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PRODUO DE UMA RECOMBINANTE DA

ANEXINA HUMANA POR CULTIVO EM


BATELADA ALIMENTADA
Marder et al. BMC Biotechnology 2014
Brisa Bartellt e Vanessa Schmidt

Roteiro
Anexina V ou A5;
Apoptose;
Diagnstico clnico com ligao

de A5 em corpos apopttico;
Diagnstico in vivo;
O estudo;
Metodologias/Resultados;
Concluso

Anexina V (A5)
Protena anticoagulante encontrada na placenta humana, que

depende de clcio para ligar-se aos fosfolipdios;


Possui alta afinidade com fosfoatidilserina (fosfolipdio do folheto

interno da membrana plasmtica);


J com os FL do folheto externo (ex.: fosfatidilcolina e

esfingomielina) a capacidade de ligao reduzida.

Apoptose
A apoptose um processo de morte celular ativo, mas silencioso, que ocorre em

condies fisiolgicas, de resposta a uma variedade de estmulos fisiolgicos ou


patolgicos e em que a clula participa na sua prpria destruio. Normalmente,
como no h perda da integridade membranar, a apoptose no acompanhada
de reaces inflamatrias drsticas. (SOL, S. ; PEDRO, T. ; FERREIRA, H.;
RODRIGUES, C. M. P., 2001);
A exposio da fosfoatidilserina na superfcie do folheto externo da membrana

plasmtica facilita o reconhecimento de clulas fagocticas do sistema imune, e


uma caracterstica dos primeiros estgios do processo apopttico.
Esta

externalizao de fosfolipdios mediada pelas caspases (cysteinedependent aspartate-specific proteases)(GRIVICICH, I; REGNER, A; ROCHA,A. B.,
2007)

Diagnstico clnico com ligao de A5


em corpos apoptticos
A5 utilizada como um detector de clulas em apoptose, pois

possui afinidade de ligao com a FAS na ordem de nanomolarpicomolar;


Dois marcadores so ligados ao A5 e permitem diferenciar as

clulas quanto a sua integridade e estgio de apoptose;

Diagnsticos in vivo
Quando utiliza-se radionucleos como iodo-

123 (123I) e o istopo metastvel de


tecncio-99 (99mTc) para marcar a
protena A5, permite-se avanos na rea
de pesquisa de apoptose por imagem na
medicina nuclear;
Aplica-se muito na deteco de progresso

ou regresso de carcinomas.

O estudo
Almeja o desenvolvimento de um processo eficiente e de alto

rendimento para a produo, em cultivos em biorreator e posterior


purificao da protena recombinante Anexina V humana com alto
grau de pureza, de modo a obter a matria-prima para a produo
de kits para deteco de apoptose tanto in vivo quanto in vitro.

Metodologia
Cepas e Plasmdeos
A E. coli BL21 ( DE3 ) e C41 (

DE3 ) foram adquiridos a


partir de Novagen (EMD
Biosciences , Inc. , Madison ,
WI , EUA ) e Lucigen
Corporation ( Middleton , WI ,
EUA ) , respectivamente .
O vetor de clonagem de PCR

- Blunt foi comprado de


Invitrogen ( Carlsbad , CA ,
EUA ) e pET - 30a ( + ) a
partir de vector de expresso
foi Novagen

Metodologia
Clonagem molecular de rhanxa5

Sequncia de codificao de ANXA5 humano na GenBank ( nmero de acesso :

NM_001154.3 )
National Institute of Health ( NIH).
NdeI ( primer direto : 5 ' GCG CAT ATG GCA CAG GTT CTC AGA GGC ACT 3')
HindIII ( iniciador reverso : 5 ' GCG AAG CTT TTA GTC ATC TTC TCC ACA GAG C 3').
A sequncia do gene ANXA5 humano foi amplificado partir de uma amostra de

sangue humano .
Clonagem em
pCRBlunt
Amplificao de
AXNA5 por PCR

Fonte: As autoras (2015)

Digesto com Nde I e Hind Confirmao da


III
clonagem por
Preparo do pET30a(+) com
sequenciamento DNA
as mesmas enzimas de
automtico
restrio

Metodologia
Sequenciamento automtico

Amaral et al. (2012)

Fonte: Amaral et al. (2012)

Metodologia
Preparo dos meios
LB caldo lisogenia

Nomenclatu
ra

SD semi definido

Nomenclatu
ra

Component
es

NaCl 0,5 g L-1(a);NH 4 Cl 1 g L-1


(b); Extracto de levedura 20 g L1(c); Na2HPO4 6 g L-1(d); KH2PO4
3 g L-1(e); Tiamina 1 mg L-1(f);
MgSO4 1 mM (g); soluo de
rastreio 0,1% (h); CaCl2 0,1 mM
(i).

Componente Triptona 10 g L-1;


Extrato de levedura 5 g L-1;
s

(a,b,c,d,e),
(g)
e
(i)
foram
esterilizados em autoclave (30 min
121C);
(f) Foi esterilizado por filtrao;
(h) FeSO4 (2,8 g L-1), MnCl2 (2 g L1), CaCl2 (2 g L-1), CuCl2 (0,26 g L-1)
Fonte: As autoras (2015)
e ZnSO4 (0,3 g L-1);
Tudo foi misturado em condies

Preparo

NaCl 10 g L-1.

Esterilizado em autoclave (30 min


121C)
Fonte: As autoras (2015)

Preparo

Cultura em
de de
agitao
Aplicao
Para a alimentao
debalo
meio
culturas

de bioreactor, meio SD foi suplementado


com glicose (concentrao final de 300 g
L-1) e MgSO4 (40 mM);
Canamicina (30 ug mL-1) foi adicionada

em ambos os meios;

Metodologia
Cultivo em balo de agitao

As cepas transformadas com pET30a(+) ou com pET30a(+)::AXNA5 (ambas por

eletroporao) foram selecionadas por placas de canamicina (30 ug mL-1);


Incubao de pr-inculo overnight (37C ;180rpm) em 5 ml LB+canamicina;
Incubao em diferentes meios (LB ou SD) para determinar o perfil de expresso

condies (50 ml; 37C; 180 rpm) atingir OD(600nm) = 0,4-0,6;


A expresso da protena recombinante solvel foi confirmada por 12% de dodecil

sulfato de sdio-electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), visualizadas


por colorao com Coomassie Brilliant Blue R-250.

Metodologia
SDS-PAGE
Quando necessita-se separar as protenas somente por tamanho,
utiliza-se a tcnica de SDS-PAGE (SDS Polyacrylamide Gel
Electrophoresis). O SDS um detergente aninico forte, que se liga
resduos positivamente
carregados
conferindopor
s
Aaos
eletroforese
uma tcnica
analtica das
queprotenas,
separa molculas
mesmas
uma carga final negativa e ocasionando a desnaturao.
carga
e tamanho.
Na eletroforese de protenas utiliza-se o gel de poliacrilamida, o qual

formado pela co-polimerizao de acrilamida e bisacrilamida,


constituindo-se em uma rede porosa, cujo dimetro dos poros
inversamente proporcional a concentrao de acrilamida.

Metodologia
SDS-page

Fonte:
http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp
?id=810

Resultado
Clonagem e expresso

Fonte:
http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp

Metodologia
Inoculo para biorreator
Clulas

transformadas de E. coli
BL21(DE3) que contm o plasmdeo
recombinante pET-30a(+)::ANXA5
foram estocadas em 50% de glicerol
a -80C.

Fonte: ca.vwr.com

Para o desenvolvimento do pr-inculo


foram cultivadas overnigth 150L de
clulas.
A densidade ptica final (OD600 ) do
pr-inculo
foi
medida
por
espectrofotometria.
Quando a cultura atingiu OD600 , diluise em meio LB at um volume total
de 100 mL, para posterior inoculao

Metodologia
Espectrofotometria
Espectrofotometria Medida da absoro ou transmisso de luz.
Quando um feixe de luz monocromtica atravessa uma soluo com molculas

absorventes, parte da luz absorvida pela soluo e o restante transmitido. A


absoro de luz depende basicamente da concentrao das molculas
absorventes e da espessura da soluo caminho ptico.

Fonte: www.ebah.com.br

Metodologia
Cultivo em biorreator


Fonte: www.sartorius.com

Metodologia
Mtodos analticos
O crescimento celular foi monitorado medindo-se densidade a ptica a 600

nm (OD600 ). Para esta OD achou-se um equivalente de 0.3342 g/L de peso


celular por quantificao gravimtrica.
A concentrao de glicose foi medida atravs de um analisador de
glicose.
A concentrao de Acetato foi determinada por cromatografia de alta
performance - HPLC (0.005 M H2SO4 como fase mvel e detector UV).
A expresso de protenas foi analisada usando SDS-PAGE corada com
Coomassie Brilliant Blue R-250.
A produo da protena annexin V foi quantificada utilizando-se o Qubit
Protein Assay Kit e o Qubit 2.0 Fluorometer.

Metodologia
Gravimetria / anlise
de
glicose
Uma enzima especfica para

o
A anlise gravimtrica ou gravimetria,substrato de interesse imobilizada
duas
membranas:
um mtodo analtico quantitativoentre
cujo processo envolve a separao epolicarbonato e acetato de celulose.
O substrato oxidado quando
pesagem de um elemento ou um
composto do elemento na forma maispenetra na camada de enzima,
pura possvel.
produzindo perxido de hidrognio,
que passa atravs do acetato de
celulose a um elctrodo de platina,
onde o perxido de hidrognio
oxidado.
A corrente resultante proporcional
concentrao do substrato.
Fonte:

Metodologia
Cromatografia e HPLC

O objetivo da cromatografia separar individualmente os diversos constituintes


de uma mistura de substncias seja para identificao, quantificao ou obteno
da substncia pura para os mais diversos fins.

Tal separao d-se atravs da migrao da amostra atravs de uma fase


estacionria por intermdio de um fluido (fase mvel).

Aps a introduo da amostra no sistema cromatogrfico, os componentes da


amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais lentamente que a fase
mvel devido ao efeito retardante da fase estacionria.

O equilbrio de distribuio determina a velocidade com a qual cada componente


migra atravs do sistema.

Metodologia
Cromatografia e HPLC
A amostra dissolvida em um solvente e
introduzida
na
coluna
cromatogrfica
preenchida com a fase estacionria.
Um solvente bombeado com vazo constante
e desloca os componentes da mistura atravs
da coluna. Esses se distribuem entre as duas
fases de acordo com suas afinidades.
As substncias com maior afinidade com a fase
estacionria movem-se mais lentamente. J as
substncias com pouca afinidade com a
movem-se mais rapidamente.
Ao sair da coluna, os componentes passam por
um detector que emite um sinal eltrico o qual
registrado, constituindo um cromatograma.

Fonte: waters.com/waters/nav.htm?
cid=10049055

Metodologia
Quantificao da produo de protena
Qubit Protein Assay Kit
Quantificao de DNA, RNA e protenas.
Dilui-se o corante no buffer fornecido e
adiciona-se a amostra. O resultado
fornecido pelo leitor.

Qubit 2.0 Fluorometer.

Baseado na deteco de uma regio


especfica
marcada
com
fluorescncia.

Fonte: www.lifetecnologies.com
Fonte: www.b2b.invitrogen.com

Resultados
Mtodos analticos
Com 4 horas de cultivo, verificou-se que a glicose era totalmente consumida, o que
indica que este o tempo em que se deve iniciar a alimentao do biorreator.
Depois de 4 horas de batelada sem alimentao a concentrao de biomassa
alcanada foi de 4.71 g/L.
Com a induo do perfil linear de alimentao obteve-se uma concentrao de
biomassa de 26.01 g/L.
Foi induzida a expresso de rhANXA5 com a adio de IPTG. A mdia obtida foi de
28.48 g/L de concentrao de biomassa e 4.8 g/L de concentrao de protenas.
A mdia obtida no cultivo em Shaker foi de 0.615 g/L aps 6 horas de cultivo.

Figura 1 : Anlise SDS-PAGE de expresso rhANXA5 em cultivos fed-batch.


E. coli recombinante BL21 (DE3) clulas foram cultivadas em meio semi-definido (SD)
durante 30 h em culturas fed-batch. Alimentao iniciada 4 horas aps o incio do cultivo
em lotes e rhANXA5 expresso foi induzida aps 18 horas de cultura atravs da adio
de IPTG 1 mM e marcador;
Pista 1: amostra recolhida imediatamente antes da induo IPTG (18 h de cultura);
pistas 2-7: amostras recolhidas aps induo de IPTG a partir de 20 h (pista 2), 22 h
(pista 3), 24 h (pista 4), 26 h (pista 5), 28 h (faixa 6), e 30 h (pista 7).

Resultados
Mtodos analticos
Em um biorreator independente foram realizadas densitometrias
das culturas para quantificar a rendimento da produo, o
rendimento especfico e a produtividade de rhANXA5. Os resultados
obtidos foram 1.95 g/L, 0.0715 e 0.065 g/L respectivamente.
Para o todo o procedimento (30 horas), desde o cultivo em
biorreator at a purificao, obtiveram-se 28.5 mg de rhANXA5
purificado (ou 0.983 g/L) e 0.0361 g/L de rhANXA produtivo.

Metodologia
Purificao
ANXA5 protena recombinante foi purificada utilizando uma
cromatografia FPLC - sistema KTA (GE Healthcare ).
Monitoramento por deteco UV a 215, 254 e 280 nm e as fraces
foram analisadas por 12% SDS-PAGE.
Clulas congeladas (3 g) foram suspensas em 30 mL de tampo A
(Tris HCl (50 mM ); CaCl2 (10 mM); pH 7,2) e incubadas com fenil
fluoreto de metanossulfonilo (1 mM) durante 30 min a 4 C.
As clulas foram rompidas por sonicao e centrifugado a
38.900rpm durante 30 min. O sobrenadante foi rejeitado e o
sedimento foi completamente dissolvido em 30 mL de tampo B
(Tris HCl (50 mM); EDTA (20 mM) pH 7,2), agitou-se durante 30 min
a 4 C, e clarificada por centrifugao a 38.900rpm durante 30 min
a 4 C.

Metodologia
Purificao
O sobrenadante foi dializado contra 20 mM Tris-HCl pH 8,0
Precipitado residual foi removido por centrifugao e o sobrenadante
foi carregado numa MonoQ HR 16/10 coluna de permuta aninica,
previamente equilibrada com 20 mM de Tris HCl pH 8,0.
A protena foi eluda com 25% de gradiente linear de 20 mM de Tris
HCl, 1 M de NaCl pH 8,0 a 1 mL min-1 Caudal.
RhANXA5 homognea foi eluida a aproximadamente NaCl 190 mM.
As fraes contendo rhANXA5 homognea foram reunidas, dialisadas
contra 20 mM de N-2-hydroxy ethyl piperazyne -N'-2-etanossulfnico
(HEPES), 100 mM de NaCl, pH 7,2 e concentrado usando uma
AMICON (Millipore Corporation, Bedford, MA, EUA) ultra- membrana
de filtrao (MWCO = 10 kDa), e armazenadas a -80 C.
A concentrao de protena foi determinada com Qubit Protein

Resultado
Purificao

Figura 2: A anlise de SDS-PAGE de passos de purificao rhANXA5. SDS-PAGE (12%) Anlise de


fraces de diferentes passos de purificao rhANXA5. Cada amostra contm pista 8 ug de protena
total. M corresponde a Thermo Scientific Protein no corado Marcador PM; Pista 1: as clulas em
suspenso em tampo A (50 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 10 mMCaCl2) sem passo de centrifugao
anterior; pista 2: sobrenadante de clulas em tampo A, aps sonicao e centrifugao (durante 20
min, 24,400 x g, 4 C); pista 3: pelete de clulas a partir da centrifugao anterior suspensas em
tampo B (50 mM de Tris-HCl, pH 7,2, EDTA 20 mM); Lane4: suspenso a partir do passo anterior
dialisado contra 2 L de 20 mMTris-HCl, pH 8,0 por 3 vezes, durante a noite, no primeiro passo, seguido

Metodologia
Identificao de rhANXA5 por espectrometria de massa
Os preparados de rhANXA5 (1 nmol)
foram dessalinizados e submetidos a
degradao
proteoltica
usando
tripsina.
Os peptdeos resultantes foram
separados por cromatografia capilar,
usando uma coluna de 15 cm.
Os
peptdeos
separados
foram
analisados usando um espectrmetro
de massa hbrido LTQ-Orbitrap.

Fonte:
www.analticaweb.com.br

Metodologia
Identificao de rhANXA5 por espectrometria de massa

Foram realizadas fragmentaes MS/MS usando dissociao


induzida por coliso (CID). Os espectros das amostras MS e
MS2 foram comparados in silico com a tripsina digestiva
humana.
Um total de 320 espectros foram identificados com 29
diferentes peptdeos derivados da protena rhANXA5. Estes
peptdeos cobrem 80% da sequncia rhANXA5.

Metodologia
Determinao da massa molecular
Purificada rhANXA5 amostras foram dessalinizadas , reconstituda em acetonitrilo 50
% / MilliQ - gua 49 % / cido frmico a 1 % e directamente injectada utilizando uma
seringa de 500 uL ( Hamilton Company , Reno , NV , EUA) num modo esttico numa
fonte inica de electrospray IonMax .
Os parmetros de fonte de electropulverizao foram como se segue : modo de io
positivo , 4,5 kV de tenso aplicada fonte de electrospray , 5 unidades arbitrrias
(variao 0-100 ) de fluxo de gs bainha , 45,6 V de tenso capilar , 250 C de
temperatura capilar , e 238,8 V de tenso de tubo de lente .
Espectros completa (600-2000 m / intervalo z) foram coletados em um Thermo
Orbitrap Descoberta XL no modo de perfil usando o analisador ion trap linear (modo
ITMS ) . O espectro mdio foi processado com o software MagTran [25] para a carga
deconvolution estado.

Resultado
Determinao da massa molecular

Figura 3: Determinao da massa molecular rhANXA5 por espectrometria de massa. a) espectros ESI-EMTF de
rhANXA5 mostrando a distribuio estado de carga.B) valor determinado experimentalmente de 35804 da para a
massa molecular mdia rhANXA5 aps espectros.

Metodologia
FITC-anexina V
Para confirmar a capacidade de detectar clulas que

sofrem apoptose, rhANXA5 foi marcado com Fluoro


Tag FITC Conjugation Kit.
Clulas de melanoma B16F10 foram cultivadas em
meio DMEM.
Para induzir a apoptose as clulas foram tratadas
com cisplatina em diferentes concentraes (0, 40,
80 e 160 g/mL) e depois de 6 e 12 horas as
clulas foram coradas com um home-made kit e
um kit comercial da BD Biosciences.
Todos os dados foram coletados em um Citmetro
de fluxo FACS Canto II e analisados usando o
software FlowJo.
Clulas + 5 L de corante no-vital PI + (5 L de
rhANXA5 conjugado com FITC home-made kit ou
com 5 L de rhANXA5 conjugado com FITC
comercial)

Fonte: lamed.ccb.usp.br

Citometria de Fluxo
A Citometria de Fluxo uma tecnologia rpida e precisa que mede e
analisa as propriedades pticas de um grande nmero de clulas ou
partculas separadamente. necessrio que as amostras a serem
testadas estejam em suspenso.
As amostras sero analisadas atravs da marcao por
imunofluorescncia com diferentes fluorocromos, os quais sero
excitados pelo laser.
O uso de fluorocromos com caractersticas diferentes de
fluorescncia, vrios lasers e vrios fotodetectores permite aos
citmetros de fluxo medir muitas caractersticas de cada partcula
simultaneamente, como dimetro celular, estruturas granulares no
interior das clulas e intensidade de fluorescncia.

Concluses
Cultivos em batelada alimentada representam uma alternativa para cultivos em
Shaker, permitindo o controle das variveis do processo, melhoria na concentrao
de biomassa e rendimento do produto.
Neste trabalho foram produzidas 28.5 mg de anexina V recombinante purificada,
obtida em 3 g de clulas hidratadas cultivadas em batelada alimentada.
A utilizao do marcador fluorescente para marcar anexina V e assim identificar as
clulas em apoptose est atualmente limitado a estudos histolgicos de triagem de
clulas realizados in vitro. A sua utilizao para exames de imagem in vivo
dificultada principalmente por questes de custo. Assim, a produo em larga
escala poder ampliar a utilidade comercial para rhANXA5, reduzindo custos e
permitindo um maior acesso as comunidades cientfica e mdica para este produto.

Referncias
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Eletroforese em gel de poliacrilamida. Disponvel em: < http://biologia.ifsc.usp.br/biomolcel1/roteiros/roteiro08.pdf > . Acesso em:
2015.
SDS-page. Disponvel em: < http://projectsday.hci.edu.sg/2011/15-FinalsWeb/Cat-01/1-084/exp.html > . Acesso em: 2015.
Cromatografia de alta performance HPLC. Disponvel em: < http://www.crq4.org.br/sms/files/file/conceitos_hplc_2010.pdf >. Acesso
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