Mtodo analtico para a deteco de terapias emergentes e
medicamentos no aprovados em controles de dopagem
humanos 1 Introduo Com o constante aumento do conhecimento sobre os mecanismos bioqumicos em nvel celular e molecular, mais e mais opes para intervenes farmacolgicas foram identificados que sugerem novos caminhos para terapias desejados potencialmente permitindo cura para graves doenas, se no fatais. O outro lado dessa investigao a potencial utilizao indevida oferecida por um subconjunto de candidatos a novos frmacos, especialmente aqueles que promovem o crescimento muscular, estimular a produo de eritrcitos, ou aumentar a resistncia fsica e desempenho atltico por outras vias [1]. Tais drogas candidatos foram oferecidas e vendidas atravs de provedores baseados na Internet h anos, apesar da falta de aprovao clnica e, em alguns casos, a interrupo de seu desenvolvimento devido a efeitos colaterais graves. A 'clientela' alvo dessas ofertas composto de recreio, bem como atletas profissionais, com estes ltimos em risco de violar os regulamentos estabelecidos pela Agncia Mundial Anti-Doping (WADA) [2]. Estes regulamentos, tal como apresentado na Lista de Substncias Proibidas da WADA incluem uma categoria de substncias especialmente dedicada a esses compostos, ou seja, / suspensa candidatos 'no aprovados para uso humano' de drogas, conhecido como S0. A fim de permitir controles de dopagem abrangentes, atualizao de laboratrios acreditados, expandir e melhorar a sua carteira de ensaios analticos, a maioria dos quais dependem de espectrometria de cromatografia de massa se aproxima [3,4]; No entanto, a implementao de novos compostos em protocolos de testes de drogas esportes requer uma quantidade substancial de informaes, incluindo dosagem teraputica, farmacocintica, metabolismo e eliminao. Alm disso, as propriedades fsico-qumicas especficas poderia exigir coleo dedicada amostra e condies de transporte, a preparao da amostra ou procedimentos analticos para garantir a sensibilidade e especificidade necessrias para detectar o analito alvo com limites de deteco (LOD) [5] Com as restries no oramento, tempo, volume de amostra (s), pessoal de laboratrio e instrumentao, laboratrios de testes de drogas esportes, porm, so instados a combinar o nmero de testes de deteco possvel, sem comprometer as exigncias analticas necessrias, de preferncia utilizando e ampliando abordagens analticas existentes. Assim, menus de teste precisam ser organizados de forma racional e sua adequao finalidade como procedimento de teste inicial adequada tem de ser demonstrada. Enquanto antigamente classes de drogas ditou a composio de ensaios analticos, hoje em dia o equipamento analtico disponvel normalmente rege as estratgias de ensaio utilizados [3]. At o momento, matrizes de controle de dopagem de rotina so urina, soro e sangue, ocasionalmente complementada por matrizes alternativas, como o cabelo, potencialmente, fornecendo elementos de prova. Os protocolos de coleta de seguir os regulamentos rigorosos e exigem formao de controle de dopagem diretores / flebotomistas; tempo e as condies de transporte devem ser controlados e documentados especialmente no caso de amostras de sangue para o Passaporte Biolgico Atleta (ABP), onde tambm se aplicam aos prazos para transporte e anlise. Alm disso, o armazenamento da amostra (urina e soro) tem que ser assegurada por at 10 anos para permitir re-teste, se solicitado. Na presente reviso, a literatura publicada entre 2009 e 2013 a respeito emergente 'designer', e as drogas so discutidas no mbito do controlo de dopagem humanos descontinuado. Desafios decorrentes da caracterstica estrutural de substncias so apresentados e estratgias de identificao e de deteco de metabolito so descritos para um grupo representativo de compostos que abrangem analitos de massa molecular baixa e alta da composio de cido no-peptdico, peptdico, e ribonucleico. 2. compostos que afetam o desempenho do msculo esqueltico Devido ao substancial nmero de compostos com impacto evidente ou presumido na fisiologia do msculo esqueltico e / ou desempenho, as substncias consideradas na seguinte so divididos nas categorias de produtos de baixa e alta massa molecular. 2.1. Substncias de baixa massa molecular 2.1.1. Estabilizadores do receptor de rianodina-calstabin complexo (Rycals)
Estudos sobre a arritmia cardaca, bem como sarcopenia (como definido como a perda relacionada com a idade de massa muscular, fora e capacidade de exerccio) e distrofia muscular revelaram a relevncia do receptor rianodina 1 (RyR1) e seu canal de Ca2 + complexo parceiro edifcio molcula calstabin-1 (protena de ligao FK506 12, FKBP12) no que diz respeito funo muscular esqueltico e cardaco normal. Substancial de investigao sobre os mecanismos de modificaes ps-traducionais foi realizado em modelos animais e, mais recentemente, tambm nos seres humanos, indicando especialmente S-nitrosylation e (hiper) fosforilao de RyR1 como principais fatores do AGING-, doena-, ou induzida por exerccio-comprometimento funcional dos micitos [6-8]. Uma terapia potencial baseado em derivados de benzotiazepina candidatos a frmacos, tais como a teraputica de primeira e de segunda gerao JTV- 519 e S107 (Fig. 1a, 1 e 2) [9], que tem sido mostrado para reduzir a fadiga do msculo e melhorar a capacidade de exerccio em roedores de laboratrio de restaurao do complexo RyR1-FKBP12. Consequentemente, a relevncia de tais compostos para testes de drogas esportes foi reconhecido e foram estabelecidos ensaios de deteco para as drogas intactas e / ou gerados in vitro metablitos no sangue e na urina. O comportamento de espectrometria de massa de JTV-519 e S-107 foi estudado por extenso, que utiliza ionizao por electro pulverizao (ESI) e induzida por coliso de dissociao (CID) [10], bem como de ionizao de eltrons (EI) [11], utilizando alta resoluo / alto espectrometria de massa preciso, rotulagem istopo estvel e, em caso de ESI-CID, experimentos H D-exchange /. Por meio das informaes obtidas, foram desenvolvidos mtodos de ensaio para a urina [10,11] e plasma [12] que permite a deteco de molculas intactas na LODs de 0,1-6 ng / ml. No caso de plasma do sangue, as concentraes de pico dos candidatos a frmacos aps a dosagem teraputica foram esperados a cerca de 40 ng / ml, que foi bem dentro da janela de deteco do mtodo de teste desenvolvido. Na ausncia de dados sobre o metabolismo e eliminao (renal) das benzotiazepinas, as amostras de urina foram sujeitos a uma hidrlise enzimtica, seguido por extraco lquido-lquido (LLE) dos analitos alvo e a deteco subsequente por meio de cromatografia lquida - (em tandem ) Espectrometria de massa (LC-MS / MS) ou cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS). Para complementar ainda mais a abordagem analtica com metablitos putativos, fase I e fase II reaes metablicas foram simulados para S-107 in vitro, produzindo espcies predominantemente N e S-oxigenados, bem como metablitos N e O-desmetilados. Alm disso, os conjugados de cido glucornico do frmaco inalterado e do seu produto metablico fase-I-O desmetilao foram detectados representam alvos viveis para os controlos de dopagem futuro [13]. Alm disso, o desenvolvimento de compostos derivados de benzotiazepina de prxima gerao precisa de uma anlise mais aprofundada, por exemplo, no que diz respeito ao candidato a droga de ensaio clnico de fase II referido como ARM036 (Aladorian, fig. 1a, 3) [14], o espectro de massa de produo o qual apresentado na Fig. 1b. 2.1.2. Moduladores de receptores andrgenos seletiva (SARM) Moduladores de receptores andrgenos seletivos no esterides (SARM) tm sido objeto de extensos estudos pr-clnicos e clnicos desde a primeira em compostos da classe foram identificados em 1998, predominantemente visando o tratamento e preveno da sarcopenia, osteoporose e perdas relacionados com a doena do msculo esqueltico massa, fora e funo [15,16]. Alm disso, a utilidade potencial de SARMs em cardiologia foi discutido [17], e o interesse substancial em novas entidades de drogas com propriedades SARM-como ainda est na inclinao de acordo com comentrios recentes [16,18] e publicaes sobre os avanos na SARM- investigao relacionada com [19-21]. Com o aumento da quantidade de possveis candidatos no- esterides e esterides drogas SARM, cujos exemplos so ilustrados na Fig. 2 (4-13), a carteira de compostos potencialmente mal utilizados em esportes expandida em conformidade [22,23] e ensaios de deteco mais ampla informao sobre o metabolismo e eliminao so vitais para controles de doping apropriadas. Consequentemente, estudos focados no metabolismo de SARMs e possibilidades de detectar intacta, bem como SARMs metabolizados foram iniciados e continuados, e foi demonstrada a relevncia ea necessidade de mtodos de ensaio adequados com os primeiros resultados analticos adversos (AAFS) para SARMs em 2010 e nos anos seguintes [24,25]. Foram estabelecidos os ensaios analticos para SARMs por plasma [12,26], manchas de sangue seco (DBS) [27], e na urina visando tanto as substncias intactas (plasma e DBS) ou metablitos principais (urina), identificados e caracterizados em em vitro [28] e in vivo [29-31]. Apesar das semelhanas estruturais entre algumas modestas SARM compreendendo por exemplo um radical 4-anilina substituda, uma grande heterogeneidade de farmacforos est presente em SARM actualmente investigada, incluindo (entre outros) arylpropionamide, quinolinona, tropanol, tetra- hidroquinolina, hidantona, tiofeno, fenil-oxadiazol, e derivados de esterides (Fig. 2, Tabela 1) . Por isso, vrios projetos foram necessrios fornecendo perspectivas sobre principais vias metablicas e do comportamento de espectrometria de massa de identificar e caracterizar compostos-alvo. Todos os SARMs recentemente estudados em um contexto de controle de doping demonstraram boas ou excelentes propriedades de ionizao usando spray de electro, apoiando assim a deteco sensvel destes compostos e produtos metablicos relacionados em amostras de teste de drogas esportes empregando estratgias baseadas em MS LC-MS / [3,32] . SARMs Arylpropionamide derivados estavam entre a primeira categoria de agentes anablicos emergentes investigada com ESI-MS / MS, EI-MS (/ MS), e em in vitro e em condies de metabolismo in vivo. Foi observada uma concordncia substancial entre os resultados de in vitro e estudos in vivo, e amostras de urina de estudo de ps-administrao do arylpropionamide SARMs derivados S-4 e S- 22 (Fig. 2, 4 e 5, respectivamente) predominantemente renderam os conjugados cido glucurnico das drogas intactas e correspondentes metabolitos mono-hidroxilados como analitos viveis para controlos antidoping de rotina [29,30] com LODs para os candidatos da droga encontrada intacta abaixo de 1 ng / ml. Complementares, LOD de 0,05-20 ng / ml [27,33] e 10 ng / ml de [26] foram determinados em DBS e do plasma, respectivamente, para a teraputica intactas. Substncia caracterizao por meio de tcnicas de espectrometria de massa, particularmente de LC-MS / MS empregando espectrometria de massa de alta resoluo / alto rigor, foi ainda realizada para as arylpropionamides relacionados S-1, S-9, S-23 e S-24 [34], todos dos quais tambm foram submetidos a sistemas que simulam reaes metablicas, tais como microssomal fgado humano [28] ou fngica [35] preparativos para fornecer material de referncia para as metas (provisrios) para testes de drogas esportes. De igual modo, as investigaes sobre a espectrometria de massa de SARM e sua deteco em urina humana foram conduzidos para quinolinona (por exemplo, LGD-2226, Fig. 2, 6), tetra- hidroquinolina (por exemplo, S-40503, 2 fig., 8), e de substncias derivadas de hidantona (por exemplo, BMS564929, fig. 2, 10) [34], complementado com estudos mais recentes sobre fenil-oxadiazol- (RAD140, fig. 2, 11) e base de SARM tropanol (ACP-105, fig. 2, 12) [36]. A eliminao da ACP-105 foi ainda estudado em um modelo de rato, demonstrando a produo de uma variedade mono diferente e metablitos bishydroxylated servindo como alvo preferido analitos como o composto administrado foi detectada intacta apenas at 24 horas [31]. Em contraste, humano in vitro e os estudos in vivo com RAD 140 sugeriu a utilizao do SARM administrado como composto-alvo para a dopagem urinria fins de controlo, as reaces metablicas apenas modestos para um anlogo de mono-hidroxilados foram observados e RAD140 foi detectado em amostras de ps-administrao de urina estudo at 8 dias [37]. Enquanto comentrios recentes na SARMs em desenvolvimento clnico nos referimos estrutura da droga candidato LGD-4033 no divulgado [16], os fornecedores de Internet de SARMs atribuiu 4 (2 - ((S) -2,2,2- trifluoro-1 hidroxietil) pirrolidin-1-il) -2 (trif luorometil) benzonitrilo (Fig. 2, 13) a ele. Apesar da ausncia de confirmao, a entidade de drogas faz parte das patentes da LIGAND farmacuticas sobre os compostos com SARM como propriedades [38] e, portanto, tambm um candidato para controles de doping. Assim, ensaios de deteco so necessrias, nomeadamente luz de sua disponibilidade indiscutivelmente ilcita e informaes sobre as propriedades de espectrometria de massa da substncia e do seu metabolito (s) so necessrios para complementar esportes rotina de testes de drogas (Fig. 3). 2.1.3. Ativadores das sirtunas-1 Sirtuins (1-7) representam uma famlia de enzimas dependentes de NAD + de desacetilase de histona, com sirtuina -1 (SIRT1) ser um regulador chave da desacetilao de substratos de protenas moduladoras do metabolismo, tais como protenas de caixa (forkhead FOXO) e do receptor activado pelo proliferador de peroxissoma ~ coactivator 1 ~ (PGC-1 ~) [39]. Desde a descoberta do efeito de ativar a SIRT1 do resveratrol com impacto significativo no msculo contedo mitocondrial esqueltico, vida til prolongada e anti-envelhecimento, bem como as propriedades antidiabticas em modelos animais, muito esforo foi investido em pesquisas sobre entidades sintticos de drogas ativador SIRT1 (STACS) [40,41]. Apesar de um amplo debate sobre o mecanismo (s) subjacente responsvel pelos efeitos benficos observados [42-46], uma srie de STACS levar candidatos a medicamentos, como SRT1720, SRT1460, e SRT2104 (Fig. 4, 14 e 15) foi produzido e tem sido objecto de ensaios clnicos avanados desde ento. O resultado, sem dvida comparvel de administrao STAC com outros moduladores metablicos, como por exemplo, AICAR (vide infra), em termos de farmacologicamente reforada resistncia tem provocado preocupaes quanto ao potencial de uso indevido dessas substncias. Consequentemente, foram estabelecidos ensaios analticos para STACS de primeira gerao e compostos modelo adicionais no sangue e na urina. Alm disso, in vitro e em estudos de biotransformao in vivo foram conduzidos para fornecer informaes sobre alvos viveis para janelas de deteco estendidos no teste de drogas esportes rotina. Substncias disponveis comercialmente e sintetizados referncia STAC incluindo SRT1720 e quatro compostos estruturalmente relacionados foram estudados quanto seu comportamento ESI-MS e MS / MS e medido a partir de plasma humano [47]. Um total de 100 l ~ do espcime foi enriquecida com uma de oito vezes de anlogo deuterado SRT1720 e resveratrol deuterado (normas internas), e as protenas plasmticas foram precipitadas por meio de acetonitrilo. O sobrenadante foi analisado por LC-ESI-MS / MS no modo de monitorizao de reaco mltipla (MRM), permitindo a deteco de limites entre 0,1 e 1 ng / ml. Considerando-se as concentraes plasmticas relatados de STACS em ensaios clnicos atingindo at 390 ng / ml, os LODs realizados demonstram a adequao ao objetivo da abordagem apresentada. A fim de complementar a abordagem com anlises realizadas a partir da urina, analitos alvo foram gerados usando em sistemas de biotransformao in vitro [48]. Principais reaces metablicas includos N-oxidao e hidroxilao, e os produtos resultantes foram ainda observados em estudos subsequentes administrao rato [49]. Por meio dos STACS intactas, o mtodo de ensaio foi caracterizado indicando limites de deteco para os analitos alvo em matriz urinria de 0,5 ng / ml. Ele continua a ser esclarecido se as drogas intactas ou metabolitos selecionados sero os compostos mais adequados para anlises de rotina de controle de doping; No entanto, a opo de princpio para detectar estes compostos no sangue / plasma e na urina estabelecida e tem a finalidade de pesquisa anti-doping pr-ativa e preventiva. 2.1.4. AICAR (5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonuclesido) Monofosfato de adenosina (AMP) - protena quinase ativada (AMPK) um fator essencial da biognese e funo [50] mitocondrial. Devido ao papel fundamental das mitocndrias do msculo esqueltico na sade e na doena, bem como em exerccio, numerosos estudos sobre as pelo menos parcialmente ilegveis mecanismos de biognese mitocondrial tm sido realizados com o objetivo de identificar potencial farmacolgico significa para curar geneticamente causado (por exemplo Duchenne muscular distrofia, DMD, ou esclerose lateral amiotrfica, ALS) e no-gentica (por exemplo, a obesidade ou a sndrome metablica) desordens [51]. O chamado regulador mestre de nmeros mitocondrial o mencionado anteriormente PGC-1 ~, controlando a clula 'potncia', que afetado por fatores de estresse, como a restrio calrica e exerccio [52]. A activao de PGC-1 ~ pode ser desencadeada por meio da expresso de genes, bem como as modificaes ps-traducionais, incluindo a fosforilao, a qual (entre outros factores) depende da atividade da AMPK, uma vez que apenas o fosforilada PGC-1 Acredita-se que ~ a ser subsequentemente preparado por via SIRT1 desacetilao e capaz de induzir a expresso do gene requerida para mitochondriogenesis. Esta interconexo, a relevncia da AMPK e sua ativao atravs de agonistas potentes como o 5-amino-4 imidazolecarboxamide ribonucleosido (AICAR, 4 Fig., 16) [53] ter sido a razo para incluir este composto e substncias relacionadas a Lista de Substncias Proibidas da WADA em 2009, primeiro classificado como substncia dopante gene e mais tarde como modulador metablico [2]. A administrao do AICAR natural e clula-permevel AMPK activador para roedores de laboratrio a 500 mg / kg / dia foi mostrado para activar eficazmente a AMPK via de sinalizao resultando numa melhoria da resistncia de ratinhos no treinado por 23- 44% [54]. Este apoiou a necessidade da incluso do composto em doping programas de controle, bem como o fato de que a substncia tenha sido prontamente disponvel como qumica e via fornecedores baseados na Internet [23], e supostamente encontrou seu caminho para o mundo do desporto enquanto isso [55, 56]. Devido ocorrncia natural de AICAR em urina humana, evidncia pr-necer para o uso ilcito da candidata no aprovada droga necessria estratgias sofisticadas de anlise semelhantes s abordagens utilizadas para a deteco de desvio esteride natural / endgeno. Por meio de espectrometria de cromatografia lquida / istopo conjunto de diluio de massa (LC-IDMS / MS), que ocorre naturalmente concentraes urinrias de AICAR foram quantificados em uma populao de 499 atletas, demonstrando uma correlao significativa de nveis urinrios AICAR e gnero, tipo de esporte (por exemplo, a resistncia ea fora do esporte) e ponto de tempo da coleta da amostra (ou seja, dentro / fora de competio) [57]. Um valor mdio de aproximadamente 2.200 ng / ml foi relatada, e tendo em considerao um outro conjunto de 500 amostras de urina coletadas de atletas de recreio, um nvel limite provisrio de 3500 ng / ml foi sugerido (resultados no publicados). No entanto, a simples ultrapassagem de concentraes urinrias Aicar acima dos valores de referncia no permitiro comprovar o abuso de AICAR sinttico, particularmente devido s variaes intra e inter-individuais substanciais; tal informao, no entanto, permitir e desencadear anlises mais apoiar ou refutar um possvel administrao AICAR e eventualmente revelar a fonte do composto (endgena ou exgena). Uma matriz alternativa presumivelmente conservao AICAR administrado durante um perodo prolongado de tempo o eritrcito. Aps a introduo na corrente sangunea, a AICAR foi demonstrado que atravessa a clula vermelha do sangue (RBC) da membrana, seguida da sua converso no derivado 5 ~ -monophosphate, o que no permite o seu efluxo a partir do RBC e provoca uma acumulao de a produzida AICAR- ribtido, sem dvida, para o tempo de vida do eritrcito. Assim, medindo concentraes AICAR-ribtido intra-eritrocitrios poderia fornecer informaes complementares para saber se os nveis anormalmente elevados prevalecer ou no. Um ensaio analtico quantitativo tambm com base na LC-IDMS / MS foi criado para AICAR-ribtido nas hemcias, e amostras de 99 atletas recreativos foram medidos para obter intervalos de valores fisiolgicos normais (10-500 ng / ml) da substncia a analisar [58] . Por meio de reaes in vitro de incubao, a administrao de doses farmacolgicas de AICAR foram simulados, demonstrando um aumento da presso intra-eritrocitrios concentraes AICAR-ribtido de 1-10 ~ g / ml fornecer a prova de conceito para esta abordagem. Mais dados para intervalos de referncia e amostras de estudo administrao autnticas sero necessrios para avaliar o significado destes nmeros; No entanto, o perfil intra-individual das concentraes Aicar pode ser uma contribuio sensvel ao passaporte biolgico Atleta (ABP) para permitir a sinalizao de um parmetro de sangue achado incomum. Resultados de testes conclusivos sobre a origem endgena ou exgena de uma substncia que ocorre naturalmente na amostra de controle de doping do atleta geralmente obtida por espectrometria de massa da relao isotpica (IRMS) [59]. Esta abordagem tcnica tem sido empregada com sucesso em anlises de esterides por mais de uma dcada em controles de doping, e sua utilidade para a resoluo do problema AICAR foi sugerido logo em 2010. Dois grandes obstculos tiveram que ser gerenciado para a anlise IRMS sucesso de AICAR, ou seja, a baixa volatilidade do analito, o que exige uma derivatizao antes da introduo da substncia no interior das cromatografia de combusto de gs-IRMS (/ IRMS GC C /) do sistema, e o isolamento a partir de urina de AICAR sem fraccionamento isotpica. Ambos os desafios foram recentemente resolvida, fornecendo um ensaio validado permitindo diferenciar sinttico e AICAR naturais por meio de sua assinatura istopo de carbono [60]. O mtodo de ensaio requer um volume de 3 ml de urina e amostras de urina actualmente com nveis AICAR maior do que 1500 ng / ml, so recomendados para serem submetidos a GC / C / IRMS. Devido s quantidades considerveis de AICAR na urina, tambm LC-IRMS, que comumente inferior a GC / C / IRMS em termos de sensibilidade analtica, tem sido considerada como um meio vivel de medir a assinatura isotpica do carbono; a data no entanto, nenhuma metodologia foi estabelecida ou relatados. 2.1.5. Os inibidores da fosfodiesterase-4 (PDE4) Na continuao da busca por terapias de apoio terapia de doenas relacionadas com a mitocndria, o impacto da fosfodiesterase-4 inibidores (PDE4) foi recentemente revista. Phosphodiesterases compreendem uma famlia de 11 membros atualmente conhecidos com caractersticas especficas e agentes de estimular ou inibir. PDE4, um alvo importante na doena pulmonar obstrutiva (DPOC), o tratamento crnico [61-63], catalisa a converso de 3 ~ -5 ~ monofosfato de adenosina cclico (cAMP) de 5 ~ - AMP. A sua inibio foi mostrado para resultar em uma srie de conseqncias que permitam explicar os efeitos benficos do resveratrol no especfico inibidor da PDE em modelos de teste animal [50,64], incluindo, entre outros, o aumento da biognese mitocondrial ea funo associada com uma melhor utilizao de gordura e, por ltimo mas no menos importante, maior o desempenho do exerccio. A administrao do arqutipo sinttico de PDE4 rolipram-inibidor (. Figura 4, 17) para roedores de laboratrio obtiveram resultados semelhantes, indicando que outro regulador principal do msculo esqueltico mitochondriogenesis a montante do acima relatado factores- chave (por exemplo, de AMPK e PGC-1 ~) possui foi identificado. Consequentemente, medicamentos aprovados e drogas candidatos nesta categoria, inevitavelmente, mudar- se para o foco do teste de drogas de esportes e organizaes de pesquisa doping preventivas, revelando um nmero considervel de pelo menos 50 candidatos que foram mencionados como potenciais agentes teraputicos com propriedades inibidoras da PDE 4 [65] ; no entanto, at data apenas um (roflumilast, 4 fig., 18) recebeu a aprovao clnica para o tratamento da DPOC [66,67]. Cilomilaste (Fig. 4, 19) avanou para a fase-III de ensaios clnicos [68], e inmeras novas entidades de drogas adicionais em desenvolvimento clnico pr-clnico ou incio recentemente foram resumidos em uma ampla reviso [65]. Devido a estes argumentos, a necessidade de testes de deteco capazes de triagem para inibidores da PDE 4 como o resveratrol, rolipram, roflumilast e cilomilast foi notado e primeiras abordagens analticas foram apresentados recentemente [69]. Com base em dados publicados DMPK e em reaes de incubao in vitro, analitos alvo foram selecionados e massa espectrometria caracterizada, incluindo as drogas intactas, bem como os principais metabolitos. Enquanto o roflumilast e cilomilast cada produziu principalmente um metabolito razoavelmente abundante in vitro (roflumilaste-N-xido e cilomilaste hidroxilado), rolipram foi convertido em seis produtos metablicos resultantes de hidroxilao intensas e reaces de desalquilao. Utilizando um protocolo de preparao da amostra estabelecida para as amostras de urina consistindo de hidrlise enzimtica seguida por LLE e subsequente anlise por LC-MS / MS, LOD de 1-5 ng / ml para os compostos de interesse foram realizadas, e os dados de prova-de- conceito foram alcanados com uma amostra de urina do doente recolhida aps o uso teraputico de roflumilaste. Devido ao aumento substancial no desempenho, como observado com roedores em um teste de esteira (time-to-exausto) eo nmero evi- dentemente elevado de mitocndrias no msculo esqueltico dos animais de experincia resultantes de administraes PDE4-inibidor, uso indevido dessas substncias no pode ser excludo e, pelo menos, a incluso em programas de monitoramento parece aconselhvel. 2.1.6. Peptdicos e no peptdicos secretagogos de GH (GHS) O multifacetado (e, possivelmente, melhorar o desempenho) efeitos do hormnio de crescimento humano (hGH), mediado principalmente via insulina como interesse substancial growth factor-1 (IGF-1) para o msculo esqueltico, provocaram e programas de pesquisa abrangente com inteno medicinal e teraputico no passado. Um dos muitos resultados notveis foi a descoberta de oralmente activos secretagogos da hormona do crescimento (GHS), com base em vrios diferentes, incluindo por exemplo farmacforos benzolactame, 4-spiropiperidina, capromorelin, e derivados de oxindole, tal como L-739943, MK-0677, CP-424391, e SM-130686, respectivamente, os quais esto descritos na fig. 4 exemplos como selecionados de uma enorme variedade de potenciais candidatos a frmacos [70,71]. Desde GHS estimular a secreo de hGH atravs de uma via alternativa a partir da hormona libertadora da hormona de crescimento (GHRH, vide infra) e, possivelmente, proporcionar efeitos sinrgicos [72], a sua evoluo clnica tem sido prosseguida complementar s terapias convencionais indicados na hGH / IGF-1 de cada eixo distrbios relacionados e declnio relacionado idade. Aumentos sustentados do plasma IGF-1 foram relatados em estudos de administrao GHS; no entanto, nenhum dos candidatos levar droga ainda recebeu aprovao clnica, possivelmente devido a benefcios limitados em comparao com terapias e substituio de hGH relataram o ganho de peso devido aos efeitos de estimulao de apetite de GHS. No entanto, os compostos tais como MK-0677 j esto disponveis atravs de fornecedores baseados na Internet e mtodos de deteco para a classe heterognea de GHS no peptdicos so desejveis em controlos antidoping de rotina, de preferncia utilizando metodologias comumente disponveis, tais como espectrometria de massa (Fig. 5-A) . Alm destes GHS oral disponvel, uma variedade considervel de hormnio de crescimento peptdeos liberando (GHRP), agindo atravs das mesmas vias sobre a secreo de hGH foi desenvolvido a partir dos trabalhos seminais de Bowers e colaboradores demonstraram a capacidade de pequenos peptdeos para regular a liberao de HGH no incio de 1980 [73-75]. Um representante (Pralmorelin, GHRP-2) recebeu aprovao clnica de 2004 no Japo como uma ferramenta de diagnstico para a deficincia de GH em adultos [76]. Enquanto a maioria dos GHRPs, uma seleo de que resumida na Tabela 2, que atualmente no possuem aprovao de qualquer autoridade de sade para uso teraputico humano, inmeras fontes do mercado negro foram identificados como fornecedores de tais agentes [77,78], que sublinha a importncia de doping ensaios de controle, permitindo a anlise sensvel e abrangente do GHS. A abordagem genrica para este problema foi apresentado em 2012 por Pinyot et al., Que empregou um teste de ligao receptor competitivo [79,80]. Uma vez que todas as partes do GHS comum de se ligarem ao receptor de GHS 1a, o receptor ligado membrana pr-incubada com um ligando radiomarcado (125I-grelina), que deslocado pelo urinrio (GHS) de uma forma dependente da dose, tal como demonstrado com 7 sinttica GHS em um estudo de prova de conceito. As respostas ou concentraes mnimas positivas para GHS na urina variaram de 1.5E-10 M de 1.0E-06 com MK-0677 a ser mais sensvel deteco. A anlise da hormona de crescimento GHRP-pptido de libertao em 2 de ps-administrao de amostras de urina de estudo foi apresentada outra, sugerindo uma janela de deteco de cerca de 4,5 h para essa droga em particular. A confirmao da presena de uma substncia proibida que pertence classe de GHS foi recomendado e conduzida atravs de ensaios de LC-MS / MS dedicados. Tal metodologia baseada em espectrometria de massa em particular o de deteco de GHRP-2 e o seu principal metabolito (d-Ala-d (~ naftil)-Ala-Ala-OH), na urina humana, foi publicado em 2010 por Okano et al. [81]. Aqui, uma GHRP-2 padro interno marcada com istopo foi usada para assegurar as condies de preparao e anlise da amostra apropriados antes da amostra foi submetido a extraco de fase slida (SPE) e subsequente anlise por LC-MS / MS. O ensaio permitiu LODs de 20-50 pg / ml e aplicou-se a um estudo de excreo com dez voluntrios que receberam um bolus intravenoso de 100 ~ g de GHRP-2 dicloridrato. Enquanto foi encontrado o GHRP-2 intacta at 13 h, o metabolito acima referido foi detectada at 24 h utilizando o mtodo estabelecido. Do mesmo modo, um mtodo de rastreio foi estabelecida em 2011 visando uma famlia de 8 GHRP (GHRP-1, -2, -4, -5, -6, alexamorelin, hexarelina, e ipamorelin) mais o anteriormente mencionado, o GHRP-2 metabolito utilizando um istopo -dilution abordagem LC-MS [82]. Aqui, dois padres interno deuterado (d4- GHRP-4 e um D3-GHRP-2 metablito) foram adicionados e SPE foi realizada com uma resina de troca catinica fraco, antes de Microbore separao LC inverso de fases e verificao completa de alta resoluo / de massa de alta preciso espectrometria, o que permitiu LODs de 0,2-0,5 ng / ml. A aplicabilidade do mtodo desenvolvido para as amostras de urina autnticos foi testado com um estudo da eliminao com 10 mg de GHRP-2 oralmente administrado a um voluntrio masculino. As anlises revelaram a ausncia de intacta GHRP-2 e rastreabilidade do GHRP-2 metablito at 20 h aps a administrao. Em um estudo de acompanhamento, a configurao instrumental foi modificado para consistir de um sistema nanoUHPLC interface com um analisador de massa quadrupolo-Orbitrap [83]. Como um resultado, os limites de determinao foram reduzido aproximadamente 20 vezes, para permitir a deteco de 2-10 pg / ml de cada uma das substncias. Como os dados DMPK da maioria GHRPs no esto disponveis, mas de grande importncia em termos de controles de doping, animais em estudos in vivo e in vitro em simulaes de reaes metablicas foram realizados para identificar e caracterizar os compostos alvo vivel para testes de drogas esportes abordagens [84]. Focando GHRP actualmente no aprovadas (excepto para o GHRP-2), sete com postos foram administrados a ratos por via oral e intravenosa. Estes compostos (GHRP-1, -2, - 4, -5, -6, alexamorelin, hexarelina, e ipamorelin) produziu pelo menos trs metablitos urinrios aps cada iv aplicao, que foram confirmados por humanos em as Simula vitro e vai estender as opes de testes iniciais para GHRPs em controlos antidoping de rotina. Um espectro de massa de ies produto tpico de um GHRP intacta est descrita na Fig. 5b representa o GHRP-3. Os dados farmacocinticos do Homem para o GHRP-6 foram apresentados por Cabrales et al. em 2012/2013 [85,86]. Utilizando uma abordagem de espectrometria de massa de diluio isotpica, o GHRP-6 foi determinada a partir de plasma com um limite de quantificao de 5 ng / ml. As amostras foram enriquecidos com o GHRP-6 marcado com 13C, as protenas plasmticas foram esgotadas por precipitao facilitada-acetona, e o analito alvo foi quantificado a partir do concentrado super-natant por nanoLC-Q / TOF MS utilizando uma coluna de nano LC monoltico. Seguindo um i.v. bolus de 100, 200, ou 400 ~ g / kg de peso corporal, foram recolhidas amostras de plasma at 72 h, e o GHRP-6 As concentraes foram encontrados a cair abaixo do limite de quantificao (5 ng / ml) aps 12 h ps administrao. 2.2. Alta (er) substncias de massa molecular 2.2.1. O hormnio do crescimento liberando hormnios (GHRHs) Alm de GHS, o crescimento hormnio liberador do hormnio (GHRH) e seus anlogos sintticos modificados receberam um enorme estmulo para as vendas ilcitas e principalmente com base na Internet [77,87,88]. Em contraste com o GHS, GHRHs agem atravs de receptores na hipfise anterior, e representantes clinicamente aprovados de GHRHs so tesamorelin e Sermorelin. Alm disso, pesquisas sobre novos anlogos potentes de GHRH como agentes teraputicos tem sido ininterruptamente durante dcadas [89]. Isso resultou em uma srie de potenciais candidatos a frmacos, um dos compostos mais citada do que tem sido CJC-1295 (Tabela 2). Rolamento modificaes na sequncia em 5 posies, bem como um cido 3-maleimido-propinico para in vivo para bioconjugao albumina [90], a sua eficcia em ratos com meia-vida de plasma prolongado foi relatada. Por isso, complementares aos mtodos de teste GHS, protocolos de rastreamento para GHRHs como CJC-1288, CJC-1293, e CJC-1295 ter sido desejvel ainda que, semelhante maioria dos GHRPs, dados DMPK em humanos e informaes sobre a eliminao renal da droga intacta e do metabolito (s) em causa so largamente em falta. Um mtodo empregando purificao por imunoafinidade seguida de anlise nanoLC-MS / MS foi apresentada em 2012 [91]. Por meio de pr- concentrao de 5 ml de urina utilizando SPE e extraco subsequente do alvo analitos GHRH (1-29, Sermorelin) e CJC-1295 (sem a poro de cido maleimidopropinico), a anlise de alta sensibilidade e especificidade dos compostos foi realizada permitindo para os limites de deteco de 5 e 1 pg / ml, respectivamente. Ainda no se esclareceu, no entanto, se os peptdeos intactos ou metabolitos correspondente ser mais eficiente como analitos alvo em controlos antidoping de rotina quando se usa urina como matriz de controle de doping primrio. Alternativamente, sangue / soro pode ser uma opo vivel para testar as drogas intactas. 2.2.2. Factores de crescimento mecnicos (MGFs) Hormnios peptdicos categorizados como fatores de crescimento mecnicos (MGFs) foram explicitamente mencionados como substncias proibidas em regulamentos da AMA relevantes desde 2005 O uso do termo MGF tem sido ambgua na literatura, ou seja, referentes ao IGF-1Eb (ou Ec em humanos) mRNA , pro-IGF-1Eb, bem como a MGF sinttico pep-mar, e , portanto, recomenda-se usar o nome "MGF" exclusivamente para crescimento mecano fator de peptdeos sintticos [92]. Embora o IGF-1Ec ARNm derivado por splicing alternativo do gene de IGF-1, a formao e na existncia in vivo de FCL em seres humanos que compreende 24 resduos de aminocidos (Tabela 2), bem como os efeitos atribudos ao prprio FGM so objecto de substancial controvrsia. Relatrios anteriores descritos capacidade MGFs para estimular o msculo (caule) a proliferao celular e, assim, aumentar a fora muscular e regenerao, sugerindo que o seu abuso no esporte no pode ser excludo, apesar de ter perdido a aprovao clnica [93]. No entanto, os testes abrangentes com MGF sinttico no conseguiu reproduzir a efeitos anablicos e de promoo da regenerao de MGF e um receptor dedicado MGF ainda no foi identificado para apoiar e corroboram a hiptese de MGF comummente aceite [94]. At hoje, nenhum ensaio de deteco dedicado para fins de controle de doping foi relatado, mas achados de MGF em frascos do mercado negro foram relatados em 2012 [95], salientando o abuso potencial de tais compostos no esporte amador e / ou elite, apesar do acima mencionado questionvel eficcia. O produto para o mercado negro mostrou ser composto pelos resduos apropriados de 24 aminocidos como enumerados no quadro 2, mas um composto de amidao C-terminal, o qual no tem sido postulado para o MGF humana que ocorre naturalmente potencialmente. 2.2.3. Anticorpo anti-miostatina MYO-029 A miostatina, tambm conhecida como factor de diferenciao e crescimento-8 (GFD- 8), um membro altamente conservada do factor de crescimento transformador beta (TGF-~) superfamlia que actua como um regulador negativo da massa do msculo esqueltico [96,97]. Em miostatina ratinhos knock-out (MSTN - / -), foi observado um aumento significativo na massa muscular resultante de ambos um volume elevado (hipertrofia) e nmero (hiperplasia) de fibras de msculo esqueltico [97-99]. Assim, o bloqueio seletivo da via de sinalizao da miostatina tem sido considerada como um meio teraputico para combater ou curar doenas graves, como distrofias musculares, mas tambm outras arenas como a melhoria da produo de gado foram mencionados como metas desejveis [98,100-102]. Abordagens destinadas especificamente a miostatina incluem protenas de ligao a miostatina injectveis, tais como o GDF-8, pr-pptido [103,104], assim como anticorpos recombinantes [104-106]. Num modelo de rato de distrofia muscular, a inibio da miostatina endgeno por meio de anticorpos especficos melhorou consideravelmente o fentipo distrfica dos animais como a massa muscular, o tamanho do msculo, fora muscular e do peso corporal foram significativamente aumentados [105]. Consequentemente, com base em anticorpos droga candidatos para os seres humanos foram desenvolvidos com MYO-029, tambm conhecida como stamulumab, sendo o primeiro da classe em 2005 [107-109]. Apesar descontinuao de desenvolvimento clnico, um potencial mau uso considervel eminente e mtodos de ensaio em plataformas de espectrometria de massa ou imunolgicos so desejveis. Com a capacidade de melhoria de alta resoluo / espectrometria de massa de alta preciso tambm a anlise direta do (purificada) anticorpo poderia ser uma opo para o futuro (Fig. 5c). 2.2.4. interferncia de RNA Considerando o nmero de artigos de pesquisa, cido ribonuclico (RNA) de interferncia (RNAi) continua a ser uma das arenas mais dinmicos da pesquisa biotecnolgica (junto com protemica e epigentica) [110]. O enorme potencial teraputico de silenciamento gnico ps-transcricional foi reco-nhecida em numerosos campos de tratamento medicinal, particularmente onde o temporrio knock-down de reguladores negativos desejvel. Aqui, um exemplo frequentemente referenciada a inibio da miostatina, o regulador negativo proeminente da miognese, a eliminao de o que resultou em aumentos significativos de fora e massa muscular em modelos animais e, portanto, o que sugere um meio vivel para curar miopatias como Duchenne A distrofia muscular de Duchenne (DMD) [111-113]. Estratgias empregando oligonucletidos anti-sentido ou de pequeno RNA interferente (siRNA) foram descritos como meios de sucesso, mas um pr-requisito principal de ARNi tem sido a estabilidade do frmaco candidato. Devido rpida degradao do ARN em geral, os cidos ribonucleicos modificados foram introduzidos tal como 2, 2 ~ -fluoronucleotides nucletidos ~-O-metilados, nucletidos fosforotioato, ou cidos nucleicos trancados, proteger eficazmente o siRNA de hidrlise e eliminao precoce do sistema [114]. Devido disponibilidade de software que permite prever motivos RNAi viveis eo rpido ea opo de compra de siRNA adaptados sintetizado totalmente automatizado, estratgias de deteco para esta nova abordagem teraputica tendo o abuso de risco no esporte foram iniciadas [115,116]. Um passo importante para demonstrar a adequao finalidade dos mtodos anti- doping desenvolvidos foi fornecido em 2013, quando os estudos em animais foram realizados com o modelo de siRNA [117]. Aps a administrao intravenosa de quantidades teraputicas de siRNA, as amostras de urina foram recolhidas e submetidas a duas plataformas de anlise que consistem em metodologias bioqumicas e LC- HRMS. A preparao da amostra inclui o enriquecimento especfico de siRNA urinria utilizando-colunas de extraco em fase slida de spin, o extracto de que foi aplicada a electroforese em gel, LC-HRMS de analitos alvo intactas (isto , siRNA intacta ou produtos metablicos truncadas), ou hidrlise qumica e LC- HRMS (/ MS) determinao da forma sinttica mono e oligonucleotdeos. Para alm destes, uma combinao de electroforese em gel, seguida de anlise por espectrometria de massa em uma abordagem de baixo para cima, foi demonstrado que proporcionam a informao desejada se ARN modificados quimicamente estava presente numa amostra de urina ou no. Em geral, o rastreio de siRNA por electroforese em gel seguida de medies de confirmao empregando LC-HRMS mostrou ser adequado para fins de controlo oferecem limites de deteco de 25 pmoles / ml de urina e de deteco de janelas de 24 h dopantes quando a administrao de uma dose nica para roedores de laboratrio foi realizada .