compostos por um grupo fosfato, uma molcula de acar de cinco carbonos (uma desoxirribose que possui um tomo de hidrognio no carbono 2, diferentemente da ribose, componente do RNA, que apresenta

uma hidroxila nessa posio) ebases nitrogenadas que podem ser adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). A e G tm estrutura de dois anis, caracterstica de um tipo de substncia chamada purina enquanto C e T tm a estrutura com somente um anel, caracterstica relacionada s pirimidinas. Na molcula de DNA h o pareamento de uma purina com uma pirimidina e esse pareamento complementar no ao acaso: A sempre pareia com T, atravs de duas pontes de hidrognio, e C sempre pareia com G, por trs pontes de hidrognio. Assim, a quantidade de A sempre igual a de T e a quantidade de C a mesma que a de G. No entanto, a quantidade de A + T no necessariamente igual C + G. Em adio, a quantidade total de nucleotdeos pirimidnicos (C + T) sempre igual quantidade total de nucleotdeos purnicos (A + G). As bases s podem parear dessa forma (A com T e C com G) apenas se as duas cadeias polinucleotdicas estiverem em posio antiparalela, ou seja, orientadas em polaridade oposta: a dupla hlice composta por dois filamentos lado a lado de nucleotdeos que so torcidos e mantidos unidos por pontes de

hidrognio entre as bases nitrogenadas que esto no interior da hlice (formando uma estrutura como uma escada em espiral) com acares e fosfatos voltados para o exterior. No arcabouo de cada filamento os nucleotdeos so ligados covalentemente por ligaes fosfodister que conecta o carbono 5 de uma desoxirribose ao carbono 3 do acar adjacente. Desse modo, cada ligao acar-fosfato dita como sendo de polaridade 5 para 3. Assim, a molcula bifilamentar de DNA caracteriza-se por dois arcabouos esto em orientao oposta, ou seja, em polaridade inversa. A

complementaridade de pareamento de bases permite que elas sejam compactadas em um arranjo mais favorvel energeticamente no interior da fita dupla e que cada molcula de DNA contenha uma sequncia de nucleotdeos que exatamente complementar sequncia nucleotdica da fita antiparalela. Portanto, a forma helicoidal do DNA depende do empilhamento das bases que confere estabilidade a molcula de DNA, excluindo molculas de gua dos espaos entre os pares de bases no interior da dupla hlice, e do pareamento das bases nos filamentos de polaridade inversa. 08: Assim, a duplicao semiconservativa representa o fenmeno resultante da reproduo da molcula de DNA, em que uma das molculas recm-formadas conserva uma das cadeias, um dos filamentos de polinucleotdios, precedente da molcula me, produzindo uma nova cadeia complementar a que lhe serviu de molde. Para ocasio desse processo so rompidas as pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas complementares, separando os dois filamentos de DNA como se fosse um zper, a partir da ao mediada pela enzima DNApolimerase. Atravs desse mecanismo semiconservativo, foi e possvel a transmisso das caractersticas elementares do genoma de todas as espcies durante a evoluo da biodiversidade, cada qual em seu tempo, passando por transformaes selecionadas de gerao em gerao. 09 : Em 1963 John Cairns por meio de auto-radiografia de bactrias, percebeu a existncia de um ponto inicial para a replicao, denominado Origem da replicao. Acreditava que a replicao era unidirecional. Cultivo de E. coli em meio contendo timidina (3H) > Se isolava o DNA, espalhava em emulso fotogrfica . Na origem se formam duas forquilhas de replicao: Estrutura da

oriC, o nico ponto de replicao em cromossomos circulares bacterianos. Dando origem a forquilha de replicao: Regio do DNA onde ocorre a transio do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas. O cromossomo de E. coli contm, aparentemente, uma nica molcula de DNA, de mais ou menos 1 milmetro de comprimento [...]. , de longe, a maior molcula de que se tem conhecimento no sistema biolgico. A molcula contm duas cadeias polinucleotdicas que se separam na poca da duplicao. A molcula se duplica em um nico ponto que se desloca por todo o cromossomo. Nesse ponto, as duas novas cadeias esto sendo produzidas: duas cadeias vo se tornando quatro. Esse ponto veio a se chamar forquilha de replicao, por causa de sua forma.

10: DNA polimerase uma classe de enzimas, presente tanto em clulas procariticas como emeucariticas, responsvel pela polimerizao das novas fitas de DNA. A reao fundamental a transferncia de um grupo fosforila, onde a extremidade 3'-OH o nuclefilo e o fsforo da extremidade 5' do nucleotdeo que chega sofre ataque nucleoflico com liberao de pirofosfato inorgnico. Essas enzimas obedecem a algumas propriedades, como:

Todas as DNA polimerases requerem um molde. Pareamento complementar das fitas AT e GC. A polimerizao dever acontecer no sentido 5'- 3' O processo de polimerizao s ir iniciar-se com a presena de um oligonucleotdeo de RNA denominado RNA primer, pois a DNA polimerase s consegue agir na presena de extremidade 3' livre.

H trs tipos de enzimas catalticas de DNA polimerase:

DNA polimerase I, que tem funo corretora(de reparo do DNA), portanto pode ser endonuclesica ou exonuclesica. Ela tambm faz a retirada dos primers (iniciadores).

DNA polimerase II, que uma polimerase alternativa de reparo, mas que tambm pode replicar DNA quando o filamento molde danificado.

DNA polimerase III, responsvel por no deixar o molde antes de ter sido concludo o processo.

DNA polimerase pode adicionar nucleotdeos livres para s extremidade 3 'da fita recm-formando. Isso resulta em alongamento da nova vertente em uma direo 5'-3 '. DNA polimerase no sabe capaz de comear uma nova cadeia (''de novo''). DNA polimerase pode acrescentar um nucleotdeo em apenas um pr-existente do grupo 3'-OH, e, portanto, precisa de uma cartilha em que pode adicionar os nucleotdeos em primeiro lugar. Primers consiste de RNA e DNA bases com as duas primeiras bases sempre RNA ser, e so sintetizadas por outra enzima chamada primase. Uma enzima conhecida como uma helicase necessrio para descontrair DNA a partir de uma estrutura de dupla-fita para uma estrutura de fio nico para facilitar a reproduo de cada vertente consistente com o modelo semiconservativa da replicao do DNA. Correo de erros uma propriedade de alguns, mas nem todas as polimerases, DNA. Este processo corrige erros no DNA recm-sintetizada. Quando um par de base incorreta reconhecido, DNA polimerase inverte a direo por um par de bases de DNA. A 5'-3 'exonuclease atividade da enzima permite que o par de base incorreta para ser extirpado (esta atividade conhecido como''reviso''). Aps exciso de bases, a polimerase pode reinserir a base correta e replicao pode continuar