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Trabalho de Laboratrio I Titulao e verificao da capacidade tampo de aminocidos e da saliva Introduo terica O conhecimento das propriedades cido-base dos

os aminocidos muito importante para a anlise e compreenso das propriedades das protenas. Todos os aminocidos so anflitos, ou seja, tm um grupo funcional cido (carboxilo), e um grupo funcional bsico (-amino). Alm destes, alguns aminocidos podem ter ainda outros grupos ionizveis. O grau de protonao dos grupos ionizveis e a carga que iro apresentar funo do pH do meio envolvente, o que torna o pH to importante em sistemas biolgicos. Os grupos ionizveis actuam como cidos ou bases fracas cedendo ou ligando protes quando o pH alterado. O resultado do seguimento da variao de pH em todos os equilbrios cido-base pode ser previsto atravs da equao de Henderson-Hasselbalch (permite relacionar o valor de Ka de um cido fraco com o pH da soluo que contm o cido e a sua base conjugada).

Esta equao usada para prever as propriedades das solues tampo utilizadas para controlar o pH de misturas reaccionais. Ka a constante de ionizao. Quando a [forma no protonada] = [forma protonada], o pKa = pH. (pKa uma medida numrica da fora de um cido) A alanina tem dois grupos ionizveis, o grupo carboxilo com pKa = 2,3 e o grupo amina com pKa = 9,7. Em pH muito baixo (<1), a alanina existe na forma totalmente protonada, ou seja com o grupo carboxilo totalmente protonado (COOH) e o grupo amina protonado (NH3+), isto significa que pode doar dois protes durante a sua titulao.

Meio cido

Meio bsico A+ Forma isoelctrica pKa1 Regio de tamponamento devida ao grupo COOH. pKa2 Regio de tamponamento devida ao grupo NH2. pKa1(a-carboxilo) = 2,3 pKa2(a-amina) = 9,7 A-

Cada grupo teve de titular uma soluo de alanina que inicialmente se encontrava na forma protonada.

Ponto isoelctrico Valor de pH ao qual o somatrio de todas as cargas dos grupos ionizveis existentes na molcula zero. Nos aminocidos igual a metade da soma dos dois valores de pK que constituem a fronteira da forma neutra (switerinica). Capacidade tampo de fluidos biolgicos: Fluidos biolgicos So sistemas tampo. No ocorrem variaes superiores a 0,2. No sangue, com m pH de 7.4, o sistema tampo baseia-se na protlise do cido carbnico. Soluo tampo Mistura de um cido ou base fracos, com os seus conjugados e tm a propriedade de resistir variao de pH, quando lhe adicionada uma quantidade moderada de um cido ou uma base fortes. Est presente num sistema tampo. gua Influencia todas as interaces de sistemas biolgicos; uma molecular polar, cm uma distribuio assimtrica de carga; possui molculas com grande afinidade umas pelas outras. Grau de dissociao Depende da afinidade do anio pelo proto. Se as foras dipolares da gua, ao interactuarem com o anio ou com o catio, forem mais fortes que a interaco electrosttica entre o anio e o catio, haver um grau de dissociao elevado. Interaces entre biomolculas: Ligaes fortes Ligaes covalentes

Ligaes fracas Ligaes de Van der Waals; Interaces inicas; Ligaes de Hidrognio O conjunto de todas as ligaes d origem estrutura da biomolcula.

pKa o ponto em que [H+] e [OH-] so iguais e onde o valor de pKa numericamente igual ao valor de pH onde h um equilbrio cido-base. Alterao de pH a nvel celular: Acidose Sistema nervoso Coma em casos extremos (diabticos) Alcalose Diminuio da [] de protes Sistema nervoso instvel Convulses e violncia

Dentes Tecidos minerais e a saliva evita a desmineralizao e mineralizao dos dentes. Capacidade tampo da saliva A cavidade oral est sujeita a vrios estmulos exteriores que possuem a capacidade de alterar o pH para alm do pH crtico (pH abaixo do qual h risco de desmineralizao dentria). A saliva com os seus constituintes possui diversas funes, entre as quais encontra-se a capacidade tampo. o Sistemas tampo da saliva

Sistemas tampo Sistema bicarbonato o mais importante do organismo humano. Sistema aquoso que contm: o cido fraco: H2CO3 o Sal Bicarbonato NaHCO3

O sistema bicarbonato o mais importante porque o que est no sangue. o mais eficaz no caso de acidose.

Protena mais abundante no organismo Colagnio Protena mais abundante no sangue Albumina

Sistema Fosfato: Na2HPO4 2 Na+ + HPO42H2PO4- 2 H+ + PO43Implicaes de: Desequilbrio do sistema na presena de um cido de pKa baixo cido forte. Desequilbrio do sistema na presena de um cido de pKa alto cido fraco.

pKa baixo (cido forte, base fraca) HCl + Na2HPO4 NaH2PO4 + NaCl
Base fraca

pKa alto (cido fraco, base forte) NaOH + NaH2PO4 Na2HPO4 + H2O (SENTIDO DIRECTO) O sistema fosfato permite conservar as [] de protena, evitando a degenerescncia ao nvel celular. muito importante para a regulao intracelular.

Sistema Proteico: importante quer a nvel intra, quer a nvel extracelular. E organismos, dos mais importantes. Assegura a existncia de um pKa aproximadamente de 7.4 (a maioria dos P.I. das protenas salivares 7.0)

Diabtico Perodo prolongado de muito acar Hemoglobina glicolisada Hb + Glicose HbA (alterao da estrutura e funo das mesmas ao fim de 120 dias desaparecerem) O H+ est presente em todos os sistemas tampo. Protocolo e concluses Titulao da alanina

o o o

No ponto isoelctrico, a [alanina] = [NaOH]. Este aminocido pode ser utilizado eficazmente como tampo numa gama de pH de aproximadamente 2,63 a 4,63 e 8,74 a 10,74 (diferena de 2 valores). Nas zonas de tampo, a variao de pH menos evidente com a adio da base NaOH.

Equivalente base terico aos 5ml

pKa 1 = 2,3 pKa 2 = 9,7 Verificao da capacidade tampo da saliva

Os valores de pH na saliva no variam muito, pois temos vrios sistemas tampo a actuar.

Trabalho de Laboratrio II Quantificao Proteica por espectrofotometria utilizando uma curva de calibrao Introduo terica A espectrofotometria til na identificao de compostos biolgicos que absorvem luz UV ou visvel.

Um espectro de absoro de luz de um dado composto pode ser obtido, medindo a absorvncia de uma soluo pura desse composto, numa gama de comprimentos de onda diferentes. A quantificao por espectrofotometria baseada na tcnica de Lambert-Beer que relaciona a absoro da luz com a concentrao do composto que absorve. o S vlida para zonas em que as concentraes sejam lineares. o Zonas com concentraes muito elevadas tm tendncia a ficar curvas, a lei no se aplica nessas zonas. As protenas ou pptidos com mais de duas ligaes peptdicas, reagem com o sulfato de cobre II em meio alcalino formando um complexo de cor azul violeta (absorve nos 550nm) cuja intensidade est relacionada com o nmero de ligaes peptdicas presentes na amostra. A absorvncia da amostra proporcional concentrao de protena presente, o que possibilita a utilizao da reaco para quantificao de protenas. O mtodo identificado como o teste do biureto (composto com analogia estrutural com uma dupla ligao peptdica) pois esta reaco anloga da complexao do cobre pelo biureto.

Protocolo e concluses Prepararam-se 6 solues de [] conhecida de BSA (albumina de soro bovino), a partir de uma soluo-me, a 10mg/ml Sabia-se a concentrao que se pretendia em cada uma das amostras, por isso foi necessrio calcular o volume de soluo de BSA de [] conhecida a colocar e o volume de gua destilada para perfazer os 10ml. Retirou-se ento 0,8ml de cada soluo padro e adicionou-se 3,2 ml do reagente de Biureto e deixou-se reagir 30min. Colocou-se em couvettes descartveis e leram-se as absorvncias no espectrofotmetro contra um comprimento de onda de 550nm. Traou-se depois uma recta de calibrao, sendo determinada a equao da recta e, a partir da, sabendo o valor da absorvncia da soluo desconhecida, obtm-se o valor de concentrao por substituio das variveis. o Recta obtida y=0,0546x 0,0026 o A absorvncia registada foi de 0,385, logo y=0,385. Por substituio tem-se que x = 7,099mg/ml (por converso 1,044 x 10-4 mol/L (sabendo o M(albumina) = 68000g/mol, podemos calcular o n = 1,044 x 10-7 mol) o Assim, na frmula A=.b.c, sabemos que o A = 0,385, o b = 1cm, c = 1,044 x 10 4 mol/L. o O calculado 2992 M-1cm-1. A recta de calibrao tem as absorvncias no eixo yy e a concentrao no eixo xx.

Trabalho de Laboratrio III Digesto oral dos glcidos: a hidrlise do glicognio Introduo terica Glcidos consumidos o H glcidos, na dieta, que no so digerveis. o As ligaes -1,4 destas molculas tornam-nas resistentes aco das enzimas glicolticas do tubo digestivo. o As bactrias existentes no clon conseguem quebrar algumas destas ligaes, originando cidos gordos de cadeia curta, que so rapidamente absorvidos. Glcidos Digesto oral o A digesto de glcidos inicia-se na cavidade oral. o -amilase Peso Molecular de 52500 dalton, pH ptimo prximo de 7. Inactivada pelo ambiente cido do estmago (pH=2) Persiste alguma actividade dentro do bolo alimentar. Cliva as ligaes -1,4 do amido e do glicognio. o Produtos da digesto bucal Oligossacridos lineares de cadeia curta (maltose e maltotriose) Ramificadas incapacidade de hidrlise das ligaes -1,6 de amilopectina, por parte da amilase. Os organismos vivos armazenam hidratos de carbono que actuam como material de reserva. o Armazenados na forma de polissacridos (glicognio em animais e amido e inulina em plantas). Glicognio o Tem propriedades fsicas e qumicas que diferem dos hidratos de carbono mais simples. o Tem uma estrutura ramificada com cadeias lineares de resduos de glucose, ligadas por ligaes glicosdicas -1,4 e -1,6, nos pontos de ramificao. o Tem uma estrutura com um acar terminal redutor e uma srie de acares terminais no redutores, muito importante para a rpida mobilizao desta reserva. -amilase salivar o Enzima muito eficiente o Catalisa a hidrlise das ligaes -1,4 glicosdicas internas, em polmeros de glucose. o produzida nas glndulas salivares e actua na boca. o Tem um pH ptimo prximo de 7 o inactivada quando chega ao estmago.

Cintica Pode ser qumica ou enzimtica

Cintica qumica Velocidade da reaco Relacionada com a energia necessria para que reagentes e produtos sejam interconvertveis. Factores que influenciam a velocidade das reaces qumicas: Temperatura Quanto mais alta a temperatura, mais rpida a reaco. Concentrao Quanto mais partculas existirem, maior a reaco. Enzimas Substncias que diminuem a energia de activao Tamanho das partculas As partculas mais pequenas movem-se mais rapidamente que as partculas maiores.

Catalisador Baixa a barreira de energia para a reaco, permitindo que uma fraco maior de molculas tenha energia suficiente para atingir o estado de transio e, consequentemente, aumenta a velocidade da reaco, em ambos os sentidos. Enzimas: So biocatalisadores. Apresentam uma estrutura maioritariamente proteica. Podem ser isoenzimas Enzimas fisicamente distintas, mas com funes catalticas idnticas. Localizadas em estruturas sub-celulares, relacionadas com a funo que exercem.

Catlise enzimtica A reaco inicia-se com a ligao da enzima ao substrato, formando o complexo enzima-substrato. o Especificidade O centro activo tem uma tolerncia muito pequena Caso aceite um dos ismeros do substrato Estereoespecificidade. Factores que afectam a velocidade de reaco catalisada por enzimas: o Temperatura o pH o Concentrao de substrato e de enzima E + S ES E + P

Equao de Michaelis-Menten

Protocolo e concluses Demostrar a natureza polissacrida do glicognio. Demonstrar a diferena da aco cataltica cida e enzimtica, pelo aparecimento de glucose (acar redutor), durante a reaco de hidrlise, bem como a sua especificidade.

A hidrlise pode ser seguida medindo o aumento da [] dos acares redutores, atravs de uma reaco colorimtrica, usando para isso a reduo do reagente 3,5dinitrosalicilato. Este aparecimento de cor pode ser seguido a 540nm. Amarelo claro (reduo) Alaranjado

Hidrlise cida Dissolveram-se 24mg de glicognio em 3ml de gua. (c=8mg/ml) Distribuiu-se 0,4ml de soluo por todos os tubos, excepto no 1 onde se ps gua. Comeou-se a reaco com 0,6ml de HCl (2N) a cada tubo. Registou-se o tempo e, adicionou-se de imediato 1ml de NaOH ao tubo 1 e 2 para parar a reaco e colocou-se os tubos 3 a 8 no banho a 95C. Em intervalos de 5 minutos retirou-se 1 a 1 cada um dos tubos e parou-se a reaco com a mesma quantidade de NaOH. Depois da reaco ter terminado em todos os tubos, juntou-se 1ml de reagente de 3,5dinitrosalicilato a cada tubo e colocou-se no banho por mais 5 minutos, a 95C. Arrefeceu-se os tubos por imerso em gua fria. Adicionou-se 17ml de gua destilada a cada tubo vrtex couvette Leu-se a absorvncia a 540nm, usando o tubo 1 como branco.

Hidrlise enzimtica Dissolveu-se 24mg de glicognio em 3ml de soluo a pH2 e a pH7. Distribuiu-se 0,4ml em cada tubo, excepto no 1 que contm a soluo tampo. Recolheu-se saliva e fez-se a diluio da mesma, adicionando 0,5ml de saliva a 19,5ml de soluo-tampo. Para comear a reaco adicionou-se 0,5ml de saliva diluda a cada um dos tubos e registou-se o tempo. Adicionou-se de imediato, 1ml de reagente 3,5-dinitrosalicilato aos tubos 1 e 2, para parar a reaco e colocou-se os outros tubos (3-8) num banho a 37C. Em intervalos de 2 minutos retirou-se cada tubo e parou-se a reaco. No final, colocou-se, durante 5 minutos, os tubos num banho a 95C e depois foram arrefecidos por imerso em gua fria. Adicionou-se 18,1ml de gua a cada tubo vrtex couvette Leu-se a absorvncia a 540nm usando o tubo 1 como branco.

Hidrlise do glicognio Aumento da [] dos acares redutores. O valor de mximo de absorvncia lido na experincia corresponde concentrao mxima de glucose verificada. Assim, corresponde tambm aos 100% de glicognio hidrolisado. Com isto, podemos calcular a percentagem de glicognio hidrolisado nos outros tubos. H maior % de glicognio hidrolisado num menor espao de tempo com enzima amilase num meio com pH=7. Ao nvel da -amilase em pH=2, verifica-se muito pouco a ocorrncia de hidrlise, embora a temperatura de aco fosse ptima (alterao da conformao [reversvel ou irreversvel]).

Com o HCl, a hidrlise ocorre na totalidade (em relao ao tempo de hidrlise considerado). No entanto, a reaco mais demorada do que a reaco num meio a pH=7 com a -amilase salivar. O HCl quebra todas as ligaes, enquanto que a enzima especfica para as ligaes 1,4, da quebrar menos que o cido. No entanto, o corante no permite demonstrar isso, j que detecta unidades isoladas que so mais rapidamente obtidas com a enzima que quebra uma ligao especfica. Hidrlise com HCl banho de 95C Aumento da energia cintica Fcil quebra de ligaes. Enzimas: Diminuem a energia de activao necessria Catalisadores biolgicos Especificidade (centro activo) So mais eficientes que os catalisadores inorgnicos. Tm condies ptimas de aco (T e pH).

Trabalho de Laboratrio IV Dilise Introduo terica A dilise uma tcnica clssica para separar macromolculas de outros componentes de baixo peso molecular presentes numa soluo. Uma mistura de protenas e pequenos solutos pode ser separada por dilise atravs de uma membrana semipermevel. As pequenas molculas passam atravs da membrana enquanto que as pequenas ficam retidas. Na prtica, uma mistura de molculas grandes (ex. protenas) e pequenas colocada num saco de dilise sendo posteriormente imerso num grande volume de solvente aquoso (soluo de EDTA, NaCl ou mesmo gua destilada). A membrana de dilise contm poros que permitem a passagem de molculas de gua e de pequenos solutos at que o equilbrio seja atingido, mas no permite a passagem de grandes molculas. A separao realizada pela dimenso dos poros da membrana de dilise. A maioria das membranas de dilise no permite a passagem de molculas com um peso molecular superior a 5kD. A eficincia da tcnica depende do poro da membrana, da temperatura, da presso e da natureza do solvente. Existem membranas com limites de permeabilidade bem definidos e de um modo geral a taxa de dilise maior em gua destilada. No entanto, por vezes necessria uma soluo aquosa com pH e fora inica definidos para estabilizar as molculas em estudo.

Protocolo e concluses

Mistura de protena (albumina) e cloreto de sdio submetida a dilise. O cloreto de sdio atravessa facilmente a membrana, o mesmo no acontecendo com a protena.

Teste de deteco da albumina Teste do Biureto (detecta as ligaes peptdicas. O sulfato de cobre alcalino reage com compostos das ligaes peptdicas originando um complexo violeta) Teste de deteco do Cloreto de Sdio Teste do Nitrato de Prata (Observa-se a formao de um precipitado branco, cloreto de prata). O saco de dilise foi previamente preparado fervendo-se previamente durante 15 minutos numa soluo de EDTA 2mM. A experincia consiste em: Saco A 10ml de Albumina a 1% com 2,5ml de cloreto de sdio 5M. Saco B 10ml de Albumina a 1% e 2,5ml de gua destilada. Submergir os dois sacos de dilise em gua destilada. Tirar amostras da gua exterior aos 15 minutos (1A, 2A, 1B, 2B) e aos 30 minutos (3A, 4A, 3B, 4B) e no final tirar amostra de dentro dos sacos de dilise (5A, 6A, 5B, 6B).

Tubo

Teste do Biureto Azul-claro (ausncia)

Teste AgNO3 Transparente (ausncia)

H20

A albumina no sai do saco de dilise porque tem dimenses superiores aos poros da membrana. As substncias saem de dentro do saco por gradientes de concentrao que se estabelecem entre o meio interior e exterior. Quando a concentrao igual dentro e fora da membrana, a reaco atinge o equilbrio. Nesta altura, para continuar a purificar o contedo que se pretende, muda-se a gua que envolve a membrana, de forma a aumentar o gradiente. A velocidade da reaco tanto maior, quanto maior for o gradiente.

Trabalho de Laboratrio V Caracterizao cintica da enzima fosfatase cida Introduo terica Enzima fosfatase cida (ortofosforico-monoster fosfohidrolase cida) uma enzima pouco especfica. Catalisa a hidrlise de uma grande variedade de monosteres de fosfato, em condies cidas, fosfato inorgnico. O pH ptimo volta de 5. Est normalmente presente, em pequenas quantidades, no sangue e em vrios tecidos como o fgado, bao, medula ssea, rins e, principalmente, na prstata. Clinicamente, a isoenzima prosttica a de maior interesse, pois tem sido usada como marcador tumoral no diagnstico do cancro da prstata. Neste estudo da actividade desta enzima, utiliza-se um substrato artificial, o pnitrofenilfosfato, que convertido pela enzima em p-nitrofeno e fosfato inorgnico. Em meio bsico, o p-nitrofenol origina o io p-nitrofenolato, que apresenta uma cor amarela (405nm), permitindo assim a quantificao do produto formado por espectrofotometria e, consequentemente, o estudo da actividade da enzima. Para determinar as velocidades da reaco, mais vantajoso utilizar um ensaio em contnuo, isto , determinar a formao de produto ao longo do tempo, pois isso permite verificar a linearidade da resposta obtida. Para maior simplicidade, muito frequente serem usados ensaios com uma medida nica a um tempo de reaco fixo.

Neste tipo de estudo, as variveis analisadas so: [] de substrato [] da enzima [] de cofactores pH

Temperatura [] de inibidores

Objectivos: Verificar a variao de velocidade da reaco em funo da [] de substrato, quer na presena, quer na ausncia de inibidor. Classificar quanto ao tipo de inibio e estabelecer uma comparao entre os inibidores NaF e Na2AsO4.

Protocolo e concluses Variao da velocidade em funo da [] de substrato 1 - Prepararam-se 8 solues com PNPP a 9mM, excepto a 1 para ser usado como branco, com soluo tampo e gua destilada. 2 - Iniciaram-se as reaces, em intervalos de 1 minuto, adicionando 0,5ml da soluo de fosfatase cida a cada tubo vrtex banho a 37C. 3 - Aps 15 minutos de ter adicionado a enzima ao tubo 1, retirou-se do banho e parou-se a reaco adicionando 5ml de NaOH 0,1M vortex e fez-se o mesmo para todos os tubos de forma a estarem 15 minutos no banho couvettes absorvncia a 405nm usando 1 como branco. Inibio competitiva e no competitiva 1 - Prepararam-se 8 tubos com PNPP a 9mM, excepto o primeiro, com soluo tampo e inibidor (NaF ou Na2AsO4) e gua destilada. 2 - Iniciou-se a reaco em intervalos de tempo de 1 minuto, adicionando 0,5ml da soluo de fosfatase cida a cada tubo (= ao de cima) Resultados: Converte-se os valores de absorvncia das duas 2 experincias em [] molares de PNPP, usando a lei de Lambert-Beer, com =1,88 x 10-4mol-1cm-1. Calcula-se a velocidade da reaco para cada valor de [] de substrato PNPP. Representa-se graficamente as curvas da velocidade da reaco, em funo da [] de substrato, na ausncia e na presena de inibidor. Determinou-se o valor de Km e Vmx, na ausncia e na presena de inibidor. Inferir sobre os dois tipos de inibidores.

Cintica das reaces catalisadas por enzimas (modelo de Michaelis-Menten)

So consideradas apenas velocidades iniciais (praticamente no varia [S]).

[ES] est em estado estacionrio E reagiu com S e S ainda mais do que E e K2 < K-1. Em condies de saturao (excesso de substrato), toda a enzima se encontra na forma de ES e, nestas condies, a velocidade de formao de produtos mxima. Vmax= K2[ES] Formao de ES V=K1.[E].[S] Quebra de ES em E e S V = K-1.[ES] Quebra de ES em E e P V = K2.[ES] Equao de Michaelis-Menten (Equao de uma hiprbole) Km: Vmax: Depende da concentrao de enzima. constante e, quando < o Km, a enzima precisa de mais substrato para atingir a velocidade mxima. Define a afinidade da enzima para o substrato (Km pequeno grande afinidade). caracterstico de uma reaco entre 1 dada enzima e 1 dado substrato.

Km e Vmax podem ser influenciados por parmetros como o pH e a temperatura. Para obter a linearizao da lei, basta fazer o inverso da hiprbole, que uma recta, e obtemos a linearizao de Lineweaver-Burk, em que y (1/v) = m(Km/Vmax) . x (1/[S]) + b (1/Vmax) Inibio reversvel: Competitiva o Anlogos estruturais do substrato que competem com este para a ligao ao centro activo. o possvel superar esta inibio adicionando mais substrato. o No afecta a Vmx. No competitiva o Inibidores que se ligam enzima em locais distintos diferentes de onde se liga o substrato, logo no competem com este. o No atinge a mesma velocidade mxima, mesmo que se aumente s [S]. o O Km vai ser igual, porque o inibidor no vai impedir a ligao do substrato enzima, mas a velocidade mxima vai ser muito pequena.

No trabalho prtico era pedido para determinar os valores de absorvncia e depois calcular as concentraes molares de PPNP. A=.b.c se a absorvncia lida fosse 0,219, substitua-se o A, depois o b por 1, o por 1,88x104M-1cm-1 e obtm-se a concentrao (neste caso c = 1,16 x 10-5M = 11,6M)

Depois fazia-se igual para todas as absorvncias com e sem inibidor. Depois, procedia-se ao clculo da velocidade, para cada valor de concentrao.

Sendo que o tempo so 15 minutos ou 900 segundos. Para aplicar a equao de Michaelis-Menten foi necessrio calcular a concentrao de substrato PNPP em mol. Exemplo tubo 2 CaVa=CbVb 9mM . 0,025ml (usado p/ fazer a soluo) = Cf . 4,005ml Cf=0,056mM Fez-se o mesmo para os restantes tubos e ficou-se assim com a [S]. Traou-se ento o grfico de Michaelis-Menten e pode-se verificar que: Deu-se um aumento brusco da velocidade no incio que depois suaviza. A curva sem inibidor a que apresenta 1 aumento mais acentuado. A velocidade de reaco com inibidor NaF superior velocidade da reaco com inibidor Na2AsO4. o A relao de Michaelis-Menten pode ser, algebricamente, transformada numa expresso linear, o que facilita a anlise e interpretao de grficos. Basta substituir ambos os lados da equao pelo seu inverso e tem-se a linearizao de Lineweaver-Burk.

Para se traar o grfico de Lineweaver-Burk. Calculou-se o inverso de [S] e o inverso da velocidade, para todos os tubos. Assim, podemos calcular o valor de Km e de Vmx. Y(1/v)=m(Km/Vmax) . x(1/[S]) + b(1/Vmx). Os valores de Km das solues sem inibidor e com inibidor NaF so iguais. Com o aumento de [S], a velocidade da reaco catalisada tambm aumeta, at ao momento em que os centros activos ficam todos preenchidos. A utilizao de inibidores vai afectar a reaco, inibindo a velocidade da mesma. Inibidor NaF no competitivo, pois possui um Km semelhante ao da soluo sem inibidor e uma Vmax inferior do sem inibidor. (liga-se ao centro alostrico, diminui a velocidade porque altera a conformao da protena) Inibidor Na2AsO4 um inibidor competitivo, pois o seu Km superior ao da soluo sem inibidor e as velocidades mximas so iguais. Este inibidor compete com o substrato pelo mesmo centro activo. A velocidade mxima normal pode ser atingida aumentando a concentrao de substrato.

Seminrio I Mtodos de Estudo de Protenas

Introduo terica Uma determina protena num fluido biolgico precisa de ser purificada antes de ser estudada ou utilizada. Estudar e trabalhar com protenas o Separar o Purificar o Quantificar o Caracterizar Peso Molecular Composio em aminocidos Sequncia Estrutura Funo

Purificao de protenas o Uma protena tem de ser isolada e purificada para que possa ser caracterizada quanto sua composio em aminocidos e outros: sequncia, estrutura tridimensional e funo. o Cada passo da purificao deve remover a maior parte das protenas presentes e reter a maior quantidade possvel de protena de interesse. o As protenas podem ser isoladas de um tecido animal ou de clulas microbiais. Abordagem geral quanto ao isolamento de protenas Homogeneizao do tecido e disrupo da membrana celular Libertao das protenas, organitos e agregados na soluo [EXTRACTO CELULAR]. Separao de organitos e/ou agregados moleculares para isolamento da fraco contendo a protena de interesse centrifugao diferencial

Tecido com clulas em suspenso

Ultra-sons (Extruso)

Detergente (Homogeneizador Potter)

Protenas isoladas

Aplicao clnica Os laboratrios clnicos utilizam a separao de protenas dos fluidos biolgicos no seu dia-a-dia de forma a diagnosticarem os pacientes, assim as protenas do plasma sanguneo so analisadas rotineiramente por electroforese de fase gel. Processos de separao Com base na concentrao salina a) Salting Out Adio de uma determinada concentrao de sais bivalentes (ex. sulfato de amnio) a uma soluo de uma mistura de protenas, que induz a

precipitao de algumas protenas ficando em soluo as protenas solveis para a concentrao de sal adicionado. normalmente o primeiro passo de purificao de protenas. Uma fraco de protenas que precipitam entre as duas concentraes de sal diferentes, podem ser utilizadas para posteriores purificaes. b) salting in algumas protenas requerem ies inorgnicos para serem solveis em gua. Uma dilise extensiva contra uma soluo com baixa concentrao salina pode induzir a precipitao de determinadas protenas numa mistura original. Com base na dimenso molecular a) Dilise Uma mistura de protenas e pequenos solutos pode ser separada por dilise atravs de uma membrana semipermevel. As pequenas molculas passam enquanto que as grandes ficam retidas. a. A soluo de protena introduzida num saco de celofane sendo posteriormente mergulhada numa soluo (EDTA, NaCl, gua destilada). A membrana de dilise contm poros que no permitem a passagem de molculas com um peso molecular superior a 5kD. b) Ultracentrifugao A centrifugao a grandes velocidades permite separar uma soluo de protenas em mltiplos componentes. a. Processo A velocidade a que uma protena sedimenta numa ultracentrifuga depende do seu tamanho e forma. Para protenas com uma forma semelhante, quanto maior o peso molecular mais rpida a sedimentao. b. As unidades em que se expressam os valores obtidos nos estudos de sedimentao so os Syedburg (S) que igual constante de sedimentao (s) vezes 1013. c) Filtrao em fase de gel (Cromatografia de excluso molecular) a. Processo A filtrao em gel utiliza colunas de polmeros de hidratos de carbono insolveis mas extremamente hidratados na forma de esferas porosas. As pequenas molculas entram nos poros no entanto as grandes molculas no entram nos poros. Desta forma, o volume de solvente disponvel (Vd) para as pequenas molculas superior ao volume disponvel para as grandes molculas, pelo que as pequenas passam pela coluna mais lentamente. b. A velocidade com que a molcula passa atravs de uma coluna dependente do seu tamanho e forma. c. Utilizao. A filtrao em gel utilizada na determinao do peso molecular de uma protena bem como na separao de protenas (o tipo de polmeros utilizados nas colunas variam conforme o tamanho das molculas que queremos separar). Com base na carga molecular a) Cromatografia de troca inica a. Descrio As protenas vo ligar-se resina de troca inica da coluna. A fora de ligao de uma protena resina depende da quantidade de resduos disponveis da protena para interactuarem com a resina de troca inica.

b. Processo Utiliza-se uma coluna de material de troca inica insolvel contendo grupos polianinicos ou policatinicos. A um pH apropriado os grupos polinicos agrupam-se a grupos com carga oposta s protenas por interaces inicas. i. A eluio das protenas da resina geralmente realizada por lavagem com solues salinas que quebram as interaces electrostticas das protenas com a resina de troca inica. ii. Se for aplicado um aumento gradual da concentrao de sal coluna, as protenas ligadas mais fracamente resina de troca inica so eluidas primeiro que as protenas fortemente ligadas coluna. b) HPLC High Performance Liquid Chromatography a. Descrio HPLC similar cromatografia de troca inica e a outros mtodos cromatogrficos nos quais as solues de protenas atravessam uma coluna de resinas especiais com resduos laterais, os quais interactuam ionicamente ou hidrofobicamente com as protenas. b. Processo O HPLC difere das cromatografias convencionais pelo facto de ser realizada a presses muito elevadas. Este tipo de cromatografia a alta presso um processo mais rpido e com melhor resoluo que as cromatografias a baixas presses. c) Electroforese a. Descrio Os mtodos que utilizam um campo elctrico de forma a induzir um movimento de qualquer molcula com carga so chamados de electroforese. b. Processo i. Num campo elctrico, as protenas migram numa direco determinada pela sua carga lquida da molcula. A carga lquida da protena determinada pela natureza dos grupos ionizveis e pelo pH da soluo. ii. Para cada protena, existe um valor de pH, chamado o ponto isoelctrico, no qual as protenas no tm carga lquida pelo que no se movem no campo elctrico. iii. Para valores de pH abaixo do ponto isoelctrico, a protena adquire carga positiva movendo-se para o plo negativo (ctodo). Para valores de pH acima do ponto isoelctrico o comportamento das protenas oposto. iv. A migrao das protenas num campo elctrico est relacionada com a sua razo carga/massa. c. Procedimentos electroforticos i. Electroforese em gel 1. Este tipo vulgarmente utilizado em laboratrios de anlise para separar as protenas do plasma com a finalidade de diagnosticar pacientes. A separao realizada aplicando um campo elctrico amostra a um determinado pH, de forma que as protenas so separadas de acordo com a sua relao carga/massa e forma.

ii. Refocagem isoelctrica 1. Na refocagem isoelctrica, cidos poliaminopolicarboxilicos com valores de pI conhecido so utilizadas para criar um gradiente de pH no campo elctrico. Uma protena migra para a parte do gradiente que tem o mesmo pI que a protena. Esta tcnica muito utilizada para separar protenas com pI muito prximo. iii. Electroforese de SDS gel de poliacrilamida 1. Procedimento realizado num gel de poliacrilamida na presena do detergente SDS e de um agente redutor. Separar com base no peso molecular das protenas. O SDS desnatura as protenas enquanto que o agente redutor quebra as pontes dissulfito. 2. Devido ao facto de o SDS formar micelas carregadas negativamente, o efeito de carga das protenas perde-se enquanto que devido desnaturao as protenas ficam todas com a forma de basto. Assim, as micelas de SDS-protenas so separadas de acordo com o seu peso molecular.