Relatório de Estagio

Agradecimentos
O relatrio de estgio devido sua natureza tem o contributo de muitas pessoas. Desta
forma cabe-me aqui agradecer a inestimvel colaborao de todos que, de forma directa
ou indirectamente, contriburam para realizao do relatrio, sem os quais teria sido
mais difcil chegar at este momento, particularmente:
Professora Doutora Isabel Brs, orientadora deste relatrio, pelo incansvel
apoio, disponibilidade, motivao, pacincia e empenho mostrado em ajudar a realizar o
estgio. Aos conhecimentos tcnicos e cientficos transmitidos a que ficarei eternamente
agradecida,
Doutora Ana Martins por me ter recebido na sua empresa como estagiaria;
Doutora Elsa Cancela pela disponibilidade, interesse e orientao mostrado
em ajudar na realizao do estgio;
Engenheira Mrcia Tavares pelos conhecimentos tcnicos e cientficos da
cromatografia;
equipa do laboratrio da ControlVet, por me terem recebido de braos abertos
e por estarem sempre prontos a interromper os seus trabalhos para me ajudar quando
fosse necessrio, e pelas amizades criadas.
Gostaria ainda de agradecer todos familiares e amigos por toda amizade, apoio e
pacincia que demonstraram para seguir em frente.

i

Prefcio
Prefcio
As constantes presses da Humanidade os recursos naturais esto a potenciar a
depeleo dos que ainda existem e a torn-los cada vez mais inatingveis devido
elevada poluio. A gua um recurso renovvel cuja qualidade deve ser mantida por
todos ns. Contudo sofre constantemente de descargas de substncias qumicas, detritos
de solo e resduos que alteram a sua qualidade.
Atravs da monitorizao da qualidade das guas, pode-se dar o uso adequado s
mesmas. Para realizar essas anlises, normalmente so utilizados mtodos tradicionais,
exigem tempos e recursos humanos significativos, e os seus limites de deteco no
respondem s exigncias impostas pelos documentos normativos mais recentes.
Com o avano da tecnologia, surgem mtodos analticos instrumentais mais sensveis e
selectivos e com maiores eficincias na deteco e quantificao de compostos em
amostras complexas, tais como os que esto relacionadas com os problemas ambientais
e proteco de alimentos.
Os mtodos instrumentais, apesar de exigirem um elevado investimento em
equipamento, tornam-se bastante competitivos uma vez que este amortizado pela
economia em recursos humanos e reagentes, permite alargar a gama de concentrao
dos elementos detectveis at nveis da ordem de grandeza de parte por milho ou parte
por bilio.

Prefcio

ii

iii

Resumo
Resumo

O estgio, objecto do presente trabalho, foi realizado na ControlVet, empresa
vocacionada para o Controlo Laboratorial Ambiental e Alimentar e que se localiza na
Zona Industrial de Tondela. Este teve a durao de seis meses e meio, com data de
incio a 18 de Novembro de 2010 e final de 31 de Maio de 2011. O laboratrio da
Controlvet Segurana Alimentar, S.A. acreditado pelo IPAC de acordo com a
Norma NP EN ISO/IEC 17025, com o n L0224 e considerado apto pelo ERSAR.
O presente estgio teve como primeiro objectivo adquirir competncias em todo o
processo de controlo da qualidade de gua. Foram observados e realizados um vasto
leque de parmetros em inmeras amostras, todos eles determinados por mtodos
analticos clssicos. Os processos analticos de determinao da amnia, cloretos,
fluoretos, nitratos, nitritos, oxidabilidade, sulfatos e turvao foram os mais estudados,
assim como a manipulao de amostras, instrumentos e reagentes necessrios para a
realizao dos mesmos e ainda a avaliao e interpretao dos resultados obtidos. Foi
feita uma avaliao dos boletins de forma a verificar se cumpre os seus requisitos
descritos na NP EN ISO/IEC 17025:2007.
Outro objectivo que se pretendeu atingir, prendeu-se com o aprofundamento do
conhecimento de um mtodo cromatogrfico e, posteriormente, proceder sua
validao de forma que o laboratrio consiga cumprir os requisitos de ensaios e
calibraes descritos na NP 17025:2007. Para a validao do mtodo, o processo
utilizado consiste em confirmar que o procedimento analtico utilizado para um teste
especfico adequado para o uso pretendido. Os resultados de validao do mtodo so
usados para avaliar a qualidade, fiabilidade e consistncia dos resultados analticos.
Com a realizao do presente estgio foi possvel aplicar os conhecimentos adquiridos
durante o mestrado, e complementarmente na licenciatura em Engenharia do Ambiente,
ao nvel da caracterizao e classificao de diferentes matrizes ambientais,
aprofundamento do conhecimento de mtodos instrumentais de anlise e aplicao de
sistemas de normalizao.

Resumo

iv

Palavras-chave: Controlo de Qualidade, Ensaios Laboratoriais, HPLC, Processo de
Validao; Clculo de Incerteza.

v

Abstract
Abstract

The preset report describes the tasks and knowledge acquired in ControlVet, an
independent laboratory dedicated to the environmental and food control quality, located
in Tondela industrial area. The work was developed between November 18
th
, 2010 and
May 31
th
, 2011. Controlvet laboratory - Food Safety SA is accredited by IPAC in
accordance with standard NP EN ISO / IEC 17025, with No. L0224.
This stage had as its primary objective to acquire skills in the process of monitoring the
water quality. A wide range of parameters in a several samples were performed,
following classical analytical methods. The analytical methods for ammonia, chlorides,
fluorides, nitrates, nitrites, oxidizability, sulfate and turbidity were the most studied, as
well as the technical procedures for samples handling, instruments and reagents needed
and still the results evaluation and interpretation. A technical report is presented to
exemplify how the information is reported to the client. The Controlvet technical reports
must follow the NP EN ISO / IEC 17025:2007, and a critical approach is performed to
assess if these requirements are attained.
Another purpose to be accomplished during the work period, held with in-depth
knowledge of a chromatographic method as well as the method validation and
calculation of uncertainties associated with these determinations. These actions are a
key factor so that the laboratory can meet the requirements described in NP
17025:2007. The fundamental aim of the method validation is to have procedures to
ensure the laboratory's customers that analytical development used for a specific test is
suitable for its intended. The results of the validation method are used to evaluate the
quality, reliability and consistency of analytical results.
Along the working period it was possible to apply the knowledge acquired during the
master course in Environmental Technologies and in the Environmental Engineering
bachelor, at the level of characterization and classification of different environmental
matrices, a deeper knowledge of analytical instrumental methods and application of
standardization systems.

Abstract

vi

Key Words: Quality control, Laboratory Testing, HPLC, Validation Process;
Calculation of Uncertainty.

vii

ndice
ndice

Prefcio .............................................................................................................................. i
Resumo ............................................................................................................................ iii
Abstract ............................................................................................................................. v
ndice .............................................................................................................................. vii
ndice das Figuras ............................................................................................................ ix
ndice das Tabelas ........................................................................................................... xi
Abreviaturas................................................................................................................... xiii
1. Introduo.................................................................................................................. 1
1.1. Caracterizao da Empresa ................................................................................ 1
2. Qualidade em Laboratrios de Ensaio ...................................................................... 5
2.1. Processo de Validao de Mtodos Analticos .................................................. 7
2.1.1. Linearidade ................................................................................................. 8
2.1.2. Limite de Deteco e Limite de Quantificao .......................................... 9
2.1.3. Estudo de Repetibilidade .......................................................................... 11
2.1.4. Preciso Intermdia .................................................................................. 12
2.1.5. Teste de Recuperao ............................................................................... 13
2.1.6. Estabelecimento do Critrio de Aceitao do Branco .............................. 13
2.1.7. Avaliao da Exactido ............................................................................ 14
2.1.8. Incertezas .................................................................................................. 15
3. O Controlo de Qualidade de gua .......................................................................... 19
3.1. Quadro Legal Aplicado Qualidade da gua ................................................. 20
3.2. Metodologias Analticas .................................................................................. 21
3.2.1. Amnia ou Azoto Amoniacal, NH
4
+
........................................................ 26
3.2.2. Cloretos, Cl
-
.............................................................................................. 27
ndice

viii

3.2.3. Fluoretos, F
-
.............................................................................................. 29
3.2.4. Nitratos, NO
3
-
........................................................................................... 31
3.2.5. Nitritos, NO
2
-
............................................................................................ 32
3.2.6. Oxidabilidade ........................................................................................... 34
3.2.7. Sulfatos, SO
4
-
............................................................................................ 36
3.2.8. Turvao ................................................................................................... 37
3.3. Apresentao de Resultados ............................................................................ 39
4. Caso de Estudo Validao de uma Metodologia Analtica .................................. 43
4.1. Mtodos de Determinao de Acares ........................................................... 43
4.2. Aplicao da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia, HPLC ..................... 47
4.3. Metodologias Analticas .................................................................................. 49
4.3.1. Equipamentos ........................................................................................... 49
4.2.2 Mtodo Analtico ...................................................................................... 50
4.3 Apresentao dos Resultados ........................................................................... 50
Concluso ....................................................................................................................... 63
Bibliografia ..................................................................................................................... 65
Anexo A: Tabela da distribuio F de Snedecor/Fisher ................................................. 73
Anexo B: Critrios de Controlo de Qualidade................................................................ 75
Anexo C: Boletins exemplificativos ............................................................................... 83
Anexo D: Determinao do Limite de Quantificao .................................................... 91
Anexo E: Exemplificao do clculo de incerteza ......................................................... 93

ix

ndice das Figuras
ndice das Figuras
Figura 1: Logtipo da ControlVet .................................................................................... 2
Figura 2: Representao da Empresa ControlVet............................................................. 3
Figura 3: Esquema representativo do processo HPLC ................................................... 48
Figura 4: Cromatograma representativo dos padres de acares: frutose (a) a 4,72 min;
glucose (b) a 5,90 min; sacarose (c) a 11,15 min; maltose (d) a 14,27 min e lactose (e) a
17,05 min. ....................................................................................................................... 51
Figura 5: Cromatograma representativo de uma amostra: torta de morango. Onde:
frutose (a); glucose (b); sacarose (c) e maltose (d). ........................................................ 52
Figura 6: Variao da rea dos picos em funo da concentrao dos padres dos
acares .......................................................................................................................... 53
Figura 7: Variao da incerteza global em funo da concentrao .............................. 61

ndice das Figuras

x

xi

ndice das Tabelas
ndice das Tabelas
Tabela 1: Cronograma temporal do estgio ...................................................................... 3
Tabela 2: Composio e tipos de conservantes que constituem o kit genrico .............. 23
Tabela 3: Composio e tipos de conservantes que constituem o kit de controlo de
inspeco ........................................................................................................................ 24
Tabela 4: Previa preparao da amostra para determinados parmetros em anlise ...... 25
Tabela 5: Critrios do controlo de qualidade para a aplicao do mtodo analtico. ..... 39
Tabela 6: Caracterizao das rectas de calibrao dos acares e os respectivos factores
de correlao ................................................................................................................... 53
Tabela 7: Valores de para os acares .......................................................... 54
Tabela 8: Parmetros do processo de validao do mtodo analtico (repetibilidade
avaliada em amostras de sumo) ...................................................................................... 57
Tabela 9: Variao da incerteza percentual em funo da concentrao ....................... 60
Tabela A 1: Distribuio F de Snedecor/Fisher com percentual de 99% ....................... 73
Tabela B 1: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de amnia
em guas ......................................................................................................................... 75
Tabela B 2: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de cloretos
em guas ......................................................................................................................... 76
Tabela B 3: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de fluoretos
em guas ......................................................................................................................... 77
Tabela B 4: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de nitratos
em guas ......................................................................................................................... 78
Tabela B 5: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de nitritos
em guas ......................................................................................................................... 79
Tabela B 6: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de sulfatos
em guas ......................................................................................................................... 80
Tabela B 7: Critrios de controlo de qualidade para a determinao da turvao em
guas ............................................................................................................................... 81
ndice das Tabelas

xii

Tabela D 1: Resultados do Limite de Quantificao ...................................................... 91
Tabela E 1: Erros associados ao material usado na preparao das solues padres dos
acares (frutose, glucose e sacarose) ............................................................................ 93
Tabela E 2: Exemplificao e valores do clculo da incerteza associada preparao
dos padres dos acares (frutose, glucose e sacarose).................................................. 93
Tabela E 3: Valores experimentais dos parmetros , , e a incerteza associada
curva de calibrao, , (m=1 e n=6) ............................................................................ 94
Tabela E 4: Resultados de repetibilidade dos acares: frutose, glucose e sacarose ..... 95

xiii

Abreviaturas
Abreviaturas
CDTA cido 1,2-ciclohexileno-dinitro-tetraactico;
CV Coeficiente de Variao;
DP Desvio Padro;
ESI - Electrospray Ionization;
FIA Flow-Injection Spectrophotometric Determination;
FL Fluorescncia;
FM Fase Mvel;
HPAEC - High-performance Anion-Exchange Chromatography;
HPLC - High-Performance Liquid Chomatograph;
HPRPLC - High-Performance Reversed-Phase Liquid Chromatography;
IV Infravermelho;
LC - Liquid Chromatography;
LD Limite de Deteco
LQ Limite de Quantificao;
MDL Microware Digestion Labstation;
MRC Materiais de Referncia Certificada;
MS - Mass Spectrometry;
NED N(1-naftil)-1,2-etilenodiamina;
NTU Nephelometric Turbity Unit;
PAD - Pulsed Amperometric Detection;
Abreviaturas

xiv

PLS Partial Least-Squares;
PC Padro Controlo;
RID Refractive Index Detectors;
UHPLC Ultra High-Performance Liquid Chromatography;
UV Ultra-Violeta;

1

Introduo
1. Introduo

O presente trabalho foi elaborado no mbito da primeira edio do Mestrado em
Tecnologias Ambientais, leccionado na Escola Superior de Tecnologia e Gesto de
Viseu, do Instituto Politcnico do Viseu. Teve como objectivo principal a aplicao de
metodologias analticas para controlo de qualidade de guas superficiais e de consumo e
a validao de mtodos cromatogrficos. O estgio decorreu no perodo de 18 de
Novembro de 2010 e 31 de Maio de 2011 na ControlVet.
A empresa localiza-se na Zona Industrial de Tondela e destaca-se por desenvolver
solues e servios ambientais inovadores, de forma a apoiar os seus clientes e lhes
permitir cumprir com todos os requisitos legais, promovendo o desenvolvimento
sustentvel de toda a envolvente. A ControlVet aposta ainda, em uniformizar critrios
decorrentes da acreditao de laboratrios de ensaios qumicos, e das prprias
metodologias, nomeadamente a validao das metodologias analticas e a quantificao
da incerteza da medio.

1.1. Caracterizao da Empresa
A ControlVet um grupo empresarial de viso ibrica que desenvolve a sua actividade
na rea da Segurana Alimentar, Ambiente e Biotecnologia. O grupo iniciou a sua
actividade em Maro de 1999, na Zona Industrial de Tondela. Actualmente constitudo
por um conjunto de empresas localizadas em zonas como Tondela, Aveiro, Coimbra,
Beja e Madrid (Espanha); nomeadamente a ControlVet Segurana Alimentar (CSA),
ControlVet Consultoria Tcnica (CCT), Inogen, Ecogeo, ControlVet Genetics e
Alicontrol, em Espanha (ControlVet Segurana Alimentar, 2009).
A ContralVet presta servios de assistncia tcnica produo primria, servios de
consultoria e formao, e um organismo independente de controlo (OIC), com
reconhecimento do Ministrio da Agricultura.
A expanso da ControlVet caracteriza-se pela sua solidez empresarial, pela dedicao e
empenho ao Cliente e pela inovao de processos e servios, o que tem permitido o
Introduo

2

crescimento sustentado e a preferncia de mais de 3.500 clientes. Com base no valor da
marca ControlVet, no Know-how que possui na experiencia acumulada, houve o
crescimento em sistema Franchising atravs da ControlVet-CT Consultadoria
Alimentar. E no final do ano 2006, abriram as primeiras unidades franchisadas.

Figura 1: Logtipo da ControlVet

A ControlVet usufrui de uma unidade laboratorial acreditada pelo IPAC Instituto
Portugus de Acreditao e equipada com tecnologia avanada que colocada aos
servios dos clientes, permitindo uma melhor satisfao dos mesmos.
A unidade laboratorial constituda por trs partes: Microbiologia, Biologia Molecular e
Qumica, um centro tecnolgico de referncia, sendo o nico laboratrio privado em
Portugal que possui e utiliza a tecnologia PCR Real time - Polymerase Chain Reaction,
o que possibilita desenvolver servios inovadores que so usados na pesquisa de
patognicos em microbiologia, deteco de fraudes, identificao de espcies, pesquisa
de organismos geneticamente modificados (OMGs) e melhoramento animal.
Este laboratrio analisa cerca de 100.000 amostras por anos, desde alimentao humana
e animal, soros, guas e efluentes, recorrendo a mais de 500 mtodos implementados,
realizados por uma equipa cerca de 25 colaboradores, onde 11 realizam as suas
competncias na microbiologia e as restantes na qumica (ControlVet Segurana
Alimentar, 2009).

3

Introduo

Figura 2: Representao da Empresa ControlVet

Durante o estgio a primeira fase envolveu a execuo e interpretao de dados
relativos a mtodos analticos de determinao da qualidade das guas j validados
pelos tcnicos do laboratrio e a segunda a aplicao das metodologias de validao a
um mtodo cromatogrfico especfico. O cronograma apresentado na Tabela 1,
demonstra como foi distribudo temporalmente o estgio.

Tabela 1: Cronograma temporal do estgio
Nov Dez Jan Fev Mar Abr Mai
Aplicao de mtodos analticos clssicos
Estudos das metodologias
Preparao de padres / reagentes
Recepo de amostras
Tratamentos das amostras antes
de iniciar os ensaios

Analise das amostras
Lanamento dos resultados para a
elaborao do boletim

Validao de mtodos analticos
Preparao de amostras para
analisar por HPLC

Estudos dos parmetros e
funcionamento do cromatografo

Injeco dos padres e amostras
Anlise de cromatogramas dos
padres e amostras

Introduo

4

De forma a apresentar detalhadamente as tarefas desempenhadas no estgio, elaborou-se
o presente documento que compreende, alm da introduo, onde caracterizado o
trabalho e apresentada a empresa onde decorreu o estgio, trs captulos e a concluso
geral. O primeiro captulo apresenta a descrio dos requisitos de controlo de qualidade
de resultados analticos por parte de laboratrios de ensaio, nomeadamente os requisitos
a preencher por laboratrios acreditados de acordo com a NP EN ISO/IEC 17025:2007.
Os restantes captulos dedicam-se a apresentao de mtodos e discusso de resultados,
nomeadamente relativos aos procedimentos analticos de controlo de qualidade de gua
e da validao do mtodo.

5

Qualidade em Laboratrios de Ensaio
2. Qualidade em Laboratrios de Ensaio
Actualmente, grande parte dos laboratrios de ensaio tentam assegurar a capacidade de
obter resultados fidedignos que garantam aos seus clientes a real caracterizao das suas
amostras. Para conseguir este objectivo devem cumprir com requisitos, tais como:
a. Uso de mtodos validados;
b. Controlo da qualidade;
c. Participao em programas de ensaios interlaboratoriais;
d. Acreditao segundo os requisitos descritos na norma portuguesa, NP EN
ISO/IEC 17025:2007.
Os processos analticos devem ter um acompanhamento constante de forma a garantir a
competncia tcnica na realizao dos ensaios e a autenticidade dos resultados. Por sua
vez, os requisitos normativos ajudam no controlo do rigor na obteno dos resultados de
modo que estes sejam verdicos e confiveis, expresso na incerteza da medio
realizada (Silva, 2008).
A NP EN ISO/IEC 17025:2007 um normativo internacional que salienta os requisitos
gerais de competncias tcnicas para a realizao de ensaios e/ou calibraes de
mtodos normalizados, mtodos no normalizados e mtodos desenvolvidos pelo
prprio laboratrio, incluindo amostragens. Esta norma define, tambm, que os
laboratrios acreditados devem utilizar mtodos validados na realizao das anlises e
que as incertezas envolvidas nos resultados devem ser estimadas. Especificamente, a
seco 5.9 da NP EN ISO/IEC 17025:2007, refere a importncia da garantia da
qualidade de resultados de ensaios e calibraes, uma vez que na execuo dos ensaios
e calibraes, todos os equipamentos e materiais de medida utilizados tm um erro
associado e sem uma determinao quantitativa do erro a medio no tem significado
analtico.
Outro aspecto importante que o normativo adverte o da estimativa da incerteza de
medio, onde indicado que:

6

a) Um laboratrio de calibrao ou um laboratrio de ensaio ao realizar suas
prprias calibraes deve ter e deve aplicar um procedimento para estimar a
incerteza de medio de todas as calibraes e tipos de calibraes;
b) Os laboratrios de ensaio devem ter e aplicar procedimentos para clculo das
incertezas de medio.
c) Quando for estimada a incerteza de medio, todos os componentes de incerteza
que sejam importantes para uma determinada situao devem ser considerados,
empregando-se mtodos apropriados de anlise.
Normalmente, o processo de medio est implementado num sistema de gesto da
qualidade de um laboratrio, porque existem (Silva, 2008):
i. Tcnicos qualificados;
ii. Programas de manuteno e de calibrao de equipamentos;
iii. Reagentes e padres de referncia apropriados;
iv. Procedimentos de medio documentados e padres de verificao.
Deste modo, os processos esto estveis e sob controlo estatstico conseguindo-se com
os clculos das incertezas admitir-se que os erros sistemticos e os fortuitos sejam
desprezados.
Para validao de um mtodo, o processo de determinao das incertezas de medies
composta por um conjunto de actividades, em que os pormenores do processo devem
constatar num procedimento operacional padro do laboratrio, que define
nomeadamente a (Silva, 2008):
1. Modelao do sistema de medio;
1.1. Objectivos da medio;
1.2. Preparao da medio;
1.3. Especificao do mensurado (valor da grandeza medida);

7

2. Determinao da estimativa do valor do mensurado;
3. Identificao das fontes principais de incertezas;
4. Determinao dos valores das fontes de incerteza;
5. Clculo da incerteza - padro e do coeficiente de sensibilidade para cada fonte de
incertezas;
6. Clculo da incerteza combinada;
7. Clculo das incertezas expandida
8. Expresso do resultado.

2.1. Processo de Validao de Mtodos Analticos
O processo de validao tem como objectivo evidenciar que os resultados obtidos
atravs de um mtodo tm qualidade adequada aos fins com que so usados. Este
processo pretende uniformizar os critrios utilizados de modo a demonstrar que um
mtodo de ensaio, nas condies em que exercido, tem as caractersticas necessrias
para a obteno de resultados com a qualidade exigida (Gonzlez et al; 2007).
Os tcnicos laboratrio realizam uma nova validao sempre que exista alguma
modificao susceptvel nas caractersticas do mtodo e na implementao de novos
mtodos de ensaio.
O procedimento da validao de um mtodo de ensaio exige as seguintes avaliaes
(Gonzlez et al, 2007; Taverniers et al, 2004):
1) Avaliao fundamentos tericos do mtodo e adequabilidade aos fins que se
propem validar;
2) Calibrao analtica:
i. Estudo da linearidade da recta de calibrao;
ii. Estudo do limite de quantificao;

8

iii. Estudo da repetibilidade;
iv. Estudo da preciso intermdia;
v. Estudo da sensibilidade e selectividade do mtodo (Ensaio de
recuperao);
3) Estabelecimento de critrios de aceitao de parmetros, tais como, declive,
ordenada na origem, brancos, concentrao de titulante, padro controlo,
recuperao e limite de quantificao;
4) Estudo da Exactido: Participao em ensaios interlaboratoriais ou matrias de
referncia certificado;
5) Clculo de incertezas.

2.1.1. Linearidade
O estudo da linearidade da recta, nos mtodos em que se utiliza uma curva de
calibrao, obriga que o laboratrio avalie a linearidade atravs de um dos modelos
estatsticos descritos na ISO 8466-1/90, nomeadamente:
Preparao dos padres necessrios de acordo com o definido no mtodo de
ensaio e efectuar a sua leitura.
Efectuar o estudo da funo linear e no linear e apuramento dos desvios
padres residuais. Concretamente, esta avaliao faz-se a partir de um conjunto
de pares ordenados (sinal instrumental vs concentrao), calculando-se a funo
de calibrao linear e no linear e os respectivos desvios-padro (DP) residuais,
S
y/x
, S
y2
, respectivamente do seguinte modo:
(1)
(2)
Onde:

9

N Nmero de padres de calibrao
y
i
Sinal obtido para um padro de concentrao i
y
i
Sinal estimado pela funo de calibrao linear para um padro da mesma
concentrao i
y
i2
Sinal estimado pela funo de calibrao polinomial do segundo grau para um
padro da mesma concentrao i

Procedendo ao teste F
calc
, calculando a diferena das varincias (DS
2
) pela
equao seguinte:
(3)
Que permite calcular o valor teste, F
calc.
:
(4)
O valor de F
calc
comparado com o valor tabelado da distribuio F de Snedecor /
Fisher (Anexo A) com um grau de confiana de 99%.
Os critrios de deciso relativos linearidade do mtodo so:
a) Se F
calc
F: a funo de calibrao polinomial no conduz a um ajustamento
significativamente melhor, e por isso, a funo de calibrao linear.
b) Se F
calc
> F: a funo de calibrao no linear e por isso a gama de trabalho
deve ser reduzida tanto quanto possvel de forma a cumprir a alternativa a). Caso
no seja possvel, dever ser utilizada uma funo de calibrao no linear.

2.1.2. Limite de Deteco e Limite de Quantificao
Aps estabelecer a linearidade do mtodo determinaram-se os respectivos limiares
analticos (limite de deteco e limite de quantificao).
O Limite de deteco (LD) o sinal de sada ou o valor de concentrao acima o qual
possvel afirmar, com um nvel declarado de confiana, que uma amostra diferente de

10

uma amostra em branco que no contenha qualquer determinando de interesse (guia
IPAC e ISO 17025). O limite de deteco pode ser calculado por duas formas:
1. Limite de deteco baseado no desvio padro do padro residual.
(5)
Onde S
x0
representa o desvio-padro (DP) correspondente a vrias leituras do branco ou
da soluo com concentrao mais baixa da gama de linearidade (ISO 8466-1/90).
2. Estudo do limite de deteco atravs dos mnimos quadrados da recta de
calibrao
A ISO 8466-1/90 indica ainda que num mtodo analtico que envolve uma calibrao
linear o limite de deteco tambm pode ser calculado atravs do desvio padro residual
da curva de calibrao, atravs da seguinte equao:
(6)
S
y/x
Desvio padro residual da curva de calibrao
b Declive da curva de calibrao

O Limite de quantificao (LQ), por sua vez, corresponde a um mltiplo declarado do
limite de deteco numa concentrao do determinando que se pode razoavelmente
determinar com um nvel aceitvel de exactido e preciso. O limite de quantificao
pode ser calculado utilizando um padro ou uma amostra adequados, e pode ser obtido a
partir do ponto de calibrao mais baixo da curva de calibrao, descontando o branco.
O estudo do limite de quantificao pode ser executado de trs formas:
1) Limite de quantificao baseado no desvio padro de brancos.
Em mtodos analticos gravimtricos e volumtricos, o limite de quantificao calcula-
se atravs do desvio padro residual associado ao padro lido, como descreve a seguinte
equao:
(7)

11

Mdia aritmtica do teor medido de uma srie de brancos ou padres residuais,
no mnimo 10, preparados de uma forma independente e lidos em condies de
preciso intermdia
Desvio padro associado a X
0

2) Estudo do limite de quantificao atravs do primeiro padro da curva de
calibrao
Nos mtodos analticos que envolvem a utilizao de uma calibrao linear, a
determinao do limite de quantificao corresponde a dez leituras do primeiro padro
da curva de calibrao em condies de preciso intermdia. Seguem-se os clculos da
mdia, desvio padro, e avalia-se o erro relativo e coeficiente de variao dos valores
obtidos que devem ser inferiores a 10% caso contrrio outro limite de quantificao ter
que ser estudado.
3) Estudo do limite de quantificao atravs dos mnimos quadrados da recta de
calibrao
O limite de quantificao, em mtodos analticos que necessitam de uma curva de
calibrao, corresponde mais pequena concentrao medida a partir da qual possvel
a quantificao do analito, com uma determinada exactido e preciso, e de acordo com
os resultados obtidos na equao da curva de calibrao determinado pela equao
seguinte:
(8)

2.1.3. Estudo de Repetibilidade
O estudo de repetibilidade consiste na aproximao entre resultados de medies
sucessivas da mesma mensuranda, realizada nas mesmas condies de anlise em curtos
intervalos de tempo, isto o mesmo laboratrios, o mesmo analista, o mesmo
equipamento e o mesmo reagente.


12

Para se determinar a repetibilidade do mtodo efectua-se dez repeties do ensaio nas
condies anteriormente descritas. Para um nvel de confiana de 95%, o limite de
repetibilidade (r) avaliado segundo:
(9)
Sendo, o desvio padro de repetibilidade associada aos resultados considerados.
Pode calcular-se a repetibilidade. Em percentagem de acordo com:
(10)
Onde, representa a mdia das concentraes obtidas no ensaio de repetibilidade.
O coeficiente de variao de repetibilidade (CV
r
), expresso em percentagem, e o erro
relativo da repetibilidade (Er) so determinados pelas respectivas equaes:
(11)
(12)
Considera-se a repetibilidade aceitvel quando o CV

10%

2.1.4. Preciso Intermdia
A preciso intermdia refere a avaliao da preciso sobre uma amostra, amostras
idnticas ou padres, recorrendo ao mesmo mtodo, preferencialmente no mesmo
laboratrio. Contudo, tambm pode ser diferente, mas, neste caso, deve-se definir
exactamente quais as condies susceptveis a variar, tais como: operador,
equipamentos e tempo.
Esta medida de preciso reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos
resultados em um laboratrio por isso, a mais aconselhvel de empregar.
Para determinar a preciso intermdia, para efeitos de validao, o laboratrio efectua
no mnimo 15 ensaios. O valor da preciso intermdia est relacionado com o nvel de
concentrao do ensaio. A preciso intermdia avaliada atravs da seguinte equao:

13

(13)
Considera-se a preciso intermdia aceitvel se CV 20%.

2.1.5. Teste de Recuperao
A recuperao consiste em adicionar amostra um analito de concentrao conhecida.
s amostras pode ser adicionado o analito em pelo menos trs diferentes concentraes,
por exemplo, prximo ao limite de deteco, prximo concentrao mxima
permissvel (incluindo os extremos da gama de linearidade) e uma concentrao
prxima da intermdia da gama de linearidade de uso do mtodo. O valor da
recuperao calculado pela seguinte equao:
(14)
Concentrao final (concentrao da amostra contaminada com o analito)
Concentrao da amostra sem adio do analito
Concentrao do analito adicionado

Desta forma pretende-se avaliar se o mtodo identifica todo o analito adicionado.
Quando os ensaios de recuperao so remetidos com adio de volumes de analito,
deve-se considerar a correco de volumes, da seguinte forma:
(15)
Onde, corresponde ao volume do analito adicionado, e o volume da amostra

2.1.6. Estabelecimento do Critrio de Aceitao do Branco
No mtodo de validao so realizados pelos menos cinco brancos e estabelecido um
critrio de aceitao do branco com base nos valores obtidos, ou seja, a mdia dos

14

resultados dos brancos mais ou menos duas vezes seu desvio padro. Este valor final
deve ser igual ou inferior a um tero da leitura do limite de quantificao ou do primeiro
padro.

2.1.7. Avaliao da Exactido
A exactido indica a proximidade do valor obtido no ensaio e o valor aceite como sendo
verdadeiro. Existem duas formas de exprimir a exactido: erro absoluto e erro relativo.
Na avaliao da exactido existem diferentes processos que se passam a descrever:
a. Materiais de Referencia Certificada (MRC)
A utilizao dos MRC consiste na sua anlise para avaliar a prestao do laboratrio. O
valor obtido no ensaio deve ser comparado com o valor certificado, para ser
determinado o erro e a exactido da anlise. O erro relativo E
r
calculado da seguinte
forma:
(16)
Mdia aritmtica de valores obtidos
Valor aceite como verdadeiro (valor certificado do MRC)

Quando juntamente como MRC for indicado um intervalo de incertezas para o valor
certificado e o valor obtido na determinao no estiver dentro do mesmo, o laboratrio
deve procurar as causas desse acontecimento e tentar corrigi-las ou aprov-las,
dependendo do rigor atribudo para os resultados,
O laboratrio em cada mtodo de ensaio define um grau de exigncia para a exactido
sendo satisfatrio um erro igual ou inferior a 5%.
b. Ensaios Interlaboratoriais
O ensaio interlaboratorial avaliado a partir do Factor de Desempenho (Z):
(17)

15

Sendo, o valor obtido pelo laboratrio; o valor aceite como verdadeiro e o
desvio, incerteza de X
v
, ou outro desvio. O critrio de aceitao de definido pela
entidade organizadora do ensaio interlaboratorial.

2.1.8. Incertezas
Na prtica, a incerteza associada a um resultado provem de vrias fontes possveis, tais
como definio incompleta, amostragem, efeitos e interferncia da matriz, condies
ambientais, incertezas dos equipamentos de massa e volumtricos, valores de referncia,
aproximaes e suposies incorporadas ao mtodo e ao procedimento de medio, e a
variao aleatria (Eurachem, 2000).
O clculo de incertezas definido como um parmetro associado ao resultado de uma
medio e caracteriza a disperso dos valores que podem ser atribudos ao mensurando
(Eurachem, 2007). Na globalidade, o clculo de incerteza, , efectuado a partir da
equao 18, equiparado como desvio padro relativo, tem o intuito de avaliar a
importncia dos erros associados aos equipamentos de medio na preparao dos
padres ( ), da linearidade do mtodo ( ), da preciso global ( ) e da recuperao
( ) (Brs et al, 2011).
(18)
Os erros associados aos equipamentos de medio na preparao dos padres ( ),
esto associados ao maior valor da incerteza da preparao de cada padro
individualmente, , determinado por:
(19)
Sendo, o erro do equipamento de medida e o valor medido por esse
equipamento. Ou seja, pode-se definir a incerteza associada preparao dos padres
como a soma da incerteza de cada medio necessria para preparar os padres.
A incerteza associada linearidade do mtodo, isto , obteno da curva de
calibrao, , corresponde ao quociente entre o desvio padro para uma dada

16

concentrao, , e a respectiva concentrao do padro, determinada pela curva de
calibrao, , como representa a seguinte equao:
(20)
Onde calculado pela seguinte equao:
(21)
Onde, , o desvio padro, o declive da regresso linear dos pontos experimentais,
corresponde ao nmero de rplicas de obtidos para cada , equivale ao nmero
de padres injectados para construir a curva de calibrao, y
o
o valor de y calculado
pela curva de calibrao para cada valor de , a mdia dos valores experimentais de
y, equivale ao valor da concentrao do padro i para construir a curva de calibrao
e a mdia dos valor de .
O parmetro est associado ao pior resultado do padro relativo de medies
consecutivas dos padres, sendo no mnimo de seis rplicas. A incerteza relativa
preciso, , determinado pela equao 22:
(22)
Na equao para determinar , o o desvio padro dos dados obtidos para a
repetibilidade, da injeco do padro e corresponde ao nmero de rplicas.
Na incerteza associada exactido, , consequente de ensaios de recuperao, ,
calculada a partir da equao 23, e onde o desvio padro relativo da
percentagem de recuperao (razo entre o desvio padro e a mdia das determinaes)
e o nmero de determinaes. A recuperao calculada como descrito
anteriormente.
(23)
A incerteza expandida deve ser anunciada junto com resultado final e calculada
utilizando um factor de correco de .

17

(24)
O resultado da anlise ter a seguinte forma:


18

19

O Controlo de Qualidade de gua
3. O Controlo de Qualidade de gua

Desde a revoluo industrial, as constantes agresses ao planeta Terra provocadas pelo
crescimento acelerado das reas urbanas, parques industriais e extensas reas de
explorao tem trazido inmeras preocupaes, particularmente demonstradas pelas
associaes de preservao de meio ambiente.
Dos vrios ecossistemas existentes, o aqutico acaba de uma forma ou de outra, por ser
o que sofre mais presses, visto este ser um receptor temporrio ou final de uma grande
variedade e quantidade de poluentes. Os meios hdricos naturais, principalmente rios,
so constantemente utilizados como meios receptores e agentes de transporte de
efluentes domsticos e industriais, bem como de escorrncias de terrenos agrcolas e de
guas de escorrncia de estrada. Como consequncia e associada h necessidade do
controlo de qualidade dos recursos hdricos, denota-se um aumento gradual no
desenvolvimento de mtodos rpidos e precisos para a deteco de determinados
parmetros no meio ambiente.
A gua de abastecimento considerada uma gua potvel, disponibilizada aos
consumidores atravs de uma rede de distribuio pblica. Antes de ser consumida, a
gua submetida a diversas operaes, tais como: captao, tratamentos fsico-
qumicos, armazenamento e insero na rede de distribuio.
Depois utilizada pelos consumidores, a gua transforma-se numa gua poluda,
tecnicamente denominada gua residual. As guas residuais domsticas, que todos
produzimos em nossas casas, contm uma elevada carga orgnica, bem como grandes
quantidades de bactrias e vrus, os quais constituem uma ameaa para a sade pblica.
Este resduo lquido no sendo tratado, comea a decompor-se, originando a produo
de gases com odor, a diminuio da concentrao de oxignio dissolvido na gua e, se
existirem nutrientes como fosfatos e nitratos, a promoo o crescimento de plantas
aquticas nos meios receptores. Em gamas de concentraes baixas, identificam-se nas
guas residuais compostos txicos, que pelas suas propriedades tem um carcter muito
lesivo para o ecossistema. Por estas razes fundamental proceder ao tratamento de

20

guas residuais para posteriormente serem conduzidas de modo seguro at aos meios
receptores aquticos.
Para controlar a composio da gua de abastecimento e gua residual, existe um
quadro legal que define os parmetros e respectivas anlises a efectuar de forma a
avaliar a sua qualidade qumica, bioqumica e microbiolgica, assim como valores
mximos admissveis desses parmetros. De acordo com os resultados das anlises que
definem o respectivo enquadramento definem-se programas de monitorizao da
qualidade da gua. A monitorizao deve-se ao facto de possveis mudanas em
algumas caractersticas das guas poderem ocorrer com o tempo, devida a
contaminaes externas ou anomalias do prprio tratamento, permitindo assim agir de
imediato no problema que est a alterar a composio da gua.

3.1. Quadro Legal Aplicado Qualidade da gua
A gua de abastecimento humano deve apresentar qualidade de modo, quando for
consumida, seja agradvel e no prejudicial sade. Isso exige infra-estruturas e uma
rede de distribuio que devem-se encontrar em boas condies de operao e
manuteno.
No final do ano de 2003, entrou em vigor o Decreto-Lei n 243/01, de 5 de Setembro
que transpe para o direito interno a Directiva n 98/83/CE do Conselho, de 3 de
Novembro, relativa qualidade da gua destinada ao consumo humano. Recentemente,
este decreto-lei foi revogado pelo Decreto-Lei n 306/2007 de 27 de Agosto, tendo
como objectivo proteger a sade humana dos efeitos nocivos resultantes da eventual
contaminao e assegurar a disponibilizao tendencialmente universal de gua salubre,
limpa e desejavelmente equilibrada na sua composio.
O Decreto-Lei n 306/2007 de 27 de Agosto estabelece:
Os requisitos legais de qualidade da gua destinada ao consumo humano;
As obrigaes relativas garantia dos parmetros da qualidade da gua
disponibilizada;

21

O programa de controlo da qualidade da gua;
O procedimento nas situaes de incumprimento;
As regras de aptido dos laboratrios de ensaios;
As regras de fiscalizao e regime contra-ordenacional.
O controlo da qualidade da gua da rede de abastecimento, segundo o ponto 1 do artigo
10 do Decreto-Lei n 306/2007 de 27 de Agosto, efectua-se de acordo com o
mencionado no seu anexo II. Este anexo tem por objectivo definir os controlos de rotina
e inspeco, assim como as frequncias mnimas de amostragem, para a anlise da gua
destinada ao consumo humano fornecida por sistemas de abastecimento pblico, redes
de distribuio, fontanrios, camies ou navios-cisterna, utilizada em empresas de
indstria alimentar e venda em garrafas e outros recipientes.
O Decreto-Lei n 236/98, de 1 de Agosto, ainda em vigor, apresenta os parmetros de
qualidade de guas superficiais e s guas subterrneas destinadas produo de gua
para consumo humano. Estabelece normas, critrios e objectivos de qualidade com a
finalidade de proteger o meio aqutico e melhorar a qualidade das guas em funo dos
seus principais usos. neste numerativo legal que so apontados os tipos de tratamento
adequados a preparao de gua para consumo dependendo da qualidade da gua na
fonte.

3.2. Metodologias Analticas
Para a caracterizao de uma massa de gua, as respectivas amostras obedecem a um
processo definido, desde a colheita at a determinao da concentrao dos diferentes
parmetros que conduzem definio da sua qualidade. Nestes processos deve-se
obedecer a diferentes requisitos de modo a que no haja contaminaes, desvirtuao e
perda da mesma.
Na Controlvet, a programao das actividades de colheita e recolha de amostras so
efectuadas por um documento designado por Planeamento, desencadeado pela
assinatura de um protocolo com cada cliente. O responsvel pela colheita de amostras

22

efectua a calendarizao das visitas a efectuar por colaborador, por dia e por viatura.
Cada colaborador tem disponvel um mapa de recolha de amostras por cliente a visitar.
Para cada amostra que se pretende recolher esto programados o tipo, a quantidade e os
ensaios a efectuar, e definido antecipadamente um dos dois sistemas que podem ser
utilizados para simplificar o processo de recolha e identificao de amostra:
1) Impresso pelo software juntamente com o mapa as etiquetas com cdigo de
barras para identificar as amostras no momento da recolha;
2) A informao carregada para um modo offline no software que utilizvel
pelos computadores portteis. Desta forma os colaboradores que efectuarem a
recolha registando as amostras no respectivo mapa sendo atribuda uma
codificao com que identificada a amostra at ao laboratrio.
O controlo da qualidade associado recolha de amostras de gua efectuado de acordo
com Clescer et al (1998), ISO 5667-3 / 2003 de forma a garantir a preservao e
manuseamento das amostras, e ISO 5667-14 / 1998 de modo a garantir a qualidade das
amostras.
As amostras so recolhidas por kits compostos por recipientes de plsticos e de vidro,
com respectivos conservantes, dependendo os parmetros a analisar. A tabela 2 indica
quais os recipientes que constituem o kit genrico, que conservantes a adicionar para as
anlises. Estes conservantes vo garantir que no haja decomposio da amostra desde o
momento da recolha at fase de anlise no laboratrio.
Existe um outro kit designado de controlo de inspeco. Os kits de controlo de
inspeco abrangem uma gama mais alargada de anlises e consequentemente um maior
nmero de recipientes (tabela 3). Os recipientes devem ser identificados atravs de
etiquetas, e efectuada previamente no laboratrio, para possibilitar uma correcta
utilizao, de forma inequvoca e durvel.
Os frascos onde foram adicionados os conservantes so tambm identificados com a
data da adio do conservante e a data de validade, permitindo assim a rastreabilidade
dos mesmos. Na execuo das recolhas, os kits so entregues aos clientes, se forem
estes a fazer a recolha, ou so tcnicos especializados da ControlVet que realizam a
recolha da amostra.

23

Tabela 2: Composio e tipos de conservantes que constituem o kit genrico
Tipo Recipientes Conservantes Anlises
G
Dois recipientes de plstico
(1L)
-
Condutividade, pH, cor,
turvao, nitratos,
nitritos, cloretos, sulfatos
e fluoretos
A Um Frasco de vidro
1
de 1L

1,5 mL de HNO
3
Metais
I Um frasco de vidro - Cheiro e sabor
E
Um copo de plstico com
tampa
0,100 mL de H
2
SO
4
Amnio e oxidabilidade
H
Um copo de plstico com
tampa
0,150 mL de HNO
3

Alumnio, arsnio e
selnio
1 Na utilizao de frascos de vidro de 500 mL adiciona-se 0,75 mL de HNO3, e em frascos de 250 mL acrescenta-se 0,375 mL do
mesmo cido.

No momento da recolha as amostras so identificadas atravs de colocao de etiqueta
com cdigo de barras ou por um cdigo facultado pelo tcnico. Em ambas as situaes
as identificaes das amostras so postas no mapa de recolha de amostras ou
directamente no modo offline do LAB (programa informtico) onde constam as
respectivas informaes. No local de recolha deve-se registar a seguinte informao:
Identificao do cliente;
Identificao da Amostra;
Identificao do ponto de colheita;
Data e hora da colheita;
Data e hora de entrega das amostras no laboratrio;
Resultados dos parmetros analisados no local, nomeadamente pH, temperatura
cloro residual livre e total;
Indicao dos parmetros a analisar (ou grupo de parmetros);

24

Identificao do responsvel pela recolha;
Outros aspectos relevantes (por exemplo relacionados com a conservao da
amostra, com as condies ambientais, com o estado de conservao do ponto
de amostragem, etc).

Tabela 3: Composio e tipos de conservantes que constituem o kit de controlo de
inspeco
Tipo Recipientes Conservantes Anlises
G Dois recipientes de plstico (1 L) -
Condutividade, pH, cor,
turvao, nitratos,
nitritos, cloretos, sulfatos
e fluoretos
A Um frasco de vidro1 de1 L 1,5 mL de HNO
3
Metais
I Um frasco de vidro - Cheiro e sabor
E Um copo de plstico com tampa 0,100 mL de H
2
SO
4
Amnio e oxidabilidade
H Um copo de plstico com tampa 0,150 mL de HNO
3

Alumnio, arsnio e
selnio
D Um frasco de vidro 100 mg de Na
2
S
2
O
3
Pesticidas e PAHs
B Um copo de plstico com tampa 0,100 mL de K
2
Cr
2
O
7
Mercrio
F Um copo de plstico com tampa 2,0 mL de NaOH Cianetos
1 Na utilizao de frascos de vidro de 500 mL adiciona-se 0,75 mL de HNO3, e em frascos de 250 mL acrescenta-se 0,375 mL do
mesmo cido.

Quando as amostras chegam ao laboratrio so registadas na aplicao LAB, onde
tambm so inseridas todas as informaes referentes identificao da amostra, cliente
e ensaios pretendidos. Aps a recepo da amostra e se estiver identificada com cdigo
de barras possvel realizar um registo provisrio da amostra no LAB. Este registo
permite atribuio do nmero de anlise e informa o laboratrio dos ensaios a efectuar.

25

Neste caso a amostra fica assinalada como em estado pendente aguardando a insero
dos restantes dados.
Em funo dos ensaios pretendidos pelo cliente a atribuio do nmero de amostra do
tipo: XX/ YYY/ VV, onde XX, identifica a seco do laboratrio; YYY, o nmero
sequencial de anlise no ano em curso; e VV o ano em curso.
No perodo que antecede o incio dos ensaios, as amostras so armazenadas a 32C de
forma a garantir a manuteno das suas caractersticas iniciais. Durante o
armazenamento, as amostras so conservadas nas embalagens originais.
Para a prossecuo das determinaes, dependendo dos ensaios pretendidos pipeta-se
volume pr-definido de amostra para o material corrente do laboratrio, como est
descrito na tabela 4.

Tabela 4: Previa preparao da amostra para determinados parmetros em anlise
Parmetro Volume (mL) Material
Alcalinidade 100 Erlenmeyer
Amnio ou azoto amoniacal 20 Bales de volumtricos (25 mL)
Cloretos 100 Erlenmeyer
Fluoretos 20 Copos de plstico com tampa
Nitratos 1,0 Tubo de ensaio
Nitritos 50 Balo volumtrico (50 mL)
Oxidabilidade 25 Frascos descontaminados
Sulfatos 100 Erlenmeyer

Tendo desenvolvido durante o perodo de estgio actividades mais directamente
relacionadas com a determinao de alguns parmetros analticos, faz-se de seguida
uma abordagem mais pormenorizada destas metodologias, concretamente relativa aos

26

seus princpios tericos, procedimentos experimentais e respectiva interpretao de
resultados (Clescer et al, 1998).

3.2.1. Amnia ou Azoto Amoniacal, NH
4
+

A amnia um composto facilmente biodegradvel principalmente pela flora do meio
aqutico que a absorvem e utiliza como nutriente, sendo este muito importante para a
produo de compostos azotados, nomeadamente protenas. A sua origem nos meios
hdricos proveniente da degradao de resduos de origem animal ou vegetal. Em
concentraes elevadas, por exemplo, na gua de consumo, pode causar danos graves
nos humanos e animais, j que a amnia interfere no transporte do oxignio pela
hemoglobina, entre outros efeitos nefastos. No apenas para a sade humana que o io
amnia prejudicial, pois este a nvel ecolgico tem tambm bastantes implicaes,
influenciando a quantidade de oxignio dissolvido na gua o que faz com que haja
inmeras alteraes metablicas nos seres vivos aquticos (Mendes, et al, 2004).
A determinao do teor de amnia em guas efectuada atravs de um mtodo
desenvolvido internamente no laboratrio, da designado por MI-LAQ-30-02.

Principio
Neste mtodo a amnia reage com o fenol formando uma soluo de cor azul. Esta
reaco catalisada pelo nitroprussiato de sdio e tem uma durao de 6horas no
escuro. A intensidade da cor proporcional concentrao da amnia, e medida no
espectrofotometro a 630 nm, regio do visvel.

Reagentes
Soluo stock e um padro controlo (PC) de 1000 mg/L a partir do reagente cloreto
de amnio;
Soluo intermdia e um PC de 10 mg/L a partir da soluo anterior;

27

Soluo intermdia e um PC de 1 mg/L a partir da soluo anterior;
Solues padres de 0,05 a 0,5 mg/L preparados por pipetagem da soluo anterior, e
um PC de 0,2 mg/L;
Reagente de nitroprussiato de sdio e fenol;
Reagente de colorao hidrxido de sdio, citrato trissdico dihidratado e cido
diclorocianurico.

Mtodo
Tomar um determinado volume de gua bidestilada (branco), dos padres, padro
controlo e amostras para bales volumtricos. Adicionar a soluo nitroprussiato de
sdio e fenol e a soluo de colorao. Agitar e deixar em repouso, no escuro, durante 6
horas. Por fim, leitura no espectrofotometro com comprimento de onda de 630 nm.

Clculos
A determinao da concentrao da amnia feita a partir da curva de calibrao.

3.2.2. Cloretos, Cl
-

Os cloretos so os sais mais abundantes na natureza, principalmente na gua do mar. os
seus teores so, por norma, mais baixos nas zonas altas e montanhas e mais elevados
nas zonas baixas e nas guas subterrneas. Quando uma amostra de gua apresenta
valores de cloretos a sua origem pode ser natural (rochas, solos, intruso do mar em
gua doce, etc) ou de aco antrpica (esgotos sanitrios, descargas industriais
petrolferas, curtumes, etc.). Para a sade pblica os cloretos alcalinos-terrosos tm um
efeito laxativo que no deve ser ignorado mesmo que no atinja nveis txicos em guas
de consumo porque podem ser prejudiciais em doentes com problemas renais ou
cardiovasculares. A sua elevada concentrao, tambm, altera a presso osmtica dos
microrganismos do meio hdrico bem como a corroso de canalizaes e materiais
metlicos (Mendes, et al, 2004).

28

O processo de determinao do teor de cloretos est definido na norma portuguesa NP-
423 de 1966, destinado a guas naturais.

Principio
A determinao dos cloretos no meio hdrico feita atravs de uma titulao
argentiomtrica onde existe competio para a captura de ies prata. A soluo de prata,
titulante, ao ser adicionada reage com os cloretos (Cl
-
) primeiramente, formando um
precipitado branco de cloreto de prata (AgCl) devido sua inferior constante
solubilidade. Quando todo o Cl
-
estiver consumido a prata passa a reagir com o cromato
de potssio (K
2
CrO
4
), indicador amarelo, formando cromato de prata (Ag
2
CrO
4
) de
colorao avermelhada. nesta mudana de cor que termina a titulao, considerando o
cromato o indicador da titulao.

Reagentes
Soluo de nitrato de prata a 0,1 N;
Soluo de nitrato de prata a 0,02 N;
Soluo e um PC de cloreto de sdio a 1000mg Cl
-
/L,
Soluo e um PC de 100 mg Cl
-
/L a partir da anterior padronizao;
Padro Controlo de 18,4 mg Cl
-
/L a partir da anterior;
Soluo de cromato de potssio a 10% - soluo indicadora;
Soluo de cido sulfrico a 0,1 N;
Soluo de hidrxido de sdio a 0,1 N

Mtodo
Tomar um determinado volume de gua bidestilada (branco), da soluo de cloreto de
sdio 100 mg/L, do PC e de amostra para erlenmeyer. Acertar o pH entre 6,5 a 10,5 das
amostras, brancos, padronizaes e padro controlo, com hidrxido de sdio caso a
amostra seja cida, e cido sulfrico se a amostra for alcalina. Adicionar 3 4 gotas de

29

cromato de potssio. Titular com nitrato de prata a 0,02 N ou a 0,1 N, conforme o teor
esperado de cloretos. Utiliza-se a soluo de nitrato de prata de 0,02 N quando o teor
esperado de cloretos for inferior a 35,5 mg/mL e a soluo de nitrato de prata a 0,1 N
para teores superiores.

Clculos
Na determinao do teor de cloretos em guas quando, se utiliza este mtodo de
titulao nitrato de prata a 0,1 N ou 0,02 N as frmulas de clculo, expressas em mg de
Cl
-
/L so as seguintes, respectivamente:
ou

Volume de toma de amostra, expresso em centmetros cbicos

Volume de soluo de nitrato de prata a 0,1 N gasto na titulao, expresso em mililitros

Volume de soluo de nitrato de prata a 0,02 N gasto na titulao, expresso em mililitros

3.2.3. Fluoretos, F
-
O io fluoreto a forma inica do flor, substancia que adicionada gua de
abastecimento de forma a conseguir manter um bom nvel de qualidade durante a sua
distribuio. A concentrao de fluoretos na gua potvel reduz a crie dentria, e
quando os seus teores so elevados podem ocorre problemas patolgicos, tais como:
gastrenterites hemorrgicas, nefrides agudas e vrias leses a nvel do fgado e corao.
Podem, numa primeira instncia, ocorrer vmitos, dores abdominais, nuseas e diarreia.
Quando o nvel de fluoretos exceder os limites recomendados, as guas devem ser
desfluoretadas (Mendes, et al, 2004).
O processo de determinao dos fluoretos na gua est definido no Standard Methods,
na seco 4500 (F
-
) C Mtodo do elctrodo de io selectivo.


30

Principio
O elctrodo de fluoretos um sensor de io selectivo. Este possui cristais de fluoretos
de lantnio, atravs das quais um potencial e estabelecido por solues de diferentes
concentraes de flor. A clula pode ser representada por:
Ag|AgCl, Cl
-
(0,3 M), F
-
(0,001 M) |LaF
3

O elctrodo mede a actividade dos ies fluoretos na soluo ao invs da concentrao.
A sua actividade depende da fora inica, pH e flor em espcies complexantes. Por
isso adicionado uma soluo tampo para uniformizar as foras inicas, ajustar o pH e
quebrar os complexos.

Reagentes
Soluo de fluoreto de sdio com concentrao de 100 mg F
-
/L
Soluo intermdia de 10 mg F
-
/L;
Solues padres entre 0,5 a 2 mg F
-
/L;
Padro controlo de fluoreto de sdio de 1 mg F
-
/L;
Soluo tampo: gua bidestilada, acido actico, cloreto de sdio e cido 1,2-
ciclohexilene-dinitilo-tetraactico (CDTA); acertar o pH com hidrxido de
sdio, 6 N.

Mtodo
Pipetar um determinado volume de gua bidestilada (branco), padres, amostra e PC,
para copos de plstico. Adicionar a soluo tampo. Determinar os fluoretos dos
padres, PC e amostras por potenciometria e em agitao.

Clculos
A determinao da concentrao dos fluoretos feita a partir da curva de calibrao.

31


3.2.4. Nitratos, NO
3
-

Tanto os nitratos como os nitritos so compostos de azoto. Na forma molecular, o azoto
um gs que ocupa cerca de 79% do volume da atmosfera e que por diversos processos
inserido nos ecossistemas terrestres. Os nitratos so um constituinte azotado essencial
na formao da biomassa das plantas e animais, Contudo considerado um poluente nas
guas superficiais e subterrnea que potencialmente so transformadas em guas de
consumo humano. No que diz respeito ao ecossistema aqutico os nitratos surgem na
gua devido aplicao de fertilizantes agrcolas, resduos domsticos e industriais e
poluio atmosfrica por azoto. Os nitratos presentes nos meios hdricos podem ser
responsvel pelo desenvolvimento de vegetao algal, designado por eutrofizao no
meio hdrico. Estes compostos interferem igualmente na sade pblica podendo dar
origem a produtos cancergenos e quando os nitratos se encontram em concentraes
bastante elevadas podem causar meta-hemoglobinmia, mais conhecida nos bebs como
o nome de doena dos bebs azuis (Mendes, et al, 2004).
O processo de determinao da turvao da gua est definido na norma portuguesa
NP4338-1/96 mtodo espectromtrico do 2,6 dimetilfenol.

Princpio
Na presena do cido sulfrico e cido ortofosfrico, os nitratos reagem com o 2,6-
dimetilfenol formando 4-nitro-2,6-dimetilfenol, alaranjado, o que pode ser
espectrofotometricamente medido na zona do ultra-violeta (UV). Esta reaco demora
cerca de 5 minutos.

Reagentes
Soluo de nitrato de potssio de 1000 mg (N-NO
3
) /L;
Soluo intermdia de 100 mg (N-NO
3
) /L;
Soluo padres entre 1 a 25 mg (N-NO
3
) /L;

32

Padro controlo de 40 mg (NO
3
) /L;
Soluo cida: cido sulfrico, cido ortofosfrico e cido amidossulfnico;
Reagente de colorao: cido actico e 2,6-dimetilfenol;

Mtodo
Pipetar um determinado volume de gua bidestilada (branco), de amostra e dos padres.
Adicionar mistura cida e reagente de colorao. Agitar e deixar repousar. Fazer leitura
no espectrofotometro a 324 nm, em clulas de vidro.

Clculos
A determinao da concentrao dos nitratos feita a partir da curva de calibrao.

3.2.5. Nitritos, NO
2
-
Os nitritos resultam da oxidao do azoto amoniacal (pode ser proveniente da
esterilizao ou desinfeco das guas por cloraminas) e/ou da reduo microbiana ou
qumica dos nitratos. Nas guas fluviais a sua concentrao elevada devido presena
de xidos de azoto na atmosfera. Normalmente, encontrado em quantidades diminutas
nas guas, devido sua instabilidade na presena de oxignio. A existncia nitritos nas
guas indica que ocorrem processos biolgicos devido a poluio orgnica, isto
decomposio de matria biolgica, ou contaminao de aditivos industriais. A sua
presena transitria ou seja, rapidamente oxidado a nitratos. Se por sua vez, a sua
presena persistente salienta que se trata de uma contnua contaminao de matria
orgnica. Os nitritos quando formados no estmago fixam-se na hemoglobina, o que
dificulta a converso da carboxihemoglobina em oxihemoglobina, consequentemente
promovem a doena dos bebs azuis o que leva morte por asfixia (Mendes, et al,
2004).

33

O processo de determinao de nitritos da gua est definido na norma portuguesa NP
EN 26777 / 96 mtodo espectrometria da absoro molecular.
Principio
O nitrito reage com a sulfanilamida formando um sal diazoico. Por sua vez este sal
reage com o dicloro-hidrato de N(1-naftil)-1, 2-etilenodiamina (NED) formando um
complexo rosa/prpura. A determinao de nitritos feita pela comparao
colorimtrica produzida pelo tratamento da amostra e dos padres com sulfanilamida e
dicloro-hidrato de NED. A intensidade da colorao proporcional a concentrao de
nitritos.

Reagentes
Soluo de nitrito de sdio a 1000 mg NO
2
-
/L;
2
-
/L, a partir da anterior;
2
-
/L, a partir da anterior;
Solues padres de nitrito de sdio entre 0,01 a 0,05 mg NO
2
-
/L;
Padro controlo de 0,01 mg N-NO
2
-
/L;
Soluo de colorao aminobenzeno-sulfonamida, cido ortofosfrico e
dicloro hidrato de N(1-Naftil)-1,2-etilenodiamina.

Mtodo
Tomar um determinado volume de gua bidestilada (branco), de amostras, padres e PC
para bales volumtricos. Adicionar reagente de colorao e deixar repousar. Por fim,
faz-se a leitura no espectrofotometro a 540 nm.

Clculos
A determinao da concentrao dos nitritos feita a partir da curva de calibrao.

34

3.2.6. Oxidabilidade
Um dos parmetros qumicos associados a compostos orgnicos mensurveis na gua
a oxidabilidade que consiste na quantidade de matria orgnica quimicamente oxidvel,
tais como protenas, gorduras, acares, entre outros. Uma gua que apresenta baixa
oxidabilidade indica que manifesta um baixo teor de matria orgnica dissolvida,
apresentando-se esta potvel para consumo humano. A origem da matria orgnica
presente na gua pode estar relacionada com o metabolismo dos organismos vivos,
incluindo plantas, animais e microrganismos, lixiviao e outras matrizes ambientais, ou
pela acumulao de substncias orgnicas originadas por actividades antropognicas. A
presena de compostos orgnicos oxidveis em guas de consumo humano no reporta,
directamente, impactes na sade pblica. Contudo, o aumento da oxidabilidade na gua
indicador de contaminaes quer microbiolgica, quer qumica, e essa pode ser
prejudicial (Mendes, et al, 2004).

Princpio
A oxidabilidade determinada por digesto de uma soluo de permanganato de
potssio em meio cido e em ebulio cerca de 10 minutos. O permanganato, MnO
4
-
,
(cor de rosa) oxida a matria orgnica, reduzindo-se a Mn
2+
. Aps os 10 minutos, se a
cor rsea permanecer indica que toda a matria orgnica reagiu e que existe
permanganato em excesso. Segue-se a adio da soluo oxalato, que vai reagir com o
permanganato em excesso. Por fim, ocorre a titulao com o permanganato onde se vai
determinar a quantidade de oxalato em excesso, o que corresponde quantidade de
permanganato que reagiu com a matria orgnica.
O processo de determinao da oxidabilidade da gua est definido na ISO 8467 / 93
Determinao do ndice de permanganato.

35

Reagentes
Soluo de cido sulfrico a 7,5 M;
Soluo de cido sulfrico a 2 M a partir da soluo anterior;
Soluo de Oxalato de sdio a 0,05 M;
Soluo de Oxalato de sdio a 0,005 M a partir da soluo anterior;
Soluo de Permanganato de potssio a 0,02 M;
Soluo de Permanganato de potssio a 0,002 M a partir da soluo anterior;
Soluo de resorcinol a 100 mg/L padro controlo.

Mtodo
Tomar um determinado volume de amostra, da soluo resorcinol e de gua bidestilada
(branco) para frascos desinfectados e adicionar cido sulfrico 2 M. Vai ao banho de
gua entre 96 a 98C durante 10minutos. Ainda no banho, adiciona-se o permanganato
de potssio 0,002 M e continua no banho durante 10 minutos. Adicionar a soluo de
oxalato de sdio de 0,005 M. Por fim titular com permanganato de potssio 0,002 M.
Aps titular o branco, volta-se adicionar oxalato de sdio e torna-se a titular at ficar de
novo cor roscea, designada padronizao.
Clculos
A determinao da quantidade de permanganato que reagiu com a matria orgnica,
calcula-se pela seguinte expresso matemtica:

Volume de permanganato gasto na titulao do branco (mL)
Volume de permanganato gasto na titulao da amostra (mL)
Volume de permanganato gasto na padronizao (mL)
f Factor de matria orgnica (mg O
2
/L). Este factor e calculado por:

Volume de oxalato de sdio (mL)

36

c Concentrao do oxalato de sdio (0,005 M);
Massa molecular do oxignio
Volume tomado de amostra mL

3.2.7. Sulfatos, SO
4
-

Os sulfatos so ies, tambm, abundantes na natureza, pois estes, tal como os cloretos
tambm se podem encontrar devido dissoluo de solos e rochas. Contudo a sua
origem no sempre natural e descargas de efluentes industriais ou domsticos pode
igualmente aumentar a sua concentrao no meio hdrico e como consequncia efeitos
laxantes no ser humano. A existncia deste io tambm, resultante do processo de
floculao/coagulao que se recorre aos sulfatos de alumnio ou de ferro
O processo de determinao do teor de cloretos est definido no standard methods, na
seco 4500 (SO
4
-
) E mtodo turbidimtrico.

Principio
O mtodo, normalmente, utilizado para a deteco de sulfatos baseia-se na precipitao
do io sulfato, existente na gua sob a forma de SO
4
2-
, com cloreto de brio (BaCl
2
),
dando-se a formao de cristais BaSO
4
que posteriormente so medidas
espectofotometricamente a 420 nm.

Reagentes
Soluo de sulfato de sdio de 100 mg SO
4
-
/L;
Solues padres entre 10 a 40 mg SO
4
-
/L;
Padro controlo de sulfato de sdio de 25 mg SO
4
-
/L;
Soluo tampo: cloreto de magnsio, acetato de sdio, nitrato de potssio e
acido actico.

37

Mtodo
Pipetar um determinado volume de gua bidestilada (branco), amostra, padres e PC
para erlenmeyer. Adicionar a soluo tampo. Colocar cloreto de brio e agitar durante
1 minuto. Colocar em clulas de vidro e deixar repousar 5 minutos. Por fim, efectuar a
leitura no espectrofotometro a 420 nm.

Clculo
A determinao da concentrao dos sulfatos feita a partir da curva de calibrao.

3.2.8. Turvao
A turvao, tambm designado por turbidez, de uma gua causada, essencialmente,
por matria coloidal e em suspenso, de tamanho e natureza variados, por exemplo,
lamas, areias, matria orgnica e inorgnica, bem como compostos corados solveis e
microrganismos. Estes materiais no permitem a penetrao da luz nos meios hdricos,
impedindo a fotossntese das plantas e algas. Os sedimentos podem transportar
substncias txicas, que atravs da cadeia alimentar pode levar morte de seres vivos,
principalmente organismos aquticos.
O processo de determinao da turvao da gua est definido na ISO 7027 / 99.

Princpio
A determinao da turvao feita atravs de um equipamento ptico, designado
turbidmetro, que mede a razo entre a intensidade de luz dispersa num determinada
direco e a intensidade de luz transmitida. A turvao expressa em NTU
(Nephelometric Turbity Unit).

Reagentes

38

Soluo stock de formazina, 4000 NTU;
Soluo de formazina, 1000 NTU;
Soluo de formazina, 100 NTU;
Solues padres entre 0,30 a 10 NTU;
Padro controlo de 4 NTU.

Mtodo
Fazer a leitura no turbidimetro do branco, padres, PC e amostra.

Clculos
A determinao da turvao feita a partir da curva de calibrao.

39

3.3. Apresentao de Resultados
Como foi referido anteriormente, num laboratrio acreditado deve-se cumprir com
vrios requisitos no sentido de garantir a qualidade dos resultados produzidos na
sequncia da determinao analtica efectuada. Neste sentido, na Controlvet so
seguidos procedimentos padro para atingir esses objectivos. No Anexo B esto
apresentadas tabelas que definem os critrios dos ensaios aplicados para o controlo de
qualidade dos mtodos analticos, tais como: a periodicidade com que avaliada a curva
de calibrao, limiares analticos, branco, repetibilidade, preciso exactido, incerteza,
sensibilidades, ensaios de recuperao e padres nos extremos (estas metodologias
foram previamente validadas no laboratrio). Nas mesmas tabelas esto definidos os
critrios de aceitao do mtodo.
A tabela 5 sumaria os parmetros de validao que devem ser controlados em cada
mtodo analtico aplicado em gua superficial e de consumo. Desta forma possvel
garantir que as metodologias so produtivas e continuam validadas.

Tabela 5: Critrios do controlo de qualidade para a aplicao do mtodo analtico.
Controlo
Parmetro
NH
4
+
Cl
-
F
-
NO
3
NO
2
SO
4
Turvao
Curva de calibrao
Limiares analticos
Branco
Repetibilidade
Preciso
Exactido
Incerteza
Sensibilidade
Ensaio de
recuperao

Aferio do padro
primrio

Padres externos


40

Uma vez que no perodo de estgio efectuaram-se inmeras determinaes em amostras
provenientes de diferentes locais/clientes, no sero apresentados resultados especficos
de nenhuma amostra, mas sim um boletim exemplificativo para avaliar a informao
resultante das determinaes experimentais e que disponibilizada ao cliente (anexo C).
De acordo com NP EN ISO/IEC 17025:2007, na seco 5.10, a apresentao dos
resultados dos ensaios realizados pelo laboratrio deve ser feita de forma exacta, clara,
inequvoca e objectiva. Os relatrios, tambm designados boletins, onde geralmente so
apresentados os resultados deve abranger todas as informaes solicitadas pelo cliente e
as necessrias para a interpretao dos resultados do ensaio, incluindo todas as
informaes exigidas pelo mtodo de anlise utilizado. Portanto, cada relatrio de
ensaio deve incluir a seguinte informao (a menos que o laboratrio tenha razoes
vlidas para no o fazer):
a) Um ttulo (por exemplo; Relatrio de Ensaio);
b) O nome e a morada do laboratrio, e deve conter o local onde os ensaios foram
realizados, caso no for o mesmo laboratrio;
c) A identificao inequvoca do relatrio de ensaio, uma identificao em cada
pagina que garanta que essa pagina seja reconhecida como fazendo parte do
relatrio de ensaio e uma identificao clara do final do relatrio de ensaio;
d) O nome e morada do cliente;
e) A identificao de mtodo utilizado;
f) A descrio, estado e identificao inequvoca dos itens ensaiados;
g) A data de recepo dos itens para ensaios, sempre que seja essencial para a
validade e utilizao dos resultados, e as datas de realizao dos ensaios;
h) Referencia ao plano e aos procedimentos de amostragem utilizados pelo
laboratrio ou por outros organismos, sempre que estes sejam relevantes para a
validade ou utilizao dos resultados;
i) Os resultados de ensaio, incluindo quando apropriado as unidades de medio;

41

j) O(s) nome(s), funo(es) e assinatura ou identificao equivalente, da(s)
pessoa(s) que autoriza(m) o relatrio de ensaio;
k) Quando relevante, uma declarao em como os resultados se referem apenas aos
itens ensaiados.
Os boletins da ControlVet esto de acordo com a descrio da composio do boletim
presente na NP EN ISO/IEC 17025:2007. Destes conta a seguinte informao: nome e
morada do laboratrio, nome e morada do cliente, nmero de amostra, data de colheita,
data de recepo, data de inicio de ensaio, data de fim de ensaio, o tipo de amostra de
gua, referncia do local da recolha, quem realizou a recolha e informao adicional
como a lista de abreviaturas e informao que o laboratrio considera pertinente dispor
ao cliente e tambm a assinatura do tcnico superior responsvel pelo laboratrio. A
apresentao dos resultados no boletim est no formato de tabela dispondo os
parmetros analisados, o mtodo utilizado, o resultado obtido, as respectivas unidades, o
valor recomendado, o valor limite, o valor paramtricos e a apreciao, isto , se est ou
no conforme com os valores legislados.
Nos exemplos apresentados no anexo C, os resultados descritos tanto no boletim
genrico como no boletim do controlo de inspeco esto conforme com os valores
recomendados e valores paramtricos descritos no Decreto-Lei n 306/2007 de 27 de
Agosto. Excepto o pH do primeiro boletim e a dureza do segundo boletim, que se
encontram ligeiramente abaixo do valor paramtrico e valor recomendado,
respectivamente.
Os boletins agrupam a anlise a parmetros determinados para o controlo de qualidade
que segundo Clescer et al (1998) podem ser divididos nos seguintes grupos:
1. Propriedades fsicas agregadas (por exemplo: pH, Condutividade);
2. Propriedades qumicas agregadas (como por exemplo: Cheiro, oxidabilidade);
3. Compostos inorgnico no metlicos (por exemplo: Nitratos, Nitritos);
4. Compostos orgnicos individuais (por exemplo: PAHs, Pesticidas);
5. Metais (por exemplo: zinco, ferro).

42

A amostra apresentada no boletim genrico trata-se de uma gua de abastecimento e
apresenta valores normalizados de cloro residual livre, mostrando que j foi objecto de
desinfeco.
A amostra representativa no boletim de controlo de inspeco apresenta uma
condutividade baixa, indicando uma gua com teores diminutos de ies dissolvidos.
Nesta situao, estes ies so clcio ou magnsio (que conferem a dureza da gua)
cloretos, nitratos, ferro e mangans. Verifica-se a ausncia de materiais perigosos como
metais pesados ou compostos orgnicos txicos (por exemplo: bromatos e
tricloroeteno).
Verifica-se que tem caractersticas de uma gua subterrnea devido aos ies mangans e
ferro sendo caracterstico em guas pouco arejadas.

43

Caso de Estudo Validao de uma Metodologia Analtica
4. Caso de Estudo Validao de uma Metodologia Analtica

No seguimento de poltica de qualidade seguida no laboratrio, foi proposta a validao
da metodologia analtica para a determinao de acares por cromatografia lquida de
alta eficincia (High-Performance Liquid Chomotography HPLC) com deteco de
ndice de refraco (Refractive Index Detectors RID). Na fase inicial deste captulo
feita uma abordagem s metodologias apontadas para a determinao destes analitos,
para posteriormente chegar ao conceito da tcnica que foi seguida no estgio. Por fim,
sero apresentados os procedimentos experimentais, assim como os respectivos
resultados e parmetros de validao.

4.1. Mtodos de Determinao de Acares
A cromatografia lquida de alto desempenho tem sido a tcnica por excelncia aplicada
determinao de acares em alimentos. Os mtodos de deteco empregues variam
de RID (Chvez-Sern et al, 2004; Ferreira et al, 1997; Santos et al, 2006), deteco de
massas (McRae et al, 2011; Zhang et al, 2011), Fluorescncia (Alwael et al, 2010) e
permuta inica (Guignard et al, 2005).
A HPLC-RID um mtodo fcil por separar a fraco individual dos acares de outros
componentes tais como: protenas e outras macromolculas que possam criar
interferncia no sistema e na analise qualitativa e quantitativa de mono- e dissacardeos
(Chvez-Sern et al, 2004). Chvez-Sern et al (2004) e Ferreira et al (1997) salientam
que o HPLC deve ser o mtodo de eleio para a anlise de acares pelo facto de ter
convenientes tais como: boa preciso, capacidade de separao, rapidez, ser simples e
econmico.
Contudo os mtodos analticos para a determinao de acares, apresentam vantagens
e desvantagens. O HPLC-RID ou detectores de espalhamento de luz por evaporao so
os mais escolhidos, contudo, estas tcnicas no so as mais sensveis. As tcnicas de
HPLC com detector amperiomtrico de luz pulsada ou detectores de fluorescncia

44

demonstram ser eficazes, porm em pH elevados no so as mais adequadas (McRae,
2011).
McRae, et al (2011) determinaram acares usando espectrometria de massa que
permite distinguir homlogos de acares de massas diferentes. No entanto, em
ismeros como a glicose, manose e galactose no podem ser diferenciados por massa.
Contudo, o HPLC pode separar esses ismeros. Estes autores descreveram um novo
mtodo quantitativo por cromatografia lquida de ionizao com deteco
espectromtrica de massa (liquid chromatography electrospray ionization tandem mass
spectrometry - LC-ESI-MS/MS) para a anlise de acares redutores com uma prvia
derivatizao. Verificaram que o mtodo tem especificidade e sensibilidade em de
matrizes complexas de acares, incluindo istopos.
Zang et al (2011) determinaram acares a diferentes nveis de reaco Maillard com
diluio istopa. Os produtos da reaco Maillard foram preparados atravs da digesto
por microondas (Microware digestion labstation - MDL), com diferentes tempos de
aquecimento. Por fim analisados por UHPLC MS/MS (Ultra High-Performance
Liquid Chromatography - Mass Spectrometry). Para estes autores o uso de MDL torna o
mtodo mais rpido e sensvel.
Na anlise cromatogrfica dos acares existem inmeras dificuldades, especialmente
devido variedade de acares que ocorrem na natureza. Alm disso, a grande
variedade de grupos funcionais aumenta a diversidade qumica, assim complicando a
escolha da fase estacionria e mvel. A cromatografia gasosa (GC) de detector de
ionizao de chama (flame ionization detector FID) ou detector espectromtrico de
massa (Mass Spectrometry MS) tem sido empregado para separar e identificar
aucares. No entanto, devida elevada polaridade hidrfila e baixa volatilidade dos
acares, estes tm de ser convertidos em acetatos antes de ser analisado por GC. Logo
HPLC muitas vezes o escolhido para quantificar os acares (Guignard, 2005).
A cromatografia de alto desempenho de permuta inica (High-performance Anion-
Exchange Chromatography -

HPAEC) quando acoplada a um detector por ampermetro
de luz pulsada (Pulsed Amperometric Detection
-
PAD) um mtodo eficiente para
quantificar acares em amostras naturais e produtos alimentares. O PAD um mtodo
electroqumico baseado na oxidao dos acares por um elctrodo com elevada

45

sensibilidade e selectividade. No entanto, a complexidade das amostras pode levar a um
rudo excessivo. Consequentemente, as interferncias entre os componentes da amostra
e os compostos esperados podem alterar os resultados, levando difcil integrao dos
picos. A deteco de espectrometria de massa selectivo e sensvel, e pode, portanto,
melhorar os desempenhos cromatogrficos. No entanto, a MS comummente
considerada incompatvel com o eluentes alcalinos (C. Guignard, 2005).
Alwael et al (2010) analisaram monossacardeos por cromatografia lquida de fase
reversa (High-Performance Reversed-Phase Liquid Chromatography - HPRPLC) com
deteco por fluorescncia (FL), em matria-prima complexa e materiais de
fermentao. O mtodo HPRPLC com detector de ultra-violeta (UV) ou fluorescncia
no pode ser usado directamente na determinao de acares, pelo facto de ser
necessrio o uso adequado de cromforos ou de fluorforos. Por esta razo, crucial
proceder derivatizao dos acares para uma deteco mais sensvel e selectiva. Para
a derivatizao existe uma variedade de reagentes como por exemplo o cido 2-
aminobenzico para a deteco por fluorescncia. Os autores concluram que o mtodo
HPRPLC-FL rpido e pode ser utilizado para a determinao qualitativa e quantitativa
de monossacardeos em uma variedade de produtos complexos resultantes da
biofermentao.
Existem outros mtodos diferentes para a determinao do teor dos acares descritos
em documentos na literatura, tais como, espectroscopia no infra-vermelho mdio
(Fourier transform mid-infrared FT-MIR), espectroscopia prximo do infra-vermelho
prximo (Fourier transform near-infrared - FT-NIR), espectrofotometria com injeco
em fluxo (flow-injection spectrophotometric determination - FIA) e mtodos
colorimtricos e titulimtricos.
O NIR e o MIR so tcnicas de espectroscopia que tm sido gradualmente
desenvolvidos nos ltimos anos como alternativas qumica hmida na indstria de
alimentos e agricultura, principalmente porque so mtodos simples que podem ser
aplicados com baixo custo, de forma rpido e no destrutiva, onde as amostras requerem
pouca ou nenhuma preparao (Bureau et al, 2009; Rodriguez-Saona et al, 2001; Shen
et al, 2011; Tewari et al, 2008). Recentemente, muitos estudos tm-se concentrado na
aplicao da tecnologia MIR, uma vez que pode oferecer uma determinao mais
precisa dos elementos e propriedades do que o mtodo NIR (Shen et al, 2011).

46

A tecnologia MIR basea-se na determinao das ligaes de grupos funcionais, tais
como C-C, C-H, O-H, C = O e N-H, aps a absoro de radiao na regio do
infravermelho mdio, que geralmente definida por de 400 a 4000 cm
-1
, ou em
comprimentos de onde de 2500 a 25000 nm (Shen et al, 2011). Como neste
comprimento de onda absorvida a radiao promovendo transio de vibrao
fundamental e espectros bem definidos levando a uma interpretao directa. Segundo,
Bureau et al (2009), o FT-MIR foi desenvolvido para determinar o teor de slidos
solveis totais como os acares usando a refletncia total. Ao comparar com o mtodo
enzimtico de determinao do teor de acares verificou que o tempo de anlise
reduzir significativamente.
Por outro lado, o mtodo NIR rpido e fornece uma anlise sem o uso de quaisquer
produtos qumicos (Tewari et al, 2008). Permite uma anlise directa de amostras, sem
uma prvia preparao ou diluio, e so rapidamente absorvidas. Os espectros desta
regio de IV so complexos uma vez que resultam de absores menos intensas e
ocorrem sobreposies e combinaes de ligaes entre tomos de grupos funcionais
diferentes. Por esta razo necessrio aplicar mtodos estatsticos que permitem
determinar as propriedades dos monossacardeos utilizando vrios comprimentos de
onda. No entanto, a aplicao do NIR medio de sistemas aquosos tem sido difcil por
causa da interferncia das faixas vibracionais da gua (Rodriguez-Saona et al, 2001).
Rambla et al, (1997) estudaram a capacidade de NIR para identificar e quantificar
glicose, frutose, sacarose e o teor de acar total em misturas sintticas e amostras de
frutas da correlao dos acares espectrais com a concentrao dos acares pelo
mtodo estatstico dos mnimos quadrados parciais (Partial Least-Squares - PLS). O
espectro de absorvncia foi entre 1200 e 2450 nm com uma velocidade de digitalizao
de 480 nm/min e uma resoluo de 1 nm. Para os autores o NIR importante na
determinao dos acares em matrizes alimentares complexas, e o uso da primeira
derivada nos espectros evita erros relacionados com a presena de partculas slidas.
O mtodo FIA em conjunto com a fotodegradao para a determinao dos acares
totais simples, barato e fcil de implementar. Este mtodo tem vantagens como,
anlise rpida, baixo risco de contaminao e consumo reduzido de reagentes (Llamas
et al, 2011).

47

Um estudo de comparao entre o mtodo colorimtrico e titulimtrico, afirma que
ambos os mtodos podem ser utilizados na quantificao dos acares com resultados
fidedignos, contudo os resultados obtidos pelo mtodo colorimtrico so os mais
precisos (I. M. Demiate et al, 2002).
Os mtodos, como titulomtricos (complexao com EDTA; Lane-Enyon e Luff-
Shoorl); gravimtricos (Musson-Walker) e Espectrofotomtricos (ADNS; Autrona;
Fenol-sulfrico; e Somogyi-Nelson) consistem em reaces de oxidao e/ou reduo
entre grupos funcionais dos acares e solues aquosas utilizadas nos mtodos (Silva,
et al; 2003).
Os mtodos baseados na presena dos grupos funcionais acabam por no ser os mais
fiveis, pelo facto de poder existir outros compostos orgnicos, tambm com os mesmos
grupos funcionais, que tambm sero quantificados nos mtodos.

4.2. Aplicao da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia, HPLC
Actualmente a HPLC considerada da maior relevncia porque um mtodo de
separao e uma tcnica de anlise muito eficiente, ou seja, separa compostos em curtos
espaos de tempo e capaz de fornecer uma anlise quantitativa escala de parte por
bilio. Martin e Synge, os responsveis pelo desenvolvimento desta metodologia
analtica, em 1941 estavam cientes que a fase estacionria, presente numa coluna,
retinha partculas muito pequenas, e que a uma presso elevada da fase mvel (FM)
permitia o caudal ideal para que esta percorra a coluna desejvel. Por isso que o HPLC
por vezes referido com cromatografia lquida de alta presso (Meyer, 1997).
A HPLC tem como principio a separao de compostos de uma amostra, compostos
estes que so arrastados por uma fase mvel perante uma fase estacionria.
Normalmente, neste mtodo analtico a fase mvel ou eluente uma soluo lquida e a
fase estacionria ou resina uma superfcie slida. A separao de partculas ocorre na
fase estacionria presente na coluna, dependendo da afinidade entre esta e o analito.
Deste modo, a rea de contacto maior entre a fase estacionria e o composto em
estudo o que permite maior eficincia de separao.

48

O sistema do processo de cromatografia, em termos genricos divide-se em:
1. Sistema de alta presso no qual a fase mvel bombeada;
2. Injector de amostras do tipo loop;
3. Coluna;
4. Sistema de deteco (ndice de refraco, condutividade, UV, amperiometria,
espectrofotometria, entre outros);
5. Software para a aquisio e tratamento de dados.

Figura 3: Esquema representativo do processo HPLC

A amostra lquida introduzida na corrente do eluente, e a partir da corrente que os
compostos so separados medida que se deslocam pela coluna, dependendo do seu
tamanho e/ou peso molecular. Em seguida, o detector regista o ndice de refraco (para
o equipamento em uso), e de seguida transmite um sinal um computador que o
transforma num cromatograma atravs de um software.
O RID aplicados nas determinaes de acares, no so selectivos e geralmente so
utilizados para complementar os detectores de UV. Nestes detectores so registadas
todas as zonas de eluio que tenham um ndice de refractividade diferente do de uma
fase mvel. O sinal emitido mais intenso quanto maior for a diferena entre os ndices

49

de refratividade da amostra e da fase mvel. Os detectores de ndice de refraco so
aproximadamente 1000 vezes menos sensveis do que os detectores UV (Meyer, 1997).
Sendo o objectivo do trabalho a validao do mtodo de determinao de acares por
HPLC-RID, optimizar as condies experimentais e de leitura e determinar os principais
parmetros do processo aplicados determinao da frutose, glucose, sacarose, maltose
e lactose.

4.3. Metodologias Analticas
4.3.1. Equipamentos
O HPLC de modelo LC-2010A liquid chromatograph (Shimadzu), constitudo por:
autosampler, bomba quaternria, forno, uma coluna analtica de ao inox (Waters), com
dimenses de 300x3,9mm e do tipo Carbohydrate analysis, um detector de ndice de
refraco de modelo RID 10A (Shimadzu) e software do equipamento LCsolutions para
analisar os dados.
Para este equipamento as condies experimentais mantidas foram:
Na coluna a presso entre 1000 a 1500 psi e a temperatura a 60C;
A fase mvel, FM, constituda por acetonitrilo (Fisher Chemical) e gua com
razo de 80:20 (v/v) e fluxo de 2 mL/min;
Nestas condies o tempo de anlise foi 20min.
Contudo a presso pode variar dependendo do estado de colmatao da coluna, o que
vai interferir com o fluxo da fase mvel, isto , quanto maior for a presso menor ser o
fluxo da fase mvel, que varia entre 0,5 a 2 mL/min. Estas condies tambm podem
fazer variar o tempo de anlise, pois se diminuir o fluxo da fase mvel tem-se de
aumentar o tempo de anlise entre 20 a 50 min.


50

4.2.2 Mtodo Analtico
A quantificao dos acares conseguida a partir de uma recta de calibrao obtida
pela equao que relaciona a rea do pico (sinal do analito) em funo da concentrao
dos padres. Preparam-se padres de frutose, glucose, maltose e sacarose (SIGMA) e
sacarose (Riedel de Han) de forma a obter concentraes entre 1,0 % a 3,0 %
(massa/volume (m/v)), isto , 1,0 a 3,0 g/100mL e prefazendo o volume com gua
bidestilada. Aps a sua filtrao com filtros de seringa de Nylon de 0,2 m para vials
(recipiente de vidro com amostra introduzido no HPLC) os padres analisam-se no
HPLC, obtendo-se a recta de calibrao.
Tambm foram efectuadas a anlise em amostras de alimentao humana e animal e
soros. Para esta anlise, as amostras tm de ser previamente preparadas. Pesam-se as
amostras entre 1 a 5 g para frasco, dependendo do teor de acar esperado. Adicionam-
se cerca de 30mL de gua bidestilada a 80C e levam-se ao ultra-sons durante 15 min.
Seguidamente, transferem-se para bales volumtricos de 50 mL, lavam-se os frascos
com gua bidestilada e aferem-se os bales pelo menisco. Filtram-se as amostras com
papel de filtro. Passam-se a amostra filtrada por colunas C18 e por fim filtrar com os
filtros de seringa de Nylon de 0,2 m para vials. Em amostras lquidas, como sumos,
refrigerantes e bebidas alcolicas, as amostras tm de ser desgaseificadas e apenas se
filtram com filtros de seringa de Nylon de 0,2 m.

4.3 Apresentao dos Resultados
Foram estabelecidas as condies experimentais tais como: composio e fluxo da fase
mvel, bem como o tempo de anlise, a temperatura do detector e o volume de injeco
do analito. Para obter uma simetria dos picos do cromatograma foi usado
acetonitrilo:gua, como fase mvel na proporo de 80:20 (v/v), com um fluxo
constante de 2 mL/min, obtendo-se o tempo de analise de 20min. Para determinar a
curva de calibrao foram injectados 20 L dos padres. Entretanto, o RID requer um
controlo de temperatura, sendo a condio favorvel de 60C. A figura seguinte
apresenta o cromatograma representativo de um padro deste mtodo analtico para
determinar o teor de acares.

51


Figura 4: Cromatograma representativo dos padres de acares: frutose (a) a 4,72
min; glucose (b) a 5,90 min; sacarose (c) a 11,15 min; maltose (d) a 14,27 min e lactose
(e) a 17,05 min.

A anlise da frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose foram executadas em
simultneo. Com a leitura de cada padro obteve-se individualmente cada um dos
acares e fez-se a sua identificao atravs dos tempos de reteno dos picos no
cromatograma. O cromatograma representativo de um padro evidencia a simetria dos
picos, bem como os tempos de reteno dos vrios tipos de acar, nas condies
operacionais descritas anteriormente.
Na generalidade os alimentos no tm todos os tipos de acar, como demonstra a
figura 5. Para a distino dos picos dos mesmos e respectiva composio nos
cromatogramas analisa-se os tempos de reteno e a amostra. Por exemplo, quando se
tem dvidas em atribuir o pico ao acar correspondente pode-se atravs da composio
da amostra saber qual o acar.


52

Figura 5: Cromatograma representativo de uma amostra: torta de morango. Onde:
frutose (a); glucose (b); sacarose (c) e maltose (d).

Por vezes pode-se confundir o pico da maltose com o pico da lactose e s se distinguem
atravs do tipo de amostra, ou seja, que tipo de acar mais comum aparecer na
amostra em anlise. Os acares mais abundantes so a frutose, glucose e sacarose,
sendo este ltimo o que mais se destaca.
No processo de validao, o estudo da linearidade foram feitas as leituras de seis
padres, com concentraes de 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 g/100mL. A figura 4 apresenta as
rectas de calibrao obtidas na leitura do HPLC-RID sob a forma rea do pico em
funo da concentrao dos correspondentes acares.

53


Figura 6: Variao da rea dos picos em funo da concentrao dos padres dos
acares

Tabela 6: Caracterizao das rectas de calibrao dos acares e os respectivos factores
de correlao
Monossacardeos Recta de Calibrao Factor de correlao
Frutose 0,9971
Glucose 0,9989
Sacarose 0,9986
Maltose 0,9992
Lactose 0,9979

A linearidade obtm-se a partir da relao rea em funo das concentraes dos
padres dos acares no intervalo de concentrao de estudo. Para se poder comprovar a
linearidade deve-se calcular os desvios padres residuais da funo de calibrao, a
diferena das varincias (equao 3, do alnea 2.1.1.) e o valor do teste F (equao 4, do
alnea 2.1.1.). Este ltimo parmetro, posteriormente, comparado com o valor da
distribuio de F de Snedecor/Fisher.

100000
600000
1100000
1600000
2100000
2600000
0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
r
e
a

d
o

p
i
c
o
Concentrao (g/100mL)
Frutose
Glucose
Sacarose
Maltose
Lactose

54

Tabela 7: Valores de para os acares
Monossacardeos
Distribuio de tabelado a
99% (N=5)
Frutose 1,89
15,98
Glucose 0,84
Sacarose 1,54
Maltose 3,11
Lactose 1,57

Ao relacionar o com a distribuio de tabelado a 99% foi verificado que
em todos os acares so menores que tabelado, sendo assim pode-se
comprovar a linearidade das funes de calibraes.
Os parmetros obtidos no estudo da validao como a sensibilidade, preciso,
coeficiente de variao e desvio padro, limite de deteco e limite de quantificao
esto representados na tabela 8.
Os valores de sensibilidade, obtidos atravs do declive da recta de calibrao,
demonstram que o mtodo apresenta maior sensibilidade para a sacarose, seguem-se a
glusoce, frutose e maltose e por fim a lactose. Estes resultados indicam que para uma
variao equivalente de concentrao dos acares, o detector apresenta maior sinal
para a sacarose, induzindo maior variao de rea do respectivo pico em relao aos
restantes acares.
A determinao da preciso, foi efectuada a partir da leitura de dez vezes de uma
amostra, que continha apenas frutose, glucose, sacarose. A repetibilidade da
determinao da frutose, glucose e sacarose foram 7,77; 6,24 e 3,22 % respectivamente.
Atravs destes resultados pode-se afirmao que a quantificao dos acares obedeceu
ao critrio, r10%. A sacarose foi a que apresentou os valores mais precisos, ou seja os
valores obtidos na anlise da sacarose so os mais reprodutveis.
Santos et al (2006) determinaram os parmetros de validao no mtodo HPLC-RID
para anlise de acares (frutose, glucose e sacarose) em amostras de processo de
produo de polmeros biodegradveis. Obtiveram valores de preciso dados pelo

55

coeficiente de variao para a frutose, glucose e sacarose de 3,60; 3,92 e 4,71%
respectivamente. Outros autores como Chvez-Sern et al (2004) analisaram mono- e
dissacardeos no leite atravs de HPLC-RID, tendo desenvolvido o processo de
validao do respectivo mtodo. Estes autores tiveram como resultados da preciso para
a frutose, sacarose e lactose de 12,61; 8,58 e 16,39 g/100g. E os respectivos desvios
padres foram de 0,10; 0,09 e 0,08 g/100g. Pode ento concluir-se que os dados de
preciso so da mesma ordem de grandeza dos espectveis para este mtodo.
Para determinar o limite de quantificao foi considerado o padro mais pequeno, 1,0
g/100mL, seguindo o procedimento definido no ponto 2.1.2, estudo do limite de
quantificao atravs do primeiro padro da curva de calibrao. Na prtica foram feitas
dez leituras desse padro. O LQ para ser aceite como 1,0 g/100g, teve ser feito o clculo
do coeficiente de varincias e do erro (equaes 11 e 12 respectivamente no ponto
2.1.3.) e ambos tm de ser inferiores a 10%. De acordo com resultados (Anexo D), o LQ
para os acares o considerado. Relativamente ao LD, este trs vezes menor que o
LQ, desta forma o valor do LD de 0,3 g/100g.
Santos et al (2006), no seu estudo, apresentam valores de LQ para a frutose, glucose e
sacarose de 0,0728; 0,122 e 0,0512 g/kg (0,0073; 0,0122 e 0,0051 g/100g),
respectivamente. E no LD obtiveram 0,0218; 0,0367 e 0,0154 g/kg, (0,0022; 0,0037 e
0,0015 g/100g) respectivamente. Chvez-Sern et al (2004) indicam resultados de LQ
para frutose, glucose, sacarose e lactose de 0,27; 0,24; 0,26 e 0,38 mg/mL (0,027;
0,024; 0,026 e 0,038g/100g), respectivamente. E como valores de LD tiveram 0,17;
0,13; 0,16 e 0,25 mg/mL (0,017; 0,013; 0,016 e 0,025 g/100g) respectivamente. Como
j foi referido anteriormente, o clculo do LQ foi determinado atravs do estudo do
primeiro padro da curva de calibrao (descrito no capitulo 2, no ponto 2.1.2, alnea 2
do limite de quantificao), enquanto estes autores obtiveram este parmetro atravs dos
mnimos quadrados da recta de calibrao (descrito no capitulo 2, no ponto 2.1.2, alnea
3 do limite de quantificao). Embora com metodologias diferentes, que se podem
afirmar adequadas, verifica-se que os autores citados apresentam limites inferiores de
quantificao.
Para definir o critrio de aceitao do branco, foi preparado cinco brancos, cumprindo
todo o processo de determinao do teor de acares. Na anlise dos cromatogramas
obtidos no foi verificado nenhum pico dos acares. Os resultados obtidos obedecem o

56

que est estipulado, ou seja valor final foi igual ou inferior a um tero da leitura do
limite de quantificao e do primeiro padro.

57

Tabela 8: Parmetros do processo de validao do mtodo analtico (repetibilidade avaliada em amostras de sumo)
Parmetros Frutose Glucose Sacarose Maltose Lactose
Sensibilidade 789973 790863 850874 639765 621291
Linearidade de trabalho (g/100mL) 0,99 - 3,02 0,97- 3,11 0,97 - 3,04 0,97 - 3,02 0,96 - 3,01
Repetibilidade (%) 7,77 6,24 3,22 - -
Coeficiente de variao (%) 2,75 2,21 1,14 - -
Media S (g/100mL) 1,68 0,046 5,16 0,11 4,93 0,056 - -
LQ (g/100g) 1,0
LD (g/100g) 0,3
Branco < LD


58

59

Para clculo de incerteza foi avaliado a incerteza associada na preparao dos padres,
linearidade do mtodo e preciso global. O outro parmetro presente no clculo da
incerteza, a recuperao, no foi determinada experimentalmente, assim sendo foi
desprezado. O Anexo E exemplifica os clculos efectuados para a determinao
incerteza dos resultados da determinao dos acares.
Para a incerteza associada na preparao dos padres, calculada pela equao 20 teve-se
em conta a capacidade do material utilizado, bem como o seu erro associado. Ou seja,
numa balana avalia-se a quantidade que foi pesada, na pipeta a quantidade que foi
pipetada e no balo volumtrico o seu volume total.
Na linearidade, a respectiva incerteza foi calculada a partir da equao 21. O mtodo
avalia-se conforme o declive, o desvio padro, o nmero dos padres, a concentrao
dos padres, e neste caso, a rea do padro obtida pela recta de calibrao.
A incerteza relacionada com a preciso global, avaliado atravs da equao 22, foi a
ltima a ser estudada na prtica, e considera-se a mdia da concentrao e o desvio
padro obtidos nas dez leituras de uma amostra (tratando-se de um sumo nesta
avaliao).
A determinao da incerteza foi feita para a anlise da frutose, da glucose, e da sacarose
pelo facto de apenas existir em resultados da preciso global para esses trs acares.
Uma vez que no sumo em questo no foram identificados os restantes acares. A
tabela 9 indica os resultados obtidos das incertezas associadas preparao dos padres,
linearidade e preciso, bem como a incerteza global e a incerteza expandida. J
figura 7 demonstra a variao da incerteza global.
Com os resultados obtidos pode-se observar que com o aumento da concentrao dos
padres a incerteza vai diminuindo, excepto o ltimo padro que aumenta ligeiramente.
Esta uma situao explicvel uma vez que com padres mais baixos, utilizam-se da
medida com erros mais prximos dos valores medidos e a prpria repetibilidade dos
picos obtidos nos cromatogramas mais baixa. Verifica-se, tambm, que a frutose o
acar como menores resultados de incerteza. Ao contrrio da glucose que tem os
resultados da incerteza maiores.


60

Segundo a anlise da amostra apresentada no presente trabalho, a torta de morango,
pode referir-se que os respectivos teores de acares so, considerando a incerteza
estimada: 1,8 0,1 g/100g de frutose, 3,9 0,3 g/100g de glucose, 16,7 1,0 g/100g de
sacarose e 9,7 g/100g de maltose. A percentagem da incerteza obtida pelo grfico da
figura 7, considerando a linha correspondete a cada acar. A incerteza da glucose e da
sacarose, e uma vez que a concentrao na amostra superior concentrao
apresentada no referido grfico, foi considerada 7%. Isto resulta do facto de a partir da
gama de concentrao de 3,5 g/100 mL se verificar um patamar na incerteza estimada,
podendo-se extrapolar que no h variao de incerteza para concentraes superiores
A incerteza associada maltose no est apresentada uma vez que no foi estimada , por
no haver dados suficientes para a realizao da mesma.
De acordo com o boletim apresentado aos clientes o resultado do teor total de acar a
soma das concentraes de todos acares observados, assim, a amostra apresentada
tem com teor total de acar 32,1 1,9 g/100g.

Tabela 9: Variao da incerteza percentual em funo da concentrao
Monossacardeos
Concentrao
(g/100mL)
U
1
U
2
U
3
Ut (%)
U
expandido

(%)
Frutose
0,99 0,016 0,115 0,0087 11,6 23,2
1,55 0,016 0,070 0,0087 7,2 14,4
2,11 0,020 0,053 0,0087 5,7 11,4
2,49 0,002 0,050 0,0087 5,0 10,0
3,11 0,001 0,054 0,0087 5,5 11,0
Glucose
0,97 0,016 0,148 0,0070 14,9 29,8
1,51 0,016 0,093 0,0070 9,4 18,8
2,06 0,020 0,072 0,0070 7,5 15,0
2,42 0,002 0,067 0,0070 6,7 13,4
3,02 0,001 0,069 0,0070 6,9 13,8
Sacarose
0,97 0,016 0,147 0,0036 14,8 29,6
1,52 0,016 0,089 0,0036 9,1 18,2
2,07 0,020 0,067 0,0036 7,0 14,0
2,43 0,002 0,060 0,0036 6,0 12,0
3,04 0,001 0,045 0,0036 6,8 13,6

61


Figura 7: Variao da incerteza global em funo da concentrao

Avaliando os dados apresentados na literatura, o estudo do processo de validao deste
mtodo cromatogrfico para a determinao de acares em amostras slidas efectuado
neste trabalho adequado. Contudo o estudo da determinao do teor dos acares
complexo, por isso requer uma anlise mais aprofundada, principalmente no que diz
respeito condies experimentais e operacionais do equipamento.
Num estudo de anlise de acares por HPLC e com fase mvel de apenas acetronitrilo,
verificou-se que a temperatura da coluna tem um papel importante no desenvolvimento
nos resultados cromatogrficos e nos limites de deteco, principalmente quando a
coluna especfica para acares. Portanto, para reduzir o LD e o LQ conclui-se que se
deva reduzir a temperatura. Com o aumento da temperatura ocorre o desaparecimento
do pico correspondente glucose (Slimestad et al, 2006).
Chvez-Servn, et al (2004) apresentam resultados associados optimizao do mtodo
similar ao descrito no presente trabalho. Debruaram-se na anlise do efeito de duas
condies experimentais, tais como, a razo apropriada para a fase mvel
acetonitrilo:gua e o poder de extraco dos aucares dos alimentos na soluo
etanol:gua com razo de 1:1 (v:v). Os autores experimentaram a FM com razes de
concentraes de 75:25, 80:20, 85:15 e 90:10 e verificaram que a razo 75:25 (v:v) eluia
4
8
12
16
0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
I
n
c
e
r
t
e
z
a

G
l
o
b
a
l

(
%
)
Concentrao (g/100mL)
Frutose
Glucose
Sacarose

62

mais rapidamente os acares e desta forma obtinha uma melhor simetria nos pico, com
excepo de glucose e galactose que se sobrepunham. No que concerne soluo de
extraco, investigaram que o etanol extraia outros compostos para alm dos acares,
por isso utilizou as solues Carrez I e II para precipitar esses compostos.
Sims (1995) observou que a anlise de HPLC limitada na determinao dos acares
em alimentos que contm sal (NaCl), porque ocorre a eluio do sal, que na obteno
dos resultados interfere com os acares. O autor prope como soluo para este
problema a adio de uma pequena percentagem de cloreto de sdio na fase mvel para
ajustar a selectividade do pico do sal, mantendo a resoluo dos picos dos acares. Esta
soluo pode ser usada em todas as matrizes alimentares, incluindo alimentos que no
contm sal. A adio de cloreto de sdio na fase mvel no tem qualquer inconveniente
tanto na coluna como nos tempos de reteno. Esta modificao simples dever ser til
na anlise dos acares em diversas matrizes alimentares, particularmente na rotulagem
nutricional.

63

Concluso
Concluso

O desenvolvimento e aprofundamento do saber promovem o aumento do conhecimento
e a aquisio de metodologias de trabalho importantes para a insero numa actividade
profissional. Desta forma possvel afirmar que com presente estgio foram adquiridas
competncias em todo o processo de o controlo da qualidade a nvel analtico,
nomeadamente em amostras de gua de consumo, superficiais e subterrneas. Foram
realizadas inmeras anlises associadas determinao de propriedades fsicas
agregadas, propriedades qumicas agregadas, compostos inorgnicos no metlicos,
compostos orgnicos individuais e metais.
Ao longo do perodo de estgio foi promovida a aquisio de aptides nos mtodos
cromatogrficos, proceder aos clculos dos processos de validao e incerteza para que
os laboratrios consigam cumprir os requisitos de ensaios e calibraes descritos na NP
17025:2007.
Globalmente, foi possvel estar enquadrada num grupo de trabalho interessado e
competente que promoveu o interesse por esta rea de actividade. Foi ainda possvel
contactar com as dificuldades do dia-a-dia empresarial mas tambm com as ferramentas
necessrias para ultrapassar essas mesmas dificuldades.

Concluso

64

65

Bibliografia
Bibliografia

1. ALWAEL, H.; CONNOLLY, D.; PAULL, B.; Liquid chromatographic profiling
of monosaccharide concentrations in complex cell-culture media and fermentation
broths Anal. Methods, Vol. 3 (2011) 62-69.
2. BRS, I., RATOLA, N., ALVES, A., Uncertainty in the Quantification of
Pentachlorophenol in Wood Processing Wastewaters by SPME-CG-MS Journal
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Analysis of mono- and disaccharides in milk-based formulae by high-performance
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Estabelece normas, critrios e objectivos de qualidade com a finalidade de
proteger o meio aqutico e melhorar a qualidade das guas em funo dos seus
principais usos. Revoga o Decreto-Lei n. 74/90 de 7 de Maro
8. DECRETO-LEI n243/01. D. R. Srie I-A. 206 (2001-09-05) 5754-5765. Aprova
normas relativas qualidade da gua destinada ao consumo humano transpondo
para o direito interno a Directiva n. 98/83/CE, do Conselho, de 3 de Novembro,
relativa qualidade da gua destinada ao consumo humano.
Bibliografia

66

9. DECRETO-LEI n306/07. D. R. Srie I. 164 (2007-08-27) 5747-5765. Estabelece
o regime da qualidade da gua destinada ao consumo humano, revendo o Decreto-
Lei n. 243/2001 de 5 de Setembro, que transps para a ordem jurdica interna a
Directiva n. 98/83/CE, do Conselho, de 3 de Novembro.
10. DEMIATE, I. M., WOSIACHI, G., CSELUSNIAK, C., NOGUEIRA, A.,
Determinao dos acares redutores e totais em alimentos. Comparao entre o
mtodo colorimtrico e titulimtrico Exact and Soil Sciences, Agrarian, S.
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Bibliografia

70

Anexos

73

Anexo A: Tabela da distribuio F de Snedecor/Fisher

Tabela A 1: Distribuio F de Snedecor/Fisher com percentual de 99%


74

75

Anexo B: Critrios de Controlo de Qualidade
Tabela B 1: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de amnia
em guas
Controlo Periodicidade Critrio
Curva de
calibrao
Anual excepto se
houver interveno
no equipamento
Recta de calibrao, pelo menos 3
padres, de primeira ordem. Padres a
variar entre 0,05-0,55 mg (NH
4
)/L,
onde R0,995
Limiares
analticos
Mensal O coeficiente de variao e o erro
relativo mdio ao longo do tempo deve
ser 10%
LQ=0.05mg/L; LD=0,02mg/L
Branco Dirio <0,02(Abs)
Repetibilidade Dirio Realizar com uma frequncia mnima
de 5% do total das amostras 6,84% em
valor relativo
Preciso Dirio 0,17< PC <0,23mg/L
Exactido Pelo menos um por
ano
Avaliada atravs de ensaios
interlaboratoriais critrio baseado na
anlise dos Z-scores da entidade
organizadora.
Incerteza Recalculada
anualmente
Calculada com base nos ensaios
interlaboratoriais e preciso intermdia.
5,6% em valor relativo
Sensibilidade Dirio -0,0045< ordenada <0,0104
0,8698< declive <1,0771
Padres nos
Extremos
Dirio Verificar diariamente os padres dos
extremos:
0,0417< Pi <0,0600 (Abs)
0,4354< Pf <0,5316 (Abs)
Ensaio de
recuperao
Mensal Realizar o ensaio com amostras reais
quantificadas.
Recuperao de 100 10%


76

Tabela B 2: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de cloretos
em guas
Limiares
analticos
Mensal O coeficiente de variao e o erro relativo
mdio ao longo do tempo deve ser 10%
LQ=8,7; LD=3,3 mg (Cl
-
)/L
Branco Diria <0,13mL de AgNO
3
(C=0,10N)
<0,71mL de AgNO
3
(C=0,02N)
Repetibilidade Diria Realizar com uma frequncia mnima de 5%.
Superior a 35,5 mg/L 5,6%;
At 35,5mg/L 5,6225 em valor relativo.
Preciso Diria Realizar a anlise de um padro de controlo de
NaCl 15,812 < PC < 22,210 mg(Cl
-
)/L
Exactido Pelo menos um por
ano
Avaliada atravs de ensaios interlaboratoriais
critrio baseado na anlise dos Z-scores da
entidade organizadora.
anualmente
Aferio do
AgNO
3

Diria Fazer a aferio em duplicado,
Abs (Vaf1-Vaf2)<0,2mL
Titulante com C=0,02N 0,0192 <N< 0,0203
Titulante com C=0,10N 0,0948 <N< 0,1008
Ensaio de
recuperao
quantificadas. Recuperao de 100 10%

77

Tabela B 3: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de fluoretos
em guas
Curva de
calibrao
Diria Recta de calibrao, pelo menos 3
variar entre 0,5-2 mg (F
-
)/L, onde
R0,995
Limiares
analticos
ser 10%
LQ= 0,5; LD=0,2mg(F
-
)/L
Repetibilidade Srie/Dia de anlise Realizar com uma frequncia mnima
de 5% do total das amostras 7,5570%
em valor relativo
Preciso Srie/Dia de anlise 0,899< PC <1,088mg(F
-
)/L
Exactido Pelo menos um por ano Avaliada atravs de ensaios
organizadora.
anualmente
Sensibilidade Diria 1,7770< ordenada <2,8442
(-) 0,0215< declive < (-) 0,0156
Ensaio de
recuperao
quantificadas. Recuperao de 100
10%


78

Tabela B 4: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de nitratos
em guas
Curva de
calibrao
Srie/Dia de anlise Recta de calibrao, pelo menos 3
variar entre 1-25 mg (N-NO
3
)/L, onde
R0,995
Limiares
analticos
ser 10%
LQ=1mg/L; LD=0,33mg/L
Branco Srie/Dia de anlise <0,02(Abs)
Repetibilidade Srie/Dia de anlise Realizar com uma frequncia mnima
de 5% do total das amostras 8,8256%
em valor relativo
Preciso Srie/Dia de anlise 7,794< PC <10,316mg/L
organizadora.
anualmente
Sensibilidade Diria -0,0242< ordenada <0,0321
0,0557< declive <0,0705
Ensaio de
recuperao
quantificadas.

79

Tabela B 5: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de nitritos
em guas
Curva de
calibrao
Anual Recta de calibrao, pelo menos 3
variar entre 0,01-0,05 mg (NO
2
)/L,
onde: R0,995
Limiares
analticos
ser 10%
LQ = 0,01 mg (NO
2
)/L; LD = 0,003 mg
(NO
2
)/L
Branco Diria <0,004(Abs)
Repetibilidade Diria Realizar com uma frequncia mnima
valor relativo
Preciso Diria 0,027< PC <0,038 mg(NO
2
)/L
organizadora.
anualmente
Sensibilidade Anual (quando se
realiza a recta de
calibraao)
-0,02883< ordenada <0,02989
0,83162< declive <1,14578
Ensaio de
recuperao
quantificadas.
Padres nos
extremos
Diria Verificar diariamente um em cada
extremo
0,0094 <Pi <0,0128 (Abs)
0,0455< Pf <0,0531 (Abs)


80

Tabela B 6: Critrios de controlo de qualidade para a determinao do teor de sulfatos
em guas
Curva de
calibrao
Srie/Dia de anlise Recta de calibrao, pelo menos 3
variar entre 10-40 ppm, onde: R0,995
Limiares
analticos
ser 10%
LQ=10 ppm; LD=3,3 ppm
Branco Diria <0,0005(Abs)
valor relativo
Preciso Srie/Dia de anlise 20,17 < PC < 29,37 mg/L
organizadora.
anualmente
Sensibilidade Diria -0,05854< ordenada <0,1747
0,0132< declive <0,0223
Ensaio de
recuperao
quantificadas. Recuperao de 100
10%

81

Tabela B 7: Critrios de controlo de qualidade para a determinao da turvao em
guas
Curva de
calibrao
Trimestral, excepto se
houver alterao no
equipamento
Recta de calibrao, pelo menos 3
variar entre 0,30-10NUT, onde:
R0,995
Limiares
analticos
ser 10%
LQ = 0,30 NTU; LD = 0,06 NTU
Branco Diria 0,0095-0,0822
valor relativo
Preciso Diria 3,57 < PC <4,37NTU
organizadora.
anualmente
Sensibilidade Trimestral (quando se
realiza a recta de
calibraao)
-0,0332< ordenada <0,0915
0,9022< declive <1,0119
Ensaio de
recuperao
quantificadas.
Padres nos
extremos
Diria Verificar diariamente um em cada
extremo
0,2876 <Pi <0,3714 NTU
9,0243< Pf <10,1652 NTU


82

83

Anexo C: Boletins exemplificativos
Boletim exemplificativo de controlo de inspeco


84

85



86

87



88

Boletim exemplificativo genrico

89



90

91

Anexo D: Determinao do Limite de Quantificao

Tabela D 1: Resultados do Limite de Quantificao
Frutose Glucose Sacarose Maltose Lactose
1,2 1,10 1,06 0,96 1,13
1,1 1,20 1,04 1,07 1,12
0,9 1,10 1,07 0,90 1,06
1,0 0,96 1,11 1,06 1,05
1,2 1,15 0,99 0,89 1,05
1,0 1,15 0,91 0,88 1,13
1,0 1,10 0,91 0,88 1,02
1,0 1,06 0,90 0,87 1,13
1,0 1,06 0,90 0,87 1,11
1,1 1,08 0,91 0,89 1,12
Mdia 1,06 1,10 0,98 0,93 1,09
Desvio Padro 0,10 0,06 0,08 0,08 0,04
Er (%) 5,68 9,6 2,2 7,2 8,8
C.V. (%) 9,35 5,9 8,5 8,3 4,1


92

93

Anexo E: Exemplificao do clculo de incerteza

Tabela E 1: Erros associados ao material usado na preparao das solues padres dos
acares (frutose, glucose e sacarose)
Material Erro associado Referencia
Balo volumtrico 100 mL 0,1 mL V
1
Balo volumtrico 25 mL 0,04 mL V
2
Pipeta volumtrica 20 mL 0,03 mL V
3
4
5
Pipeta 1 - 5 mL 0,04 mL V
6
Balana 0,001 g B

Tabela E 2: Exemplificao e valores do clculo da incerteza associada preparao dos
padres dos acares (frutose, glucose e sacarose)
Solues
padres
Medida Material
1,00
V = 8 (V = 5+3) V
6
+ V
6

0,0156
V = 25 V
2

1,50
V = 12,5 (V = 10+2,5) V
5
+ V
6

0,0162
V = 25 V
2

2,00
V = 17 (V = 15+2) V
4
+ V
6

0,0202
V = 25 V
2

2,50
V = 20 V
3

0,0022
V = 25 V
2

3,00
m = 3,0221 B

0,0011
V = 100 V
1


94

Tabela E 3: Valores experimentais dos parmetros , , e a incerteza associada curva
de calibrao, , (m=1 e n=6)
Monossacardeos (g/100mL)
Frutose
0,99 742024 0,129 0,115
1,55 1176817 0,114 0,070
2,11 1611610 0,109 0,053
2,50 1909244 0,111 0,050
3,11 2384575 0,124 0,0538
Glucose
0,97 792817 0,158 0,148
1,51 1214474 0,143 0,093
2,06 1636130 0,140 0,072
2,48 1963811 0,147 0,067
3,02 2385743 0,166 0,069
Sacarose
0,97 762485 0,161 0,147
1,52 1216351 0,143 0,089
2,07 1670218 0,135 0,067
2,53 2055706 0,137 0,060
3,04 2477092 0,152 0,045

95

Tabela E 4: Resultados de repetibilidade dos acares: frutose, glucose e sacarose
Repetibilidade
Frutose Glucose Sacarose
1,6445 5,1271 4,8316
1,7252 5,0637 4,8445
1,7056 5,0629 4,9060
1,7298 5,1964 4,9765
1,6212 5,1111 4,9416
1,6454 4,9718 4,9256
1,6741 5,2392 4,9276
1,6058 5,2988 4,9909
1,6784 5,3409 4,9865
1,7320 5,14728 4,9713
Mdia 1,6762 5,1559 4,9302
Desvio Padro 0,0462 0,1141 0,0563

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