UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN SETOR DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

SELEO DE NOVOS PRODUTOS MICROBIANOS

Trabalho acadmico apresentado disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paran.

CURITIBA 2008

SUMRIO

1- INTRODUO................................................................................................ 2- ANTIMICROBIANOS...................................................................................... 2.1- MTODOS DE DIFUSO........................................................................ 2.1.1- Mtodo de disco-difuso................................................................

2 3 4 5

2.1.2- Verificao do sinergismo e antagonismo de antimicrobianos....... 7 2.1.3- Difuso em gar com molde cilndrico........................................... 2.1.4- Moldes de gar e placas com valas............................................... 2.1.5- Mtodo do teste E.......................................................................... 2.2- MTODOS DE DILUIO....................................................................... 8 8 9 10

2.2.1- Diluio em meio slido.................................................................. 10 2.2.2- Diluio em caldo de cultura.......................................................... 2.3- DETECO DE ANTIBITICOS EM MEIOS NATURAIS....................... 11 12

2.4- AUTOMAO DOS TESTES ANTIMICROBIANOS................................ 12

2.5- DETECO DE RESISTNCIA ATRAVS DE BIOLOGIA MOLECULAR........

13 14 15 16 17

2.6- BACTERIOCINAS.................................................................................... 3- ANTIFNGICOS............................................................................................. 4- ANTIVIRAIS... 5- ANTIOXIDANTES...........................................................................................

5.1- MTODO DA CAPTURA DE RADICAIS LIVRES DE DPPH................... 18 5.2- DETERMINAO DE COMPOSTOS FENLICOS TOTAIS.................. 18

5.3- DETERMINAO DE CIDO ASCRBICO............................................ 19 5.4 DETERMINAO DA INIBIO DE HEMLISE.................................. 6- ANTITUMORAIS............................................................................................. 6.1- TESTES in vivo........................................................................................ 6.2- TESTES in vitro........................................................................................ 7- ANTIPARASITRIOS..................................................................................... 8- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................. 9- ANEXOS....................................................................................................... 19 20 20 24 25 27 32

1- INTRODUO

Existe uma grande diversidade microbiana nos diferentes ambientes. Devido a essa diversidade de formas de vida que surgiu ao longo dos anos, pde-se obter organismos capazes de produzir variados tipos de substncias. Algumas dessas substncias podem apresentar funes que podem ser empregadas em processos como melhoramento de alimentos ou tratamento de doenas, por exemplo. Muitos desses produtos tm origem microbiana e podem ser empregados em vrios processos, mas para isso primeiramente necessrio descobrir o microrganismo produtor certo. A utilizao de testes de seleo, ou screening, avalia a possvel atividade de um microrganismo ou da substncia por ele produzida. A busca de novos produtos naturais tem impulsionado bastante a pesquisa visando descoberta de novos produtos, principalmente para o tratamento de doenas. Os produtos microbianos de interesse geralmente so formados em decorrncia da resposta do microrganismo s condies do meio ambiente em que ele se encontra. Eles podem ser tanto metablitos primrios quanto secundrios. Metablitos primrios so aqueles relacionados com a sntese da clula microbiana na fase de crescimento, como aminocidos, nucleotdeos e cidos orgnicos. Uma grande parte das enzimas tambm se encontra nessa classe de produtos. J metablitos secundrios so aqueles acumulados durante o perodo de limitao de nutriente e que no tem relao direta com a sntese para crescimento celular (PRESCOTT, HARLEY, KLEIN, 2002). Para se fazer qualquer tipo de screening, necessrio alguns microrganismos que possivelmente produzam o composto desejado ou apresentam a atividade desejada. Esses microrganismos podem ser obtidos atravs do isolamento de fontes naturais, da compra de cepas em centros de culturas, da mutao de determinado microrganismo, ou da produo de organismos recombinantes. Deseja-se

principalmente microrganismos capazes de: ter uma grande eficincia na converso de substrato em produto, sendo que ele pode ser acumulado em grandes quantidades sem afetar o desempenho da clula; no produzirem substncias que degradam o produto desejado; produzirem rapidamente o produto e sem muitas necessidades que precisam serem controladas durante o processo. Depois vem o processo de otimizao da produo de determinado composto pelo microrganismo. Atravs de mudanas na composio nutricional do meio de

cultivo ou das condies fsicas como pH, temperatura, ou crescimento em estado slido, possvel determinar uma produo mxima. Aps a produo vem o processo de avaliao das propriedades desses produtos, que vo desde a anlise de sua estrutura at de sua possvel atividade biolgica. Os testes possveis de serem realizados variam dependendo da caracterstica analisada, do tipo de metodologia do teste e da natureza da amostra do produto microbiano. Eles podem ser feitos de trs formas: testes in vivo com a utilizao de cobaias, testes em clulas intactas e testes em preparaes sub-celulares. A seguir, sero discutidos testes realizados para alguns tipos de produtos microbianos. Alguns produtos microbianos so de deteco mais fcil, como compostos organolpticos (corantes ou aromas), no necessitando um procedimento de seleo muito sofisticado. Os testes descritos a seguir so mais aplicados na deteco de compostos bioativos, ou seja, aqueles que desempenham algum papel no mecanismo biolgico de determinados organismos. Em anexo esto presentes alguns artigos exemplificando a deteco de diferentes compostos bioativos atravs de algumas tcnicas. O primeiro mostra a deteco de bacteriocinas produzidas por bactrias, o segundo a produo de antioxidantes e antimicrobianos pelo cogumelo shiitake ( Lentinula edodes), e o terceiro a mostra a determinao de compostos antitumorais que agem diretamente no DNA. 2- ANTIMICROBIANOS

Antibiticos so compostos que inibem o desenvolvimento de microrganismos alvo atravs da destruio de suas clulas ou de um impedimento do crescimento celular. Os laboratrios possuem diversos mtodos para a deteco da sensibilidade de um microrganismo a um determinado antimicrobiano. Entre os mais utilizados esto os testes da difuso em disco, a microdiluio em caldo, a diluio em gar, o mtodo E test e os mtodos automatizados (TRABULSI e ALTERTHUM, 2004). Os testes para determinao da sensibilidade de um microrganismo frente a um antimicrobiano so de extrema importncia no descobrimento de novas drogas no tratamento de doenas infecciosas. Os resultados obtidos nesses testes podem apontar que um microrganismo teste :

Sensvel substncia microbiana: a multiplicao celular do microrganismo texto no acontece devido presena da substncia sendo analisada. Intermedirio: o microrganismo inibido somente se doses grandes so administradas. Resistente: quando no h inibio de crescimento. Tambm se deve observar que in vivo a mxima concentrao obtida do antibitico no sangue nem sempre corresponde concentrao mnima do antibitico necessria para a inibio do crescimento do microrganismo, e ele ser considerado como resistente, mesmo sendo sensvel no teste in vitro (DEVRIESE e DUTTA, 1981).

Devido ao problema apontado no ltimo tpico, segundo a NCCLS define que a interpretao do teste de sensibilidade antimicrobiana in vitro deve ser feita com relao s concentraes sricas ou teciduais que o antimicrobiano consegue atingir em um organismo (NCCLS, 2003). Os testes de sensitividade ou resistncia de um determinado microrganismo so difceis de determinar atravs de testes in vivo. A principal dificuldade reside na complexidade e diversidade nas infeces causadas por microrganismos e nas interaes que antimicrobianos podem fazer com protenas do soro, resultando em alteraes na atividade, distribuio, e eliminao do antibitico. Outro fator seria a diferena de aptido dos organismos no contra-ataque ao microrganismo infectante, a qual pode variar de um indivduo para o outro durante o teste. Por isso, testes in vitro so mais utilizados devido ao maior controle e reprodutibilidade. Geralmente bactrias que apresentam sensibilidades in vitro semelhantes, apresentaro respostas similares tambm durante a infeco de um organismo hospedeiro (DEVRIESE e DUTTA, 1981). A seguir sero discutidos os mtodos in vitro mais utilizados atualmente.

2.1- MTODOS DE DIFUSO

Os testes de difuso so realizados em meios solidificados, contendo o agente antimicrobiano e o microrganismo em que ele possivelmente pode inibir o crescimento. Eles so bastante utilizados devido praticidade do protocolo, baixo custo de realizao e facilidade da leitura do resultado. Uma desvantagem desse

mtodo a impossibilidade de diferenciar agentes bactericidas de agentes bacteriostticos.

2.1.1- Mtodo de disco-difuso

Um dos mtodos mais utilizados em testes antimicrobianos o mtodo de disco-difuso, tambm conhecido como teste de Kirby-Bauer. O mtodo de discodifuso j padronizado pela NCCLS, organizao a qual estabelece mtodos de referncia, parmetros de controle de qualidade, e critrios de anlise de resultados (NCCLS, 2003). Primeiramente ocorre a semeadura uniforme de um microrganismo teste por toda a superfcie de um meio solidificado em placa de Petri. Existem vrios meios de cultivo disponveis, mas o mais indicado para esse tipo de teste o gar MuellerHinton, pois ele apresenta uma grande reprodutibilidade, contm baixo teor de inibidores de compostos como sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas, permite um bom crescimento de patgenos no fastidiosos, e j foi utilizado por uma grande quantidade de pesquisas nessa rea (NCCLS, 2003). A quantidade de

microrganismo semeada na placa de gar deve ser padronizada em todas as amostras a serem testadas para poder-se comparar os resultados (TORTORA et al., 2006). A padronizao da densidade do inculo ocorre atravs do controle da turbidez, sendo utilizada a escala de McFarland 0,5 como padro em todos os experimentos. Isso equivale a uma suspenso contendo de 1 a 2 x 10 8 UFC/mL de E. coli ATCC 25922 (NCCLS, 2003). Para servir de microrganismos testes so escolhidos geralmente patgenos que causam algum processo infeccioso que possvel tratar atravs do uso de algumas substncias. Ento, discos de papel filtros so impregnados com quantidades conhecidas de caldo fermentado pelo microrganismo produtor do antimicrobiano e colocados sobre a superfcie que havia sido semeada. Os discos podem ser feitos pelo prprio pesquisador ou serem comprados. Existem alguns comercialmente disponveis como os papis absorventes de Ford (Blotterettes), sendo que existem vrias formas e cores, auxiliando na identificao dos discos durante o teste (COLLINS, 1964). Durante o perodo de incubao, os agentes antimicrobianos difundem-se do papel filtro para o meio de cultura, sendo que quanto mais distante do filtro, menor a concentrao do agente difundido.

Se o produto da fermentao for realmente um antimicrobiano contra o microrganismo inoculado na placa, no haver seu crescimento ao redor do papel filtro, e formar-se- um halo de inibio ao redor do disco (Figura 1). Atravs da medio do halo de inibio pode-se observar a sensibilidade do microrganismo substncia antimicrobiana. O dimetro dessa zona tambm pode ser comparado com tabelas padro de outros antimicrobianos j conhecidos, para determinar o grau de sensibilidade do microrganismo teste substncia (sensvel, intermedirio ou resistente). A solubilidade da substncia antimicrobiana tambm de extrema importncia para esse teste, pois uma droga de baixa solubilidade ir se difundir menos pela placa e formar um halo menor do que drogas mais solveis (TORTORA et al., 2006).

Figura 1- Formao do halo de inibio devido ao antibitico no disco

Os testes baseados somente na presena ou ausncia do halo so desconsiderados pela NCCLS, s sendo obtidos resultados confiveis com a medida do tamanho do halo de inibio correlacionada concentrao inibitria mnima (CIM) (NCCLS, 2003). O tamanho do halo de inibio tem uma relao com a concentrao inibitria mnima (CIM), mas, como mostra a Figura 2, esse mtodo no indicado para a determinao de tal fator, devido a grande varincia que pode se obter nos resultados. Figura 2- Correlao entre o halo de inibio e a CMI para 10g de ampcilina

Fonte: TRABULSI e ALTERTHUM, 1996.

2.1.2- Verificao do sinergismo e antagonismo de antimicrobianos

Algumas vezes pode-se tambm determinar as relaes de sinergismo e antagonismo quando h mais de um antibitico presente ao mesmo tempo. Sinergismo seria a potencializao de um antibitico devido presena de outro. Isso tipicamente ocorre quando se associam aminoglicosdeos e -lactmicos, ou sulfametoxazol e trimetoprina. J em situaes de antagonismo ocorre a reduo da atividade de um antibacteriano devido presena de outro. Esse fato observado na associao de antibiticos bacteriostticos com bactericidas (TRABULSI e ALTERTHUM, 1996). O antibiograma pode ser feito em placa de gar contendo tiras contendo o antibitico (Figura 3). Se houver crescimento na regio em que os dois antibiticos se misturam e inibio nas reas em que somente um deles est presente, significa que h antagonismo. Se no houver crescimento na rea de mistura, sendo que nesse caso a inibio chega a ser maior que nas regies com somente um dos

antibiticos, significa que h uma relao de sinergismo (TRABULSI e ALTERTHUM, 1996).

Figura 3- Antagonismo e sinergismo dos antibiticos A, B, C e D.

Fonte: (TRABULSI e ALTERTHUM, 1996).

2.1.3- Difuso em gar com molde cilndrico

O mtodo consiste na utilizao de cilindros feitos de vidro, porcelana ou ao inoxidvel, com 10 mm de comprimento, 6 mm de dimetro interno e aberto nas duas extremidades. Isolantes eltricos chamados espinha-de-peixe (fish-spine) tambm podem ser utilizados (COLLINS, 1964). Primeiramente faz-se uma semeadura do meio atravs da tcnica de derramamento (pour-plate) e coloca-se os moldes. Para colocar-se os moldes no gar solidificado, necessrio ter uma camada de gar mnima de 20 mm de espessura. Dentro de cada molde coloca-se uma determinada quantidade da suspenso do provvel agente antimicrobiano e incuba-se a placa para promover o crescimento bacteriano. Se houver a formao de zonas sem crescimento ao redor do cilindro indicam uma ao antibitica (COLLINS, 1964).

2.1.4- Moldes de gar e placas com valas

Nesse mtodo, coloca-se 12mL de gar em uma placa de Petri e espera-se essa camada solidificar. Ento, corta-se pequenos discos no gar e retira-os da placa, formando alguns buracos. Finalmente adiciona duas gotas para selar o fundo

de cada buraco e aps a solidificao adiciona-se o antibitico nos espaos. (COLLINS, 1964). J a tcnica da placa com valas consiste em cortar uma tira de 1 cm de largura de um lado ao outro da placa e retirar esse pedao de gar. Derrete-se 10mL de gar e adiciona-se o antimicrobiano, derramando a mistura no buraco da tira at ficar no mesmo nvel da outra poro de gar. Espera-se solidificar, inocula-se o organismo teste e observa-se se h inibio do crescimento, pois o antibitico ir se difundir da vala para o resto do meio. (COLLINS, 1964).

2.1.5- Mtodo do teste E

O teste E, abreviatura de epsilmetro, permite a estimao da concentrao inibitria mnima (CIM), ou seja, a concentrao de antibitico mais baixa que impede o crescimento bacteriano visvel (Figura 4). O teste consiste numa tira revestida de plstico que contm um gradiente de concentraes de antimicrobiano, e a CIM pode ser lida na escala impressa na tira (TORTORA et al., 2006). Esse teste pode ser aplicado na determinao da sensibilidade de antimicrobianos e antifngicos contra vrios organismos, incluindo microrganismos anaerbios, microbactrias e fungos (TRABULSI e ALTERTHUM, 2004).

Figura 4- Teste E

Fonte: TORTORA et al., 2006. 2.1.5- Teste da produo de -lactamase

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Esse teste importante na deteco de sensibilidade em microrganismos como Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Enterococcus spp. e espcies de estafilococos (NCCLS, 2003). Nesse teste observa-se a produo de -lactamase pelo microrganismo, pois usa-se a cefalosporina, a qual muda de cor quando o seu anel -lactmico rompido (COLLINS, 1964). 2.2- MTODOS DE DILUIO Os testes envolvendo uma srie de diluies podem ser feitos tanto em meio slido como lquido. Os agentes antimicrobianos so testados em uma escala de diluio seriada (geralmente log 2) e assim determina-se parmetros como a concentrao inibitria mnima. 2.2.1- Diluio em meio slido Nesse teste so feitas placas de meio slido contendo diferentes concentraes do agente antimicrobiano. O microrganismo teste que ser inoculado deve ter uma concentrao de 10 4 UFC/mL, o qual pode ser preparado atravs da coleta de quatro a cinco colnias e inoculando um meio de Melle-Hinton ou TBS, que ser incubado de 3 a 4 horas a 35C e ento padronizado para a escala 0,5 de McFarland (108 UFC/mL). Atravs do uso de uma ala calibrada ou de um repicador de Steers (Figura 5), coleta-se 0,001 a 0,002 mL dessa soluo padronizada e aplica-se sobre as superfcies dos meios slidos preparados, resultando numa concentrao de 104 UFC/mL. As placas so incubadas por 18 a 24 horas 35C e ento faz-se a leitura dos resultados, verificando se houve crescimento ou no do microrganismo teste (TRABULSI e ALTERTHUM, 2004). Figura 5- Teste de diluio em gar com repicador de Steers.

Fonte: TRABULSI e ALTERTHUM, 2004.

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2.2.2- Diluio em caldo de cultura

O teste de diluio em caldo de cultura normalmente utilizado para a determinao da concentrao inibitria mnima (CIM) e da concentrao bactericida mnima (CBM). CIM mede a inibio do crescimento, que somente uma das vrias formas de ao dos antimicrobianos na clula de bactrias. CBM indica se as clulas que tiveram o crescimento inibido foram mortas ou no (TORTORA et al., 2006). A determinao da CIM feita atravs de uma srie de diluies, em que a concentrao da droga decresce, que pode ser feita em tubos de ensaio ou microplacas. Aps o inculo do microrganismo teste, faz-se a incubao e l-se a absorbncia 630nm ou quando no h agitao da paca observa-se a formao de precipitado de clulas (Figura 6). Um fator importante nesse teste a padronizao do inculo, pois uma incerteza na concentrao celular pode interferir no resultado final. Recomenda-se a concentrao mais alta como sendo de 5x105 UFC/mL.

Figura 6- Teste de diluio em microplaca

Fonte: TORTORA et al., 2006.

Durante o teste utiliza-se dois controles para se ter uma maior confiabilidade no resultado. O controle positivo consiste no preparo de poos que no contm o antibitico, somente o caldo nutritivo e o microrganismo inoculado. Ele feito para

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garantir que o microrganismo consegue se desenvolver no meio nutritivo sem a presena do antibitico. Existe tambm o controle negativo, que serve para garantir a inexistncia de microrganismos contaminantes. Nesse poo h o caldo nutriente sem o inculo e sem o antibitico (TORTORA et al.,2006). Para determinar a CBM, pode-se pegar as amostrar sem crescimento no teste para determinao do CMI e seme-las em meio slido nutriente. Se no houver crescimento, indica que a droga bactericida, e a concentrao mnima em que isso acontece corresponde CBM (SOUZA, AVANCINI, WIEST, 2000). No teste em meio lquido pode ser difcil a identificao de qual substancia responsvel pelo efeito antimicrobiano. Outra desvantagem o difcil controle de contaminao e a grande variao entre uma diluio e outra (COLLINS, 1964).

2.3- DETECO DE ANTIBITICOS EM MEIOS NATURAIS

Esse mtodo permite a seleo de uma colnia desconhecida produtora de antibitico que proveniente do meio ambiente. Primeiramente preparada uma suspenso da poro do meio ambiente coletado (como solo, lodo) e faz-se uma srie de diluies. Adiciona-se 1mL de cada diluio em meio com gar derretido, derrama-se a mistura em placa de Petri e espera-se a solidificao. Aps, depositase sobre o gar mais uma pequena camada de gar. As placas so incubadas por 4 a 6 horas e ento se adiciona um organismo teste (como Staphylococcus, B. cereus ou Kl. Pneumoniae). Incuba-se novamente as placas e observa-se se h algum resultado positivo. Se algum antibitico for produzido por colnias no fundo do gar, ele ir se difundir pelo meio at a superfcie e afetar o crescimento do microrganismo teste. (COLLINS, 1964).

2.4- AUTOMAO DOS TESTES ANTIMICROBIANOS

Com o avano na tecnologia de sistemas automatizados, a realizao de testes de antibiograma tem sido muito facilitada, proporcionando uma reduo no tempo de execuo e na liberao dos resultados. Existem vrios aparelhos comercializados, sendo os mais importantes: sistema Vitek (bioMrieux Vitek, USA): O sistema de cultura um pequeno disco de plstico com 30 poos (ou microcuvetas) contendo antimicrobianos e

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ligados a capilares que os inoculam com uma suspenso bacteriana. O crescimento determinado turbdimetricamente em intervalos de tempo de at 15 horas. J existe um sistema mais moderno da mesma linha, o Vitek 2. MicroScan Walkaway (Dade, USA): desenvolvido no final da dcada de 80, capaz de determinar testes de sensibilidade em microplacas atravs da deteco fotomtrica (em incubaes overnight) ou fluorimtrica (em incubaes breves). No entanto, o preparo da microplaca feito manualmente atravs de inoculador multicanal. ATB-plua (bioMrieux, Frana). Sensititre ARIS (Radiometer Amrica, USA): Utiliza microplacas que so inoculads com um autoinoculador e so monitoradas fluorimetricamente durante a incubao, pois ocorre a hidrlise de substratos que geram fluorescncia quando h crescimento bacteriano (FELMINGHAM & BROWN, 2001).

Esses testes possuem algumas desvantagens, como a necessidade de preparo adequado do inculo, a falta de flexibilidade no teste de outros antimicrobianos devido a possveis contaminaes, a impossibilidade de us-los para alguns tipos de bactrias e ao custo relativamente alto dos equipamentos e testes individuais (TRABULSI e ALTERTHUM, 2004).

2.5- DETECO DE RESISTNCIA ATRAVS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Se o composto antimicrobiano sendo testado j tiver a estrutura e a ao conhecidas, pode-se selecionar uma cepa que seja resistente atravs de tcnicas de biologia molecular, como sondas de DNA e PCR. Essas tcnicas podem ser teis na avaliao de resultados de CIM que esto muito prximos de serem classificados como resistentes, na deteco direta de genes de resistncia ou mutaes que geraram resistncia, e no monitoramento da disseminao de genes de resistncia. Por exemplo, ao verificar a ausncia do gene mec de resistncia a oxacilina em uma cepa de S. aureus sugere a utilizao de um -lactmico contra a espcie (TRABULSI e ALTERTHUM, 2004).

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2.6- BACTERIOCINAS

Bacteriocinas so protenas produzidas por bactrias que apresentam plasmdeos denominados plasmdeos bacteriocinognicos. Elas so antibiticos que apresentam grande especificidade e atacam somente bactrias da mesma espcie ou correlatas (taxonomicamente afins), sendo importante no controle de bactrias patognicas (de BIAGI & de AZEVEDO, 1992). O uso das bacteriocinas tem sido bastante investigado no combate de bactrias deterioradoras e patognicas presentes nos alimentos, podendo ser usada como um conservante natural. GARCIA et al. (2006) estudou a ao inibitria de bacteriocinas de Lactobacillus acidophilus atravs do mtodo de dupla camada. Para desenvolver esse mtodo descrito por Maia et al. (2001), primeiramente prepara-se um inculo de 106 UFC/mL da amostra de L. acidophilus em meio MRS lquido. Ento, distribuise pores desse caldo eqidistantemente em uma placa de Petri com gar MRS e incuba-se por 72 horas. Aps a incubao, as bactrias foram mortas por exposio ao clorofrmio por 20 minutos. Ento, adiciona-se uma segunda camada de 3,5mL de gar BHI (infuso Crebro-Corao) contendo 1% de uma suspenso de 10 6 UFC/mL do microrganismo indicador (E.coli, Salmonella enterica, Clostridium perfringens). As placas so novamente incubadas, sendo que no caso de C. perfringens deve ser em anaerobiose, e avalia-se a presena de inibio de crescimento em milmetros a partir do centro do inculo. No entanto, esse teste no permite ter certeza que o agente inibitrio realmente uma bacteriocina. Para se provar a natureza protica do composto, podese fazer o teste de spot-on-the-lawn, onde se utiliza um meio de cultura isento de glicose e de acares fermentveis. O meio de cultivo utilizado por GARCIA et al. (2006) foi o gar Soja Tripticase suplementado com Extrato de Levedura. Adicionase 2L da suspenso do lactobacilo no centro do gar e incuba -se por 24 horas em anaerobiose. Faz-se uso do cultivo anaerbio nesse caso para evitar a formao de perxido de hidrognio. Aps a incubao, adiciona-se 8 mL de gar BHI com a suspenso do microrganismo teste e incuba-se mais uma vez. Se houver formao de halo indica que h a produo de bacteriocinas pelo lactobacilo. J BROMBERG et al. (2006) utilizou o mtodo da diluio para testar a atividade da bacteriocina. Aps fazer uma srie de diluio em microplaca do caldo

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que continha bacteriocinas produzidas por Lactococcus lactis ssp. Hordniae CTC 484, eles depositaram 10L de cada diluio no centro de uma placa contendo o microrganismo teste e observaram a presena ou no do halo de inibio. Para testar a ao da bacteriocina quando o organismo produtor e o organismo alvo estavam presentes ao mesmo tempo em pedaos de carne bovina, os pesquisadores inocularam 2% do cultivo ativo da bactria produtora de bacteriocina e 1% de L. monocytogenes e incubaram. De tempos em tempos era feita a contagem de clulas viveis dos dois microrganismos. Foram feitos tambm o controle positivo (somente a cultura do produtor) e negativo (somente a cultura do organismo sensvel). Os testes mostraram que h uma produo de bacteriocinas suficiente para suprimir o crescimento do outro microrganismo (BROMBERG et al., 2006).

3- ANTIFNGICOS

Os agentes antifngicos so principalmente testados contra cepas que causam infeces invasivas como Aspergillus, Fusarium, Rhizopus,

Pseudallescheria boydii e Sporothrix schenckii. Os testes no so aplicados fase leveduriforme de fungos dimrficos como Blastomyces dermattitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum variedade capsulatum, Penicillium marneffei e S. schenckii (NCCLS, 2002). Utiliza-se durante o teste um meio de cultivo lquido sinttico definido como o RPMI-1640 (contendo glutamina, sem bicarbonato e com vermelho de fenol como indicador de pH). O meio de cultivo deve ser tamponado at o pH 7,00,1, sendo que o tampo no pode antagonizar o agente antifngico, o que acontece

freqentemente com tampo Tris e fosfatos. No teste das diluies do agente antifngico, utiiza-se uma microplaca de 96 poos com diluies seriadas. Faz-se tambm um poo de controle contendo somente o meio RPMI-1640 sem o agente antifngico. Para preparar o inculo, pode-se preparar suspenses aceitveis de esporangiosporos e condios no germinados atravs do uso do espectrofotmetro, medindo uma concentrao de 0,4x10 4 a 5x104 UFC/mL. A induo da formao de esporangiosporos e condios deve-se cultivar o fungo em meio gar batata-dextrose por 7 dias 35C. Aps esse perodo cobrir as colnias com 1 mL de soluo salina

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0,85% estril e mexe-se levemente a suspenso com uma pipeta. No caso de espcies de Aspergillus adiciona-se 0,01 mL de Tween 20 para a preparao do inculo. Retira-se essa suspenso de condios ou esporangiosporos e fragmentos de hifas e coloca-se em tubos de ensaio estreis. Espera-se os fragmentos mais pesados se depositarem no fundo e transfere-se o sobrenadante para outro tubo (NCCLS, 2002). A densidade ptica dessas solues pode ser lida e ajustadas para 0,09-0,11 (transmitncia 80-82%) para espcies de Aspergillus e S. schenckii e para 0,15-0,17 (transmitncia de 68 a 70%) para espcies de Fusarium, P. boydii e R. arrhizus . Essas suspenses podem ento ser inoculadas em meio padro num fator de 1:50, resultando numa soluo final igual ao dobro do desejado. Durante o teste, a microplaca inoculada com 0,1 mL da soluo de inculo com o dobro da concentrao e 0,1 mL da soluo contendo o antifngico. A incubao ocorre 35C sem agitao. Aps um determinado tempo de crescimento para cada espcie, l-se o resultado visualmente. Atribui-se um escore numrico dependendo do crescimento obtido comparado com o controle: 4 para nenhuma reduo no crescimento, 3 para uma ligeira reduo (aproximadamente 75% do crescimento do controle), 2 para uma reduo proeminente do crescimento (50% em relao ao controle), 1 para 25% e 0 para a ausncia de crescimento. A partir desse mtodo tambm possvel determinar a CMI (NCCLS, 2002). 4- ANTIVIRAIS

Compostos com propriedades antivirais podem ter a sua atividade avaliada in vitro segundo o teste realizado por NARUSE et al., 1991. Os pesquisadores testaram a atividade de vrias fraes de fluvirucinas atravs do mtodo de absoro de corante. Para o teste utilizou-se o vrus da influenza tipo A infectando clulas MDCK (Madin Darby canine kidney). A suspenso celular de 200L contendo 2x104 clulas foi inoculada em poos de uma microplaca de 96 poos e cultivada 37C por 48 a 72 horas em umidade de 5% e ambiente com 95% de CO 2. O meio em cada poo foi ento substitudo por 250L de meio fresco contendo o composto antiviral e 50L de meio contendo aproximadamente 10x50% de uma dose de cultura tecidual infectada com o vrus. Para os testes de citotoxicidade, tambm foram preparados poos sem o vrus, mas com o antiviral.

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Depois de 72 horas de incubao determinou-se os nveis de inibio do vrus e a citotoxicidade da droga. A concentrao do antiviral com 50% de inibio do vrus (ID50) e a concentrao com 50% de citotoxicidade contra celulas MDCK no infectadas (TD50) tambm foram determinados. Todos os compostos apresentaram atividade inibitria do desenvolvimento do vrus. A leitura do resultado feita atravs de um corante (como a soluo de vermelho neutro) que somente absorvido por clulas viveis. Aps a incubao com o corante, as clulas foram duas vezes lavadas com PBS para retirar o corante que no foi absorvido e ento lisadas. A concentrao do corante que se encontrava no interior das clulas pode ser determinada colorimetricamente em 540nm (PIDOT, 1971). 5- ANTIOXIDANTES

Antioxidantes so compostos capazes de reduzir a ao de espcies reativas de oxignio (radicais livres) que podem causar danificao em tecidos. A formao de radicais livres est associada com o metabolismo natural das clulas, pois o consumo do oxignio durante o crescimento celular acaba gerando compostos que acabam interagindo com lipdios e produzindo radicais livres na forma de superxidos, hidroxilas e perxidos. Esses novos compostos so citotxicos quando interagem com sistemas biolgicos (BARROS et al., 2007). Devido a esse problema, busca-se constantemente compostos como flavonides e fenis que possuem atividade antioxidante devido propriedade redox dos grupos hidroxila e a relaes estruturais das diferentes partes da sua estrutura qumica. Atualmente so usados muitos produtos naturais com atividade antioxidante, sendo que sua procura no mercado cada vez mais alta. Eles so muito importantes na indstria cosmtica, farmacutica, e alimentcia. Eles tambm so usados para aumentar o tempo de prateleiras de alimentos pois retardam o processo de peroxidao de lipdeos, que um dos principais problemas na deteriorao de alimentos (BARROS et al., 2007). Produtos naturais com propriedades bioativas esto presentes em extratos de plantas e cogumelos, que possuem muitas vezes uma grande quantidade de compostos antioxidantes. Foi observada uma correlao entre o contedo total de fenis e a atividade antioxidante pois eles conseguem diminuir a quantidade de

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radicais livres, mas outras substncias como tocoferis e -caroteno tambm aumentam a atividade antioxidante (KITZBERGER et al., 2007).

5.1- MTODO DA CAPTURA DE RADICAIS LIVRES DE DPPH

A determinao da atividade antioxidante pode ser feita atravs do mtodo do radical livre de DPPH, descrito por Mensor et al., 2001 (citado por BENTO e colaboradores). Primeiramente so feitas diluies do caldo ou extrato em etanol. Aps ocorre a adio de 2,5 mL de cada amostra a 1 mL de soluo de DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil-hidrato) 0,03mM. Aps 30 minutos de reao, l-se a absorbncia em 518nm e calcula-se a atividade atravs da frmula: AA % = 100 {[(Absamostra Absbranco) x 100]/ Abscontrole}

(1)

onde AA a atividade antioxidante, Absamostra a absorbncia do tubo preparado com amostra e reagente, Absbranco a absorbncia do branco que contm 2,5 mL de amostra e 1 mL de etanol, e Abscontrole a absorbncia do tubo controle negativo que contm somente 2,5 mL de etanol e 1 mL de DPPH (BENTO et al.). Um controle positivo pode ser feito com substncias j conhecidas que apresentam ao antioxidante como rutin ou extrato de Ginkgo biloba EGb 761 (KITZBERGER et al., 2007; VINCENTINO e MENEZES). A soluo de DPPH possui uma colorao roxa intensa, e quando h atividade antioxidante, ocorre um progressivo descoloramento da soluo at se atingir uma cor amarelada. Atravs de uma regresso linear, logartmica ou exponencial dos resultados das diluies, calcula-se a concentrao necessria para se obter 50% do efeito antioxidante mximo estimado de 100% (CE50), ou seja, a concentrao da soluo testada em que ocorre 50% da diminuio da absorbncia em comparao com o branco (VINCENTINO e MENEZES).

5.2- DETERMINAO DE COMPOSTOS FENLICOS TOTAIS

Como

foi

mencionado

anteriormente,

atividade

antioxidante

est

relacionada quantidade de fenis presente na amostra. Para se determinar essa quantidade de compostos fenlicos pode-se utilizar o mtodo de Folin-Denis. Esse

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mtodo utiliza o reagente Folin-Denis, o qual preparado com uma soluo de tungstnio de sdio desidratado, cido fosfrico de molibdato, e cido fosfrico em gua, de acordo com o mtodo 9110 da AOAC (KITZBERGER et al., 2007). Primeiramente faz-se uma curva padro com cido tnico (de 0,1 a 1,0 mg/ 100 mL), com a adio de 5 mL de Folin-Denis e 10 mL de carbonato de sdio saturado. Aps filtra-se cada uma das solues e l-se a absorbncia em espectrofotmetro 760nm. A determinao do contedo das amostras pode ento ser feita atravs da dissoluo de 5mg de um extrato em 1 mL de etanol e adicionando os outros reagentes conforme feito para a curva padro. A soluo para branco consiste somente na adio do reagente Folin-Denis sem a amostra. O contedo total de fenis na amostra calculado em equivalentes de cido tnico (ETA) atravs da frmula:

Contedo fenlico (g ETA/ 100g extrato) = leitura (mg/mL) x 10 peso da amostra (g)

(2)

onde a leitura em mg/mL corresponde ao valor correspondente da concentrao de cido tnico obtida atravs da curva padro utilizando a absorbncia da amostra (KITZBERGER et al., 2007).

5.3- DETERMINAO DE CIDO ASCRBICO

A determinao de cido ascrbico, que tambm um poderoso antioxidante pode ser feita atravs do mtodo de Klein e Perry (1982). Nesse teste, 1 mL da amostra misturado com 9 mL de 2,6-diclorofenolindofenol. Aps 30 minutos de reao, l-se a absorbncia em 515nm contra o branco. A quantidade de cido ascrbico calculada atravs da curva padro com cido ascrbico comercial (0,020 a 0,12 mg/mL) (BARROS et al., 2007). 5.4 DETERMINAO DA INIBIO DE HEMLISE

Um outro teste possvel de ser feito tambm a inibio da hemlise de eritrcitos devido ao agente antioxidante. Utiliza-se sangue de carneiro e separa-se os eritrcitos do plasma. Eles so ento lavados trs vezes com 10 mL de PBS

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10mM (phosphate buffer saline) em pH 7,4. Aps, 0,1 mL de uma suspenso de 20% de eritrcitos em PBS adicionado a 0,2 mL de 2,2 -azo-bis(2amidinopropano)dihidroclorido (AAPH) 200mM e 0,1mL da soluo com antioxidante a ser testada. Agita-se levemente a soluo (30 rpm) enquanto incuba-se 37C por 3 horas. A soluo ento diluda com 8 mL de PBS e centrifugada 3000g por 10 minutos. O sobrenadante recolhido e sua absorbncia lida em 540nm aps a filtrao filtro de seringa (membrana de celulose 30mm, 0,20m, Titan). A porcentagem de inibio da hemlise calculada pela equao: Inibio de hemlise % = [(AAAPH AS)/AAAPH] x 100

(3)

onde AS a absorbncia da amostra contendo o antioxidante e A AAPH a absorbncia da amostra controle sem antioxidante (BARROS et al., 2007).

6- ANTITUMORAIS

Na procura de microrganismos produtores de compostos antitumorais, tem se destacado os fungos da classe dos Basidiomycetes. Eles so utilizados na medicina e alimentao oriental h muitos anos, sendo que alguns dos mais conhecidos so o lingzhi (Ganoderma lucidum), shiitake (Lentinus edodes), yiner (Tremella ficiformis) e himematsutake (Agaricus brasiliensis). Os testes antitumorais j foram feitos em trs modelos de roedores diferentes, e eles apontam que os polissacardeos isolados de 22 espcies de cogumelos e de 50 meios de cultivo apresentaram efeito inibidor de clulas tumorais como Sarcoma S-180, cncer de Ehrlich, Sarcoma 37, Sarcoma de Yoshida, carcinoma de pulmo de Lewis, adenocarcinoma 755 e leucemia L-1210. Tambm j foi testado o efeito dos polissacardeos em culturas de clulas de mamferos (ZHANG et al., 2007).

6.1- TESTES in vivo

A experimentao em animais exige muito cuidado, principalmente com relao a princpios ticos e de segurana. Existe uma definio dos 3 Rs da experimentao animal formulados por Russel e Burtch em 1957, para mostrar algumas idias que deve-se ter em mente ao planejar um experimento desse tipo:

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REPLACE: substituir a experimentao animal por mtodos alternativos (testes in vitro com culturas de clulas e tecidos, ou simulaes em computadores quando possvel).

REDUCE: diminuio do nmero de pesquisas utilizando animais e do nmero de animais durante o experimento (aumentando as aplicaes estatsticas).

REFINE: aperfeioamento das tcnicas de modo a minimizar a dor e o sofrimento dos animais (com condies de analgesia e assepsia).

No Brasil ainda no existe nenhuma norma que exija a avaliao dos projetos de pesquisas que utilizam animais a um Comit de tica em Pesquisa, mas vrias instituies j exigem esse critrio para o desenvolvimento de um experimento em animais. Os projetos de pesquisa so avaliados de acordo com a relevncia cientfica ou pedaggica e finalidade, justificativa da espcie e nmero de animais, origem dos animais (caractersticas sanitrias e fisiolgicas), destino dos animais aps o experimento, condies das instalaes, mtodos de sacrifcio (analgesia para limitar a dor e o sofrimento dos animais), coleta dos materiais biolgicos, e, quando houver a manipulao de material biolgico, a avaliao da biossegurana (RAYMUNDO & GOLDIM). Um dos animais de experimentao utilizados nesse teste so os camundongos (Mus musculus domesticus), os quais podem ser criados em biotrios, tm uma fcil criao, manipulao, reproduo e diversidade gentica. Atravs de cruzamentos entre irmo pode-se obter linhagens isognicas, diminuindo a variabilidade que poderia interferir durante um teste (SOARES, de CARVALHO & dos SANTOS, 2001). Para testes in vivo pode-se utilizar linhagens especiais de camundongos modificados geneticamente. A obteno dessas linhagens pode ser feita atravs de knockouts e mutaes induzidas por agentes qumicos e fsicos. Estima-se que existam mundialmente 2000 linhagens diferentes, sendo que algumas das mais importantes so: Swiss: camundongos que possuem o sistema imunolgico normal. Balc/c: possuem capacidade de expresso de antgenos limitada.

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Nude: camundongos imunodeficientes desprovidos de plos, incapazes de rejeitarem implantes de doadores no-histocompatveis e transplantes xenogenticos. Essa caracterstica devida ausncia de timo, no apresentando clulas T, somente clulas B, NK e macrfagos. Essa linhagem de camundongos pode ser utilizada como receptora de clulas e tecidos humanos, e como modelo in vivo para teste de drogas em neoplasias humanas.

Scid: camundongos sem a presena de clulas B e T, mas com clulas NK.

Cada linhagem apresenta acima tem uma susceptibilidade distinta, permitindo investigar o mecanismo da doena e do tratamento atravs da comparao interlinhagens. (SOARES, de CARVALHO & dos SANTOS, 2001). Durante o manejo de camundongos deve-se ter um local adequado para a criao, geralmente um biotrio, que apresenta condies adequadas de temperatura, umidade, iluminao, ventilao, exausto e filtrao do ar. As gaiolas devem ter uma densidade populacional adequada e devem ser periodicamente limpas para ter-se nveis de amnia aceitveis. Os camundongos utilizados devem ser livres de organismos patognicos para ter-se confiana nos resultados e eles dever ser devidamente identificados. O manejo dos animais precisa ser feito de forma adequada para evitar estresse dos animais. A Figura 7 exemplifica um tipo de gaiola utilizada em biotrios e a coleta de material tumoral asctico de Sarcoma 180 quinze dias aps a inoculao.

Figura 7- Criao de camundongos (esquerda) e retirada de tumor asctico (direita)

Fonte: Figuras do autor.

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Os polissacardeos produzidos por fungos atuam no organismo ativando vrias respostas imunes, causando nenhum dano ao corpo. O mecanismo de ao dos polissacardeos envolve: a preveno da oncogenese atravs da administrao oral do polissacardeo; o aumento da atividade imunolgica em organismos que j possuem o tumor; e ao antitumoral direta, induzindo apoptose das clulas tumorais. O mecanismo de ao preventiva foi estudado por Ikekawa (2001), ao administrar raes com o polissacardeo para um grupo de camundongos normais e para outro grupo sem polissacardeo. Depois inoculou-se o tumor e observou-se que no grupo com polissacardeo teve menos camundongos que desenvolveram o tumor (ZHANG et al., 2007). Figura 8- Mecanismo da ativao do sistema imune pela -glucana de L. edodes

Legenda: Mac = macrfagos; TL(H) = linfcito T (helper); NK = clulas natural killer; IL-1, -2, -13 = interleucina-1, -2, -13; CSF = fator estimulador de colnia; MAF= fator de ativao de macrfagos; PC-TL= pr-linfcito T citotxico; CTL= linfcito T citotxico; BL= linfcito B.

Fonte: MORADALI et al., 2007.

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A ativao do sistema imune pode ocorrer como proposto por Chiara (1992) presente na Figura 8. O polissacardeo produzido por L. edodes (lentinan) promove a potencializao da resposta de precursores de clulas T e macrfagos a citocinas produzidas por certos grupos de linfcitos aps o reconhecimento de clulas tumorais e ativao de clulas T helper que permaneciam desativadas. Ocorre tambm um aumento de TNF- (fator de necrose tumoral), IL -1 (interleucina 1), IL-1 (interleucina 3) e IFN (interferon) devido ao maior maturao, desenvolvimento, e proliferao das clulas do sistema imune causada pela presena do polissacardeo. Esses entre outros efeitos so importantes para a rejeio de um tumor pelo organismo (ZHANG et al., 2007).

6.2- TESTES in vitro

A realizao de testes in vitro propicia a visualizao da possvel ao do polissacardeo diretamente em clulas tumorais. A incubao clulas tumorais na presena de polissacardeos pode promover uma mudana na expresso de sinais dentro das clulas tumorais, mudando seu ciclo celular e causando apoptose. J foram realizados testes com clulas de cncer de mama MAD-MB-231 na presena de um complexo polissacardeo-peptdeo de Trametes versicolor que reduziu significativamente a sua proliferao em comparao com o controle. O polissacardeo de Phellinus linteus tambm teve ao antiproliferativa em clulas de cncer de colon humano (ZHANG et al., 2007). Esses testes mostram que o polissacardeo pode no somente estimular a proliferao de linfcitos T, mas tambm atuar diretamente nas clulas tumorais. No entanto, pouco se sabe ainda sobre o efeito a nvel celular. Existe tambm o teste de BIA (biochemical induction assay). Ele consiste num teste semi-automatizado colorimtrico na pesquisa de agentes antitumorais que atuam diretamente na sntese do DNA. Elespuru e White (1983) investigaram a presena de compostos antitumorais em culturas de actinomicetos. Eles realizaram testes in vitro primeiramente para selecionar um nmero menor de amostrar para o teste in vivo. Para o teste in vitro utiliza-se uma cepa de Escherichia coli tem o gene lacZ fusionado com uma seqncia de fago . Induo do profago medida pela aparncia de -

galactosidase, produto do gene lacZ, e aparecimento de colorao no meio.

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Primeiramente faz-se um cultivo da bactria at a densidade ptica adequada e mistura-se com uma pequena quantidade de gar. A mistura despejada em uma placa para bioensaios (243x243mm) que j contm previamente 330mL de gar j solidificado. Espera-se a nova camada solidificar e adiciona-se a substncia a ser testada. Esse procedimento pode ser feito de trs maneiras diferentes, como mostra o artigo em anexo 3: atravs do um pipetador multicanal ou atravs da passagem da amostra em um filme de cromatografia e depositando o filme sobre a camada de gar (ELESPURU & WHITE,1983). Aps incubao, adiciona-se mais uma camada de gar contendo o sal Fast Blue RR e BMG, que proporcionaram a visualizao dos resultados. Espera-se de 10 a 15 minutos e observa-se se h a formao de colorao. Se houver cor, significa que h a presena de compostos que danificam o DNA. Quando a concentrao do composto anticancergeno for muito alta, pode haver a formao de um anel (ELESPURU & WHITE,1983). 7- ANTIPARASITRIOS

O estudo de agentes antiparasitrios e de extrema importncia para a sade pblica. Segundo a Organizao Mundial da Sade (OMS), mais de um bilho de pessoas est infectada cronicamente por helmintos, e dois bilhes vivem em regies de situao de risco de infeco. Esse situao extremamente grava em pases de baixa renda, onde aproximadamente um tero da populao est em lugares com condies favorveis a disseminao dessas doenas (BERTOLDI, KOPP e SANCHIS, 2005). GOETZ et al. (1985) testou um antiparastico produzido por Streptomyces hygroscopicus eficiente no combate a Hymenolepis diminuta. Este um parasito que infecta preferencialmente ratos, sendo que o ser humano pode ser um hospedeiro acidental (Figura 9). O microrganismo selecionado pelos pesquisadores havia sido isolado do solo e depois registrado no banco da ATCC com a numerao 31955. O composto antiparasitrio foi produzido atravs de fermentao e depois purificado. O teste de sua propriedade biolgica foi feito em ratos que haviam sido infectados com 8 cisticercos 12 dias antes do incio do tratamento. Um grupo recebeu antiparasitrio e

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o outro o placebo atravs de uma dose nica oral. Aps 6 dias foi feita a necropsia para verificao do resultado. O composto apresentou boa atividade contra o verme.

Figura 9- Ciclo biolgico de Hymenolepis diminuta

Fonte: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx

BURG et al. (1979) testou avermectinas produzidas por actinomicetos da espcie Streptomyces avertimilis. Essa substncia produzida apresenta atividade antihelmintica, mas no tem efeito antibacteriano e antifngico significativo. O complexo da avermectina ativo contra uma variedade de nematdeos. Nesse artigo, os pesquisadores testaram contra o nemetda gastrintestinal

Nematospiroides dubius, que usado como modelo de infeces helmnticas em camundongos. No teste, camundongos foram infectados com o parasito e receberam rao por seis dias contendo o antiparastico na concentrao de 0,0002. Depois eles retornaram alimentao normal e 14 dias aps a infeco observou-se a ausncia de ovos e vermes. Com relao procura de substncias eficazes contra a doena de Chagas e Leishmaniose, ELIAS (2003) testou extratos do fungo Penicillium verrucosum contra

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a enzima GAPDH de T. cruzi e a APRT de L. tarentolae. Os ensaios antiparasitrios foram realizados em amostras sangneas de ratos que haviam sido inoculados com o parasito T. cruzi. O teste foi feito em microplaca de 96 poos, onde havia 2x10 6 formas tripomastigotas do parasito por mL e o extrato fngico. Aps a incubao de 24 horas, contou-se o nmero de parasitos em comparao com o controle negativo (ao invs do extrato utilizou-se dimetilsulfxido) e o controle positivo (que continha violeta de genciana no lugar do extrato). A ao direta do extrato sobre a enzima foi investigada atravs de mtodo espectrofotomtrico. A enzima foi isolada de E. coli recombinante produtora da enzima GAPDH de T. cruzi. Mediu-se a formao de NADH formado em 30 segundos 340nm. A atividade da enzima APRT foi medida atravs da produo de ATP em 60 segundos e leitura 259nm. Os resultados obtidos mostraram que alguns extratos so ativos contra a forma tripomastigota de T. cruzi, provocando uma lise de 50% ou mais das clulas. A inibio enzimtica parcial ocorreu somente em alguns dos extratos. 8- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards. Padronizao dos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos por Disco-difuso: Norma Aprovada Oitava Edio. M2-A8, Vol. 23 N 1. ANVISA, Janeiro de 2003. ISBN 1-56238485-6, ISSN 0273-3099. NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards. Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade a Terapia Antifngica dos Fungos Filamentosos: Norma Aprovada. M38-A, vol. 22, No. 16. ISBN 1-56238-470-8, ISSN 0273-3099. ANVISA, 2002.

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9- ANEXOS

ANEXO 1

DETECO DE BACTERIOCINAS PRODUZIDAS POR BACTRIAS FITOPATOGNICAS DOS GNEROS Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas

C. M. R. de BIAGI & J. L. de AZEVEDO

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ANEXO 2

ANTIOXIDANT AND ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF SHIITAKE ( Lentinula edodes) EXTRACTS OBTAINED BY ORGANIC SOLVENTS AND SUPERCRITICAL FLUIDS

CNTIA SORANE GOOD KITZBERGER, ARTUR SMNIA JR., ROZANGELA CURI PEDROSA, SANDRA REGINA SALVADOR FERREIRA

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ANEXO 3

BIOCHEMICAL PROPHAGE INDUCTION ASSAY: A RAPID TEST FOR ANTITUMOR AGENTS THAT INTERACT WITH DNA

R. K. ELESPURU & R. J. WHITE