Você está na página 1de 51

Universidade Federal do Recncavo da Bahia

Cruz das Almas . Amargosa . Cachoeira . Santo Antnio de Jesus

Marcadores Moleculares Aplicados no Melhoramento

Mestranda: Camila Nogueira Pestana Caldas


Orientador(a): Prof. Dr Simone Alves Silva

Introduo
Melhoramento gentico tem influenciado:
Adaptabilidade e produtividade dos cultivos. Tcnica gentica molecular: Dcada de 80; Os estudos de identificao, caracterizao e mapeamento gentico, esto sendo realizados com maior segurana, rapidez e eficincia.

Melhoramento gentico
Aspectos fundamentais no programa de melhoramento gentico:
Seleo dos genitores; Mecanismos de herana dos caracteres;

Marcadores Genticos
Qualquer caracterstica morfolgica ou molecular que diferencia indivduos, e que seja facilmente detectvel.

um potencial marcador gentico;


Sua herana pode ser seguida atravs das geraes.

Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genticos herdveis dos ambientais

Marcadores

genticos herdveis simples

so

unidades

cromossoma

marcadores

MARCADORES MORFOLGICOS

Fentipo de fcil identificao, determinado por um nico alelo.

normalmente

So utilizadas desde os tempos de Mendel, como fentipos de fcil identificao visual, tais como:

nanismo; deficincia cloroftica; cor de ptala; morfologia foliar; cor da semente.

Limitaes dos Marcadores morfolgicos

O forte efeito dos genes determinantes de marcadores morfolgicos podem afetar a anlise gentica de grande numero de caracteres de importncia agronmica. Poucos caracteres podem ser estudados ao mesmo tempo. O ambiente pode modificar a expresso dos marcadores morfolgicos causando um confundimento na anlise.

Marcadores Gentico-Moleculares:
Viabiliza a caracterizao gentica de grande nmero de procedimentos relativamente simples e rpidos. seleo de genitores superiores; Deteco de marcadores para genes de interesses diversos. Podem ser divididos: Marcadores aloenzimas) baseados em enzimas (isoenzimas e

cidos nuclecos ( marcadores de DNA).

Marcadores Gentico-Moleculares: Caractersticas Desejveis


Alto polimorfismo; reprodutibilidade; codominante; amplamente distribudo atravs do genoma; barato; fcil de mensurar.

Marcadores moleculares enzimticos


Habilidade

de separar protenas pelo ponto isoeltrico e peso molecular.


Pode

ser til na caracterizao de protenas de sementes e na distino entre as espcies.

Marcadores bioqumicos (moleculares)


Baseado na propriedade de migrao das protenas Vantagens: Requer equipamento relativamente simples; Desvantagens: Sujeito a influncias ambientais;

limitado em nmero.

Marcadores de DNA (moleculares)


Polimorfismo detectado na seqncia de DNA Vantagens: No objeto de influncias ambientais; Potencialmente ilimitado em nmero; Desvantagens: necessidade de tcnicas e equipamentos mais complexos.

Marcador de DNA

DNA

Acesso ao gentipo da planta

Ambiente

Classificao por Tipo de Tcnica


Mtodos sem uso de PCR RFLP VNTR Mtodos com uso de PCR PCR com primers arbitrrios RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP; Polimorfismo de Tamanho de Fragmento Amplificado AFLP; ISSR PCR stio-especfico CAPS, SCAR SSRs (microssatlites) TGGE, SSCP, DGGE

Etapas da extrao do DNA

Marcadores moleculares de DNA


RFLP( Polimorfismo para o comprimento de fragmentos de restrio) Capaz de diferenciar indivduos atravs de variaes individuais nos nucleotdeos. DNA total digerido por enzimas de restrio dos indivduos a serem analisados. Consiste na hibridizao de sequncias especficas de DNA (sondas)

Etapas da tcnica de RFLP


1.Extrao de DNA; 2.Corte da fita dupla de DNA com enzimas de Restrio; 3.Gel agarose; 4.Passagem das bandas para membrana de nitrocelulose;

5.Fixao das bandas de DNA na membrana;


6.Hibridizao da sonda 7.Exposio das sondas a um filme de raio X,revelando as bandas de DNA.

Digesto de DNA Genmico e Separao em Gel


digesto 2 3 4 1 1 2 3 4 5 5

DNA
Separao em gel

Transferncia para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose


2

1
4

Hibridizao em Nylon ou Nitrocelulose

Vantagens RFLP
Esto disponveis em grande nmero. Exibem grande variabilidade natural; No so influenciado pelo ambiente; So livres de efeito de epistasia, oque permite a avaliao de diversos marcadores ao mesmo tempo.

PCR - Polymerase Chain Reaction

Multiplica n vitro fragmentos de molcula de DNA, a partir de pequenas quantidades;


Usa oligonucleotdeos de fita simples (primers) para amplificar uma seqncia do DNA-alvo.

Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD


Amplifica seqncias annimas de DNA usando primers arbitrrios 10 bases com >50% G+C
PCR com um nico primer

Mtodo rpido para deteco de polimorfismos


Marcador dominante Problemas de reproducibilidade

RAPD - Base gentica


Natureza molecular do polimorfismo no bem conhecida. Um indivduo apresenta a banda e o outro no. Mutao de ponto no stio de iniciao Deleo no stio de iniciao Insero colocando o stio de iniciao adjacente a uma distncia que a polimerase no amplifica. Dominante

RAPD

AA

AA Aa aa

Aa

aa

RAPD - Aplicaes
Habilidade para detectar regies do genoma altamente varivel (5-10 loci por primer)
Mapas genticos com ampla cobertura do genoma Estrutura e diversidade gentica de populaes naturais, (mesmo altamente aparentadas). BAGs Estudos de hibridao inter e intraespecfica. Filogenia entre espcies Seleo assistida para caracteres agronmicos

RAPD - Vantagens

Simplicidade e rapidez - o polimorfismo pode ser detectado direto no gel sem sondas nem istopos radiativos.

Quantidade mnima de DNA


Permite amostrar DNA repetitivo e de cpia nica

Baixo custo, instalaes menos complexas, automao, Estaes Experimentais.

RAPD - Limitaes
Dominantes Pouca reprodutibilidade Baixo contedo de informao gentica por loco.

S um alelo detectado. As demais variantes allicas so consideradas conjuntamente como nulas. Deve-se procurar padronizar bem as condies de reao e de amplificao, com uso de controles, alm do registro das bandas ntidas e consistentes.

Base do Polimorfismo de RAPD


Sequncia alvo
Gentipo 1

5 3 5

3 5 3 5

Gentipo 2

3
Sequncia ausente no gentipo 2

G1

G2

Etapas da tcnica RAPD

Polimorfismo entre gentipos de aveia aps amplificao com primers OPM17, OPM18, OPM19.

RAPD - resumo
Rpido Simples Baixo custo Sem uso de radio-istopos Marcador dominante Problemas de reproducibilidade Problemas de interpretao
Fonte: IPGRI

Microssatlites (SSR)
Sequence-Tagged Microsatlites (STMS) tambm conhecido como microssatlite ou Sequence Repeat (SSR) Normalmente locus simples e multi-allico Simple

Co-dominante
Altamente reprodutvel

Microssatlites (SSR)
altamente informativo - vrios alelos por locos deteco por PCR

facilmente transfervel entre labs


distribuio homognea no genoma

Microssatlites (SSR)

ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG

Primer FOR
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN

Repetio CA

Primer REV

Microssatlites

Deteco do polimorfismo Gis de agarose Gis de acrilamida (detecta diferenas de at 2pb) colorao direta: nitrato de prata (barato) Colorao indireta: marcao radioativa ou fluorescente

Microssatlites vantagens
Codominante

Multiallico
Mais alto PIC (ndice de informao polimrfico) Populao de estudo no precisa ter reconhecida diversidade gentica Pode-se trabalhar com populao mais informativa, do ponto de vista de caracteres biolgicos ou de interesse econmico; Ampla cobertura do genoma (distribuio ao acaso e freqente)

Microssatlites limitaes

Muito trabalho para desenvolver os marcadores Diversas plantas com hbito algamo e reconhecida diversidade gentica, pode-se usar tcnicas menos onerosas.

Microssatlites (SSR)
Southern blot - clones SSRs positivos 32P
Amplificao insertos clonados

APLICAES DOS MARCADORES MOLECULARES


Identificao de origem parental e testes de paternidade; Identificao e proteo de variedades e/ou clones patenteados; Certificao de pureza gentica de linhagens e hibridos;

MELHORAMENTO GENTICO

Isoenzimas pouco utilizados em virtude do baixo Nmero de marcadores teis disponveis. SSR muito utilizados no mapeamento gentico, Identificao de gentipos; RAPD cada vez menos utilizados, perdendo espao Para marcadores do tipo AFLP e ISSR , que geram mais Polimorfismo e so mais reprodutveis.