UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA PIBIC/Fundao Araucria DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA ORIENTADOR(A): Prof. Dr. Jos Eduardo Olivo Bolsista: Luana Thais Varizi

CULTIVO DE Bacillus Firmus CEPA 37 NA PRODUO DE CICLOMALTODEXTRINA-GLUCANOTRANSFERASE (CGTase)

Maring, 31 de agosto de 2013.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA PIBIC/Fundao Araucria DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA ORIENTADOR(A): Prof. Dr. Jos Eduardo Olivo Bolsista: Luana Thais Varizi

CULTIVO DE Bacillus Firmus CEPA 37 NA PRODUO DE CICLOMALTODEXTRINA-GLUCANOTRANSFERASE (CGTase)

Relatrio contendo os resultados finais do projeto de iniciao cientfica vinculado ao PIBIC/Fundao Araucria.

Maring, 31 de agosto de 2013.

Resumo: A ciclomaltodextrina-glucano-transferase, ou CGTase, uma enzima de origem bacteriana que tem como principal funo catalisar a converso do amido, para a formao de ciclodextrinas. As ciclodextrinas so oligossacardeos cclicos, constitudos por um nmero varivel de unidades de glicose que possuem muitas aplicaes no ramo industrial. Nesta pesquisa, a produo de CGTase se d a partir do cultivo de Bacillus firmus cepa 37, isolado em solo de plantao de mandioca. Os ensaios foram realizados em biorreator com processamento contnuo, durante os quais se retiraram amostras a cada 8 horas. Nestes ensaios, buscou-se a obteno de parmetros para a determinao tanto da cintica do crescimento celular, da cintica de consumo do substrato limitante e da cintica de sntese da enzima CGTase.

Palavras-chave: CGTase, ciclodextrinas, biorreator, contnuo, fermentao.

1. Introduo

Ciclodextrinas (CDs) so oligossacardeos cclicos, compostos de seis a dezenas de unidades de glicose unidas por ligaes do tipo -1,4. So obtidas a partir da ciclizao das dextrinas (provenientes da decomposio do amido por aquecimento ou hidrlise) e possuem frmula geral (C6H10O5)n. A degradao do amido auxiliada por enzimas que cortam a molcula de amido em pequenos pedaos, as dextrinas, e catalisam reaes intramoleculares nesses pedaos, dando a estes formas cclicas. A modificao enzimtica possibilita a ciclizao de seis, sete ou oito unidades de glicose, originando , ou -CDs, respectivamente, tambm chamadas de ciclodextrinas naturais por serem as mais comumente encontradas que possuem muitas aplicaes no ramo industrial. Algumas bactrias produzem extracelularmente CGTase, tais como: Bacillus 382, Bacillus sp. 1011, Bacillus circulans, Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Bacillus ohbensis, Bacillus stearothermophilus, Klebsiella pneumoniae M5al, Micrococcus sp. (FOGARTY & KELLY, 1990), Bacillus lentus alcaloflico (SABIONI, 1994) e Bacillus firmus (GAWANDE et al., 1999), com diferentes caractersticas dependendo do microrganismo produtor. Diferentes fontes de carbono so utilizadas para a produo de CGTase de origem bacteriana. POCSI, et al (1998) verificaram alta produo desta enzima na presena de amido solvel, muito embora a suplementao do meio com maltooligossacardeos cclicos tenha dobrado a produo enzimtica quando comparada quela obtida com sacardeos lineares. No presente trabalho, foram conduzidos ensaios de cultivo de Bacillus firmus Cepa 37 em biorreator agitado por processo contnuo.

1.1.Processo Contnuo

O processo contnuo um mtodo de bioprocessamento no qual matrias-primas so fornecidas e produto final removido continuamente a taxas volumtricas idnticas. Processo no qual as interrupes so mnimas em qualquer corrida de produo ou entre corridas de produo de produtos que exibam caractersticas de processo As principais vantagens apresentadas pelo processo contnuo de fermentao, em relao ao descontnuo tradicional, so decorrentes da operao em estado estacionrio, podendo-se destacar: o aumento da produtividade do processo, em virtude de uma reduo dos tempos mortos ou no-produtivos;

o obteno de caldo fermentado uniforme, o que facilita o projeto das operaes de recuperao do produto de interesse; o possibilidade de associao com outras operaes contnuas na linha de produo; o maior facilidade no emprego de controles avanados; o menor necessidade de mo-de-obra. Entretanto, ao lado das vantagens apontadas, o processo contnuo de fermentao apresenta tambm algumas desvantagens ou problemas prticos, que podem limitar o emprego deste tipo de sistema em escala industrial, para alguns processos fermentativos. Assim, podem-se destacar: o Maior investimento inicial na planta; o Possibilidade de ocorrncia de mutaes genticas espontneas, resultando na seleo de mutantes menos produtivos; o Maior possibilidade de ocorrncia de contaminaes, por se tratar de um sistema essencialmente aberto, necessitando pois, de manuteno de condies de assepsia nos sistemas de alimentao e retirada de meio; o Dificuldades de manuteno de homogeneidade no reator, quando se trabalha com baixas vazes.

1.2. O Sistema de Controle O Software BioProcessing-BioCommand Plus permite a otimizao do processo fermentativo, pelo fato de controlar variveis essenciais de processo em um tempo mnimo, evitando alteraes bruscas. O software BioCommand foi projetado para melhorar

a capacidade de monitorar e controlar a fermentao e processos de cultura de clulas atravs de um computador manuteno de pessoal. Este pacote fornece acompanhamento de ajuste, integral e histricos de alarme e

registros, controle de pontos

configuraes de

mostra tendncia. O software apresenta o controle das variveis de processo atravs de grficos. O biorreator conta com os seguintes sensores: pHmetro: a manuteno do pH bsico (em torno de 8,5) fundamental para a sntese eficaz da enzima. Em pH cido a enzima no produzida, pois o microorganismo no se desenvolve (o Bacillus firmus alcaloflico). O sistema de controle foi acionado para estabilizar o pH, que durante um processo fermentativo tende a cair, devido produo de metablitos cidos. Alm da adio de carbonato de sdio no refil do meio de cultura, que era alimentado ao reator contnuo vazo constante, adaptou-se ao fermentador solues cidas e bsicas pouco

concentradas (soluo de HCl ~2N e soluo de Na2CO3 1,4N, respectivamente) para que fossem adicionadas quando necessrio ao reator atravs de duas bombas, a fim de efetuar o controle dessa varivel. Oxignio Dissolvido: A medida do oxignio dissolvido no meio indica a quantidade de oxignio disponvel para consumo pelo microorganismo. O controle de oxigenao importante, visto que o Bacillus firmus uma bactria facultativa, tambm atuando em meio aerbico. Dessa forma, acompanha-se a DBO (demanda biolgica de oxignio) durante a fermentao, sabendo assim quanto de oxignio est sendo utilizado para atender s necessidades metablicas do microorganismo. Anti-espuma/nvel: o anti-espumante adicionado ao reator evita a formao de espuma que prejudica a deteco pelos sensores imersos no meio. O nvel deve ser mantido constante. Sensor de temperatura: O controle de temperatura tambm essencial, pois a temperatura ideal para o desenvolvimento desse bacilo 37C. Agitador: A agitao tambm deve ser controlada e manipulada conforme a necessidade, visto que quanto maior ela for, maior ser a oxigenao. Porm, se a agitao for muito grande ela tambm prejudicial, por formar muita espuma. Bombas: - O fermentador possui trs bombas de velocidade fixa, individualmente programveis, para adio de cido, base, anti-espuma e recolhimento da cultura (no nosso caso o recolhimento da cultura feito por uma bomba a parte do fermentador, com capacidade maior). Todos esses sensores ao realizarem a leitura da medida enviam um sinal para o sistema de controle acoplado ao fermentador que far a comparao com o valor determinado no setpoint. Caso exista uma diferena entre o valor lido e o valor desejado, o sistema de monitoramento envia um sinal para o sistema de aquecimento, caso seja necessrio alterar a temperatura, reduz ou aumenta a agitao, e aciona as bombas para adio de cido ou base, conforme a necessidade. Assim o valor da varivel ajustado at ser igualado novamente ao valor definido no setpoint.

2. Objetivos

Este trabalho teve como objetivo estudar e implementar o sistema de monitoramento de variveis de processo, atravs do Software BioProcessing-BioCommand Plus no cultivo de Bacillus firmus cepa 37 para a produo de CGTase em processo contnuo.

3. Materiais e mtodos

O microrganismo (Bacillus firmus, Cepa 37) foi inicialmente cultivado em meio semislido a 37 C at ecloso dos esporos e seu crescimento. Seguido a isto, o microrganismo foi transferido para um pr-inculo em erlenmeyer de 500 mL contendo meio de mesma composio do meio slido, exceto gar, sendo cultivado a 37 C e 150 rpm em agitador rotativo (shaker) por 48h.

Figura 3.1: Placa de petri contendo meio semi-slido antes da semeadura do bacilo.

Aps o desenvolvimento celular, o material foi homogeneizado e as clulas do pr-inculo foram transferidas para o meio de cultivo definitivo, em biorreator de 1,2 L. As composies dos meios de cultivo encontram-se na tabela 1. Realizou-se a fermentao em biorreator em regime contnuo sob monitoramento e controle das variveis, com pH 8,5, agitao entre 300 e 500 rpm e temperatura de 37 C, e efetuou-se as amostragens de 8 em 8h. Aps a centrifugao das amostras, as fraes lquidas foram armazenadas sob refrigerao para anlises posteriores de pH, Acares Redutores Totais, Protenas Solveis e Atividade Enzimtica. O precipitado, ressuspenso em volume definido, foi utilizado para anlise de concentrao celular, com leitura direta em espectrofotmetro a 610nm, conforme descrita por OLIVO (1985). Para anlise de Acares Redutores Totais (ART), amostras foram submetidas a um

processo de hidrlise cida (FALCONE & MARQUES, 1965), com posterior neutralizao e reao com DNS (cido 2,5-dinitrosaliclico), procedendo-se a leitura espectrofotomtrica a 600 nm, conforme o mtodo colorimtrico do DNS modificado descrito por ZANIN & MORAES, (1987). Para a medida do teor de protenas solveis, utilizou-se o mtodo colorimtrico de BRADFORD (1976), com leitura realizada a 595 nm e dosagem feita em duplicata. A atividade enzimtica (AE) foi determinada pelo mtodo das velocidades iniciais envolvendo a complexao da enzima CGTase com a fenolftalena (HAMON & MORAES, 1990). A leitura foi feita a 550 nm. A figuras 3.2, 3.4 e 3.5 apresentam as fotos do biorreator operando em regime descontnuo (batelada), descontnuo alimentado e contnuo, respectivamente. Os sensores e respectivos equipamentos esto identificados atravs das setas.

Figura 3.2: Biorreator e seus equipamentos anexos operando em regime descontnuo (batelada).

Figura 3.3: Detalhe do biorreator mostrando os sensores de pH e oxignio dissolvido.

Figura 3.4: Biorreator e seus equipamentos anexos em regime descontnuo alimentado. No regime descontnuo alimentado, o biorreator opera em batelada e periodicamente interrompe-se a agitao e deixa-se decantar a biomassa; 1/3 do meio retirado da superfcie, e reposto atravs da bomba que alimenta o meio estril contido no refil de alimentao. Depois que o volume original reestabelecido, cessa-se a alimentao. Em nenhum momento retiram-se os produtos, garatindo que o regime seja descontnuo. Dessa forma, repe-se os nutrientes do meio conservando o inculo.

Figura 3.5: Biorreator e seus equipamentos anexos operando em regime contnuo.

Figura 3.6: Detalhe da sada de ar do biorreator. Um filtro de vidro contendo algodo e l de vidro garante a reteno de clulas presentes no ar. O borbulhamento do ar de sada em soluo

diluda de hipoclorito evita a contaminao do ar ambiente.

Figura 3.7: Detalhe do frasco contendo soluo diluda de hipoclorito e o filtro acoplado.

O sistema em regime contnuo apresentado na figura 3.5 o objeto de estudo do presente trabalho. Ele era composto por um tanque cilndrico de vidro contento meio de cultivo de volume 6 L, previamente esterilizado e isento de clulas do bacilo. Este meio consistia no refil do fermentador, para que ocorresse alimentao contnua de meio. Este tanque alimentava o bioreator vazo constante atravs de uma bomba e era substitudo sempre que seu contedo fosse totalmente consumido. A mesma bomba retirava do biorreator o caldo fermentado, que era depositado em um erlenmeyer (coletor de meio). 4. Resultados Sero apresentados os resultados referentes ao processamento contnuo e o controle de suas variveis, j que este o objetivo central deste projeto. A composio do refil de alimentao est descrita na tabela abaixo, para um volume de 6L.

Tabela 4.1: Composio m/v dos meios de cultivo. Componentes % m/v MgSO4.7H2O 0,02 K2HPO4 Polipeptona Levedura Amido Na2CO3 0,1 0,5 0,5 2,0 1,0

A figura 4.2 ilustra as anlises realizadas de concentrao celular, pH do sobrenadante aps centrifugao, atividade enzimtica, acares redutores, acares redutores totais e protenas solveis relativas ao Ensaio 01, cujo tempo de durao foi de 162 horas. O pH do sobrenadante permaneceu estvel em torno de 9,0, graas ao controle do biorreator. O pico observado nos grficos de pH, 11,00, e acares redutores, 4,3 g/L, deve-se ao fato de o reator ter se esvaziado nesse intervalo, e ter sido novamente enchido com meio puro, aumentando a quantidade de nutrientes, o que justifica os acares redutores, e pela presena de carbonato de sdio explica o aumento do pH. Em 96 h o problema foi identificado, e em 98 h o reator j estava com o volume reestabelecido, consequentemente ao esvaziamento do reator, a concentrao celular caiu a quase zero. Recuperou-se no fundo do biorreator uma frao de clulas suficiente para que a concentrao celular aumentasse, quase recuperando a concentrao anterior ao ocorrido. Os acares redutores totais s foram quantificados at 96 h do processo fermentativo. A atividade enzimtica no apresentou valores significativos, sendo o valor mximo obtido 0,014 U/mL. A concentrao mxima de protenas solveis foi de 0,35 g/L, o que torna difcil a visualizao grfica na escala utilizada. A concentrao celular atingiu o valor mximo de 5,0 g/L.

12.00 10.00 Concentrao (g/L) 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 -6 -2.00 6 18 30 42 54 66 78 90 102 114 126 138 150 162

Tempo (h)

Protenas Solveis

ART

AR

pH

Conc. Celular

Figura 4.2: Controle offline das variveis concentrao celular, pH do sobrenadante aps centrifugao, acares redutores (AR), acares redutores totais (ART) e protenas solveis relativo ao Ensaio 01.

Atividade Enzimtica
Atividade Enzimtica (U/mL)
0.016 0.014 0.012

0.010
0.008 0.006 0.004 0.002 0.000

12

24

36 Tempo (h)

48

60

72

Figura 4.3: Controle offline das variveis de Atividade Enzimtica.

O Ensaio 02 teve durao de 360 horas, sendo os resultados das anlises mostrados na figura 4.4. O pH do sobrenadante manteve-se no intervalo entre 8,00 e 10,00. Os picos de acares redutores totais (ART), e de acares redutores (AR), que acompanhou o mesmo perfil, devem-se aos momentos de esvaziamento parcial do biorreator para alimentao com novo meio de cultivo. O valor mximo de concentrao celular foi 2,0 g/L. A concentrao de protenas solveis no foi superior a 0,35 g/L durante todo o processo fermentativo, tornando difcil a visualizao grfica nessa escala. A atividade enzimtica no teve valores significativos, atingindo o valor mximo de 0,060 U/mL, quando foi utilizado farelo de mandioca como fonte de amido para o refil de alimentao.

16.00 14.00 12.00 Concentrao (g/L) 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 -2.00 0 30 60 90 120 ART 150 180 210 240 AR Atividade Enzimtica 270 300 330 360 Tempo (h)

Protenas Solveis pH

Conc. Celular

Figura 4.4: Controle offline das variveis concentrao celular, pH do sobrenadante aps centrifugao, atividade enzimtica, acares redutores, acares redutores totais e protenas solveis relativo ao Ensaio 02. A figura 4.6 ilustra todo o andamento da fermentao referente ao Ensaio 03, cuja durao foi de 116 horas. Inicia-se o ensaio com regime descontnuo (batelada), cuja durao foi de 54 horas, tempo no qual o amido adicionado no meio (2%) sufiente para manter a concentrao de clulas estvel e disponvel para dar sequncia ao ensaio em regime contnuo. Para a transferncia do regime batelada para contnuo, faz-se necessrio esvaziar parcialmente o reator, estabelecendo desta forma um regime semi-contnuo temporariamente. O restante do meio que permaneceu no fermentador serve como inculo para a continuidade do processo, e o volume de 1,2L reestabelecido adicionando-se meio de cultivo novo e estril, disponvel no refil de 6 L, atravs da bomba de

alimentao. Como j explicado, o pH timo para crescimento do bacilo em questo 8,5. A curva de pH mostra que esta varivel foi controlada com preciso atravs da dosagem de cido e base atravs das bombas, e leituras realizadas pelo pHmetro. A temperatura tima para desenvolvimento do bacilo de 37 C, caracterizando-o como um microrganismo mesfilo. Nota-se que esta manteve-se constante durante todo o cultivo. A curva de agitao, em vermelho, est omitida, devido escala do grfico que no foi ajustada para valores maiores que 100. Como a agitao foi de 500 rpm durante todo o processo fermentativo, com exceo da madrugada, que abaixou-se para 300 rpm como medida de segurana, seu perfil grfico s aparece no momento em que interrompida, ao final da fermentao, caindo at zero. A curva de oxignio dissolvido a mais importante do controle realizado pelo Software, pois indica se h consumo de oxignio pelo Bacillus firmus ou no. Como uma bactria aerbia, o consumo de oxignio para realizao de suas atividades metablicas sugere que ela esteja produzindo a enzima de interesse, a CGTase. No incio do ensaio o nvel de oxignio dissolvido est alto, e cai continuamente durante o processo fermentativo. O bacilo atuou de forma limitada durante o perodo em que o oxignio dissolvido esteve prximo a zero. Em 21h de cultivo aumentou-se a agitao de 300 para 500 rpm, a fim de aumentar a oxigenao do meio, obtendo-se resultado imediato, como pode-se observar pelo aumento de oxignio dissolvido para em torno de 47%. Com o aumento da concentrao celular, a agitao no foi mais suficiente para manter o nvel de oxignio no meio, logo ele tornou a cair voltando s condies limitantes em 45h de fermentao. Em torno de 54h, esvaziou-se parcialmente o biorreator para realiment-lo com novo meio nutritivo, e estabelecer o regime contnuo. Isso fez com que o nvel de oxignio dissolvido voltasse a subir para nveis em torno de 55%. Aps, o nvel caiu discretamente indicando consumo pelo bacilo, mas estabeleceu-se entre 50 e 55% at o final da fermentao. O nvel constante indica que a alimentao contnua de nutrientes manteve a concentrao de oxignio estvel, sugerindo que a concentrao celular manteve-se constante. A figura 4.5 ilustra as anlises realizadas para o Ensaio 03, que teve durao de 116 h. A concentrao celular mxima foi 2,7 g/L. Pode-se observar que a medida que a concentrao celular aumentou at 44 horas, o perfil de oxignio dissolvido foi coerente, pois diminuiu para suprir s necessidades metablicas do microrganismo, que estava se reproduzindo. O pH do sobrenadante aps centrifugao manteve-se em torno de 9,5, graas ao controle do biorreator. Os acares redutores totais atingiram o mximo de 3,6 g/L e os acares redutores de 0,32 g/L. A concentrao mxima de protenas solveis foi de 0,84 g/L, e coincidiu com o pico de concentrao celular. A atividade enzimtica no apresentou valores significativos, sendo o valor mximo produzido de 0,012 U/mL.

10.00 8.00 Concentrao (g/L) 6.00

4.00
2.00 0.00 -4 -2.00 Protenas Solveis ART

20

32

44

56 Tempo (h)

68

80

92

104

116

AR

pH

Conc. Celular

Atividade Enzimtica

Figura 4.5: Controle offline das variveis concentrao celular, pH do sobrenadante aps centrifugao, atividade enzimtica, acares redutores, acares redutores totais e protenas solveis relativo ao Ensaio 03.

Figura 4.6: Controle das variveis pH, agitao, oxignio dissolvido e temperatura durante o Ensaio 03. A figura 4.7 ilustra as anlises realizadas para o Ensaio 04, que teve durao de 58 h. A concentrao celular mxima foi 0,551 g/L com 24 horas de cultivo. Pode-se observar que a medida que a concentrao celular foi aumentanto at , o perfil de oxignio dissolvido tambm foi coerente, pois diminuiu para suprir s necessidades metablicas do microrganismo, que estava se reproduzindo.Quanto ao pH do sobrenadante aps centrifugao, verifica-se que houve pouca variao, iniciando em 10,83 e caindo a 9,86 em 22h de cultivo, evidenciando que houve um bom controle controle do biorreator. Os acares redutores totais atingiram o mximo de 11,8 g/L e os acares redutores de 0,550 g/L, diminuindo durante todo o cultivo de Bacillus firmus, evidenciando seu consumo. A concentrao mxima de protenas solveis foi de 0,210 g/L, e chegando a 0,218 no final do cultivo que coincidiu com o aumento continuo da concentrao celular . A atividade enzimtica, esta no apresentou valores significativos atingindo seu valor mximo de 0,081U/mL em 25h de cultivo, decrescendo durante o restante do tempo, apresentado somente uma pequena elevao para um valor de 0,063U/mL em 48h de cultivo.

25.000 20.000 15.000 10.000 5.000 0.000 0 10 20 30 ART 40 50 AR 60 70

Concentrao (g/L

Tempo (h)
Protenas Solveis

pH

Conc. Celular

Atividade Enzimtica

Figura 4.7: Controle offline das variveis concentrao celular, pH do sobrenadante aps centrifugao, atividade enzimtica, acares redutores, acares redutores totais e protenas solveis relativo ao Ensaio 04.

Figura 4.8: Controle das variveis pH, agitao, oxignio dissolvido e temperatura durante o Ensaio 04. A figura referente ao Ensaio 04, figura 4.8, apresenta temperatura estvel em 37 C, pH estvel em 8,5, agitao em 300 rpm, e a concentrao de oxignio dissolvido caindo, sugerindo o consumo pelo bacilo para atender suas necessidade metablicas. O detalhe do pico na agitao, que foi aumentada para 500 rpm, mostra a rpida resposta do sistema com o aumento da concentrao de oxignio dissolvido. A figura 4.9 ilustra todo o andamento da fermentao referente ao Ensaio 05, cuja durao foi de 246 horas. Inicia-se o ensaio com regime descontnuo (batelada), cuja durao foi de 48 horas, tempo no qual o amido adicionado no meio (2%) sufiente para manter a concentrao de clulas estvel e disponvel para dar sequncia ao ensaio em regime contnuo. Para a transferncia do regime batelada para contnuo, faz-se necessrio esvaziar parcialmente o reator, estabelecendo desta forma um regime semi-contnuo temporariamente com dois pulsos de amido com 48 e 96h de cultivo . O restante do meio que permaneceu no fermentador serve como inculo para a continuidade do processo de fermentao contnua que se iniciou em 176 horas. Sendo assim o volume de 1,2L reestabelecido adicionando-se meio de cultivo novo e estril, disponvel no refil de 6 L, atravs da

bomba de alimentao. Relativo ao Ensaio 05, o pH do sobrenadante permaneceu estvel em torno de 9,0, graas ao controle do biorreator. Os acares redutores atingiram um valor mximo de 3,31 g/L e 2,73 g/L com 48 e 96 horas de cultivo ,isso deve-se ao fato dos pulsos de amido, evidenciando uma eficincia do mesmo. Os aucares redutores voltam a cair e a medida que se da inicio ao processo contnuo possvel verificar um ligeiro crescimento terminando o ensaio a quase zero, o que tambm se observa nos aucares redutores totais que atinge o seu mximo de 31,4 g/L apartir do mometo que se inicia o contnuo, chegando a quase zero no fim das 246 horas. A concentrao celular mxima foi 8,24 g/L. A concentrao mxima de protenas solveis foi de 0,17 g/L que coincidiu com o pico de concentrao celular. A atividade enzimtica no apresentou valores significativos, sendo o valor mximo produzido de 0,0056 U/mL.
40 35 30

Concentrao (g/L

25 20 15 10 5 0 0 -5 50 100 150 200 250 300

Tempo (h)
Protenasa Solveis "Conc. Celular" "AR" ART pH Atividade Ezimtica

Figura 4.9: Controle offline das variveis concentrao celular, pH do sobrenadante aps centrifugao, atividade enzimtica, acares redutores, acares redutores totais e protenas solveis relativo ao Ensaio 05.

5. Concluso

Apesar de no se terem obtido resultados satisfatrios com relao produo de CGTase, sendo a atividade enzimtica mxima obtida de 0,081 U/mL, os objetivos centrais do projeto

foram alcanados, pois o controle pelo Software acoplado ao biorreator foi eficiente.

6. Referncias Bibliogrficas

ALVES, L. B.; MATIOLI, G.; MORAES, F. F.; ZANIN, G. M. and OLIVO. J. E.. Production of Cyclodextringlycosyltransferase from Bacillus firmus. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 44, 399-402, 2002. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248-254, 1976. GAWANDE, B. N.; GOEL, A.; PATKAR, A. Y.; NENE, S. N. Purification and properties of a novel raw starch degrading cyclomaltodextrin glucanotransferase from Bacillus firmus. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 51, n. 4, p. 504-509, 1999. HAMON, V. & MORAES, F. F. Etude Preliminare a LImmobilisation de LEnzime CGTase WACKER. Relatrio de Pesquisa, Laboratoire de Technologie Enzymatique, Universit de Technologie de Compigne, Compigne, France, 234 p., 1990. MATIOLI, G. Seleo de microrganismo e caracterizao de sua enzima ciclodextrina glicosiltransferase, Ph. D. Thesis, Universidade Federal do Paran, Curitiba, 1997. NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO., INC. BioCommand Plus BioProcessing Software, Guide to Operations, MANUAL NO: M1291-0050, Revision A, February 4, 2002.