ARTIGO

ORIGINAL

Avaliao do cido lctico intramuscular

atravs da espectroscopia Raman: novas
perspectivas em medicina do esporte*
Fabiano de Barros Souza1, Marcos Tadeu T. Pacheco2, Antnio B. VilaVerde2,
Landulfo Silveira Jr.2, Rodrigo L. Marcos1 e Rodrigo Alvaro B. Lopes-Martins1
RESUMO
O uso da espectroscopia Raman no infravermelho pode
vir a constituir uma nova tcnica para avaliao fsica, permitindo medidas da concentrao de cido lctico em sangue e em msculo esqueltico, por um mtodo no invasivo.
A espectroscopia Raman uma tcnica que oferece grande
riqueza de detalhes provida pela vibrao de molculas em
diferentes nveis de energia. Em estudos prvios, foram
obtidos espectros Raman de cido lctico em plasma humano e em sangue de rato, onde os picos caractersticos
foram observados claramente na matriz biolgica. No presente estudo a espectroscopia Raman foi usada para a identificao de cido lctico em msculo tibial de rato. Foi
usado um laser de Ti:safira sintonizado em 830nm, um
espectrmetro Kaiser f/l.8 e um detector de CCD refrigerado. O espectro Raman do cido lctico apresenta oito picos bem distintos, entre 700 e 1.500cm-1, correspondendo
aos diferentes modos de vibrao da molcula do cido
lctico. O pico principal em 830cm-1 foi usado para caracterizar a presena do cido lctico no msculo tibial de
rato. Foram analisados espectros Raman de msculos tibiais in vivo e in vitro. Alm disso, tambm foi monitorada
a difuso do cido lctico atravs do msculo, in vitro. Podese concluir, a partir dos resultados obtidos, que a espec* Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento IP&D. Universidade do Vale
do Paraba UNIVAP.
1. Laboratrio de Fisiologia e Farmacodinmica.
2. Laboratrio de Terapia Fotodinmica.
Recebido em 10/6/03
2a verso recebida em 7/10/03
Aceito em 4/11/03
Endereo para correspondncia:
Rodrigo Alvaro B. Lopes Martins, Ph.D.
Laboratrio de Fisiologia e Farmacodinmica
Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento IP&D
Universidade do Vale do Paraba UNIVAP
Av. Shishima Hifumi, 2.911 Urbanova
12244-000 So Jos dos Campos, SP
E-mail: rlopes@univap.br

388

troscopia Raman no infravermelho prximo apresenta grande potencial para, no futuro, com o aperfeioamento da
tcnica, ser utilizada em avaliaes fsicas com o intuito
de permitir medies das concentraes de cido lctico
no msculo esqueltico, atravs de metodologia no invasiva.
Palavras-chave: cido lctico. Espectroscopia Raman. Msculo tibial de rato.

RESUMEN
Evaluacion de cido lctico intra-muscular a travs de
espectroscopia Raman: novas perspectivas en medicina
del deporte
El uso de la espectroscopia Raman de infrarojo puede
constituir una nueva tcnica para la evaluacin fsica, permitiendo medidas de la concentracin de cido lctico en
sangre y en msculo esqueltico, por un mtodo no invasivo. La espectroscopia Raman es una tcnica que ofrece
una gran riqueza de detalles provista por la vibracin de
las molculas en diferentes niveles de energia. En estudios
previos, se obtuvieron espectros Raman de cido lctico
en plasma humano e en sangre de ratn, donde los picos
caractersticos se observaron claramente en la matriz biolgica. En el presente el estudio de la espectroscopia Raman ha sido usado para la identificacin de cido lctico
en el msculo tibial del ratn. Se utiliz un laser de Ti:Safiro
sintonizado en 830nm, un espectrmetro Kaiser f/l.8 y un
detector de CCD refrigerado. El espectro Raman de cido
lctico presenta ocho picos bien distintos, entre 700 e
1.500cm-1, correspondiendo a los diferentes modos de vibracin de la molcula de cido lctico. El pico principal
en 830cm-1 ha sido usado para caracterizar la presencia
de cido lctico en el msculo tibial de ratn. Fueron analizados los espectros Raman de msculos tibiales in vivo e
in vitro. Adems de esto, tambin fu monitoreada la difusin de cido lctico a travs del msculo, in vitro. Nosotros podemos concluir a partir de los resultados obtenidos, que la espectroscopia Raman de infrarojo prximo
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presenta un gran potencial para, en el futuro, con el perfeccionamiento de la tcnica a ser utilizada en avaluaciones fsicas con la intencin de permitir mediciones de las
concentraciones de cido lctico en el msculo esqueltico, a travs de una metodologa no invasiva.
Palabras clave: Acido lctico. Espectroscopia Raman. Msculo
tibial de ratn.

INTRODUO
Para que um indivduo realize uma atividade fsica
necessrio que suas funes orgnicas estejam plenamente ajustadas, resultando assim em maior tolerncia quanto
a solicitaes muito intensas dos exerccios1. Atravs de
treinamento orientado possvel a adaptao dos sistemas
fisiolgicos solicitados durante esforo fsico1.
Como a contrao muscular voluntria depende de vrios fatores, como o sistema nervoso central, o neurnio
perifrico, a juno neuromuscular e os msculos estriados esquelticos, difcil de estabelecer uma definio estrita de fadiga muscular. Segundo Edwards2, a fadiga muscular a incapacidade de manter a fora requerida ou
esperada de contrao muscular. A princpio, qualquer um
desses fatores pode estar envolvido com o processo de fadiga muscular e, portanto, o fator fisiolgico significativo
para o desenvolvimento da fadiga pode ser de carter mecnico, metablico ou eletrofisiolgico.
Apesar de a fadiga muscular se caracterizar como um
fenmeno complexo atribudo a fatores mltiplos, alguns
autores concordam que a fadiga pode ser classificada como
de origem perifrica ou central3,4. O acmulo de metablitos como o cido lctico ocorre durante atividade fsica
intensa, sendo acompanhado por uma queda de pH tecidual. Entretanto, existem evidncias de que o prprio aumento da concentrao de ons hidrognio possa ter um
efeito inibitrio sobre os filamentos contrteis, incluindo a
reduo na sensibilidade da troponina ao on clcio5.
Vrios estudos tm investigado os fatores biolgicos que
influenciam o condicionamento dos atletas, buscando parmetros de referncia para prescrio dos treinamentos.
Outro aspecto importante visa caracterizar fisiologicamente
uma zona metablica a partir da qual ocorre desequilbrio
entre a produo e eliminao de metablitos, os quais
podem gerar fadiga muscular. Entre esses metablitos o
cido lctico vem sendo citado como um excelente indicador do sistema energtico que est sendo utilizado predominantemente durante o exerccio1,6. O cido lctico
produzido constantemente no organismo, tendo sua concentrao aumentada na regio muscular durante atividade
fsica de alta intensidade7.
Rev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 6 Nov/Dez, 2003

Desde que Fletcher e Hopkins8 demonstraram a formao de cido lctico durante a contrao muscular, muita
ateno tem sido dada aos provveis mecanismos que controlam sua produo e remoo durante o exerccio. No
final dos anos 50 e incio dos anos 60, Hollmann et al.9
introduziram o conceito de incio do metabolismo anaerbio para mensurar a performance cardiorrespiratria.
Em seus estudos, os autores observaram que durante o exerccio com incremento de cargas a cada trs minutos, atingia-se um ponto onde a ventilao pulmonar (VP) aumentava em maior grau do que o consumo de oxignio (VO2).
Como as mudanas na VP e no cido lctico sanguneo eram
coincidentes, Hollmann definiu esse momento do exerccio como ponto de tima eficincia ventilatria. Posteriormente, Wasserman e McLlory10, baseados em um estudo utilizando indivduos com patologias cardiovasculares,
introduziram o termo limiar anaerbio, propondo que parmetros ventilatrios poderiam ser utilizados para estimar
o ponto de inflexo da curva de cido lctico sanguneo.
Tema central de inmeras pesquisas realizadas nas ltimas dcadas, o limiar anaerbio apresenta-se como um
dos assuntos mais polmicos e controvertidos dentro da
histria recente da Fisiologia do Exerccio. Embora haja
discordncia entre os pesquisadores sobre seus mecanismos
bsicos10, o limiar anaerbio (LAn) tem sido amplamente
utilizado por pesquisadores, fisiologistas, preparadores fsicos e mdicos. Aplicaes prticas da determinao do
LAn incluem a prescrio da intensidade adequada de exerccio13, predio de performance14 e a avaliao dos efeitos do treinamento aerbio, principalmente durante um
acompanhamento longitudinal15.
Apesar do grande nmero de terminologias e referncias utilizadas para determinar os limiares, os mesmos podem ser basicamente divididos em duas categorias: OPLA
(onset of plasma lactate accumulation) como sendo a intensidade de exerccio anterior ao aumento exponencial do
cido lctico no sangue. Embora alguns autores utilizem
basicamente o mesmo referencial do estudo anterior, eles
definem esta intensidade de exerccio como sendo o limiar
de lactato (LL)16. Outros autores porm, utilizando a mesma terminologia (LL), apresentam outra referncia para sua
determinao e definiram o LL como sendo a intensidade
de exerccio que determina um aumento de 1mM no cido
lctico sanguneo, acima dos valores da linha de base
(1mM). Coyle17 justifica sua metodologia por encontrar
no LL, intensidades de exerccio que so 5% maiores do
que as encontradas no OPLA, sendo estas muito prximas
s velocidades selecionadas pelos atletas durante a prova
de maratona. Alm disso, em ciclistas, o emprego da intensidade correspondente ao LL resulta em freqncia muito
similar da glicogenlise muscular, resultando em tempo

389

de fadiga, em funo da depleo de glicognio, tambm

muito similar entre os sujeitos (trs horas)18.
Vrios estudos tm examinado a relao entre as concentraes de cido lctico e de noradrenalina e adrenalina, sugerindo forte relao causal entre as mesmas19. Mazzeo e
Marshall verificaram que o comportamento da curva das
catecolaminas durante o exerccio de cargas progressivas
muito semelhante ao comportamento do cido lctico, podendo-se utilizar o ponto de inflexo da concentrao de
adrenalina (limiar de adrenalina), para a predio do LL.
A avaliao direta da concentrao de cido lctico durante o exerccio reconhecidamente apresenta algumas dificuldades e inconvenientes. A primeira distoro nos mtodos atualmente empregados deve-se ao fato de que o cido
lctico mensurado encontra-se na circulao sistmica, e
no exatamente na musculatura predominantemente utilizada em determinada atividade fsica. Como o cido lctico durante o exerccio produzido e liberado principalmente pela musculatura ativa, e pode ser removido pela
prpria musculatura ativa, pelos msculos inativos, pelo
corao e fgado, as concentraes de cido lctico podem
ser diferentes para uma mesma intensidade de exerccio,
dependendo do local utilizado para a coleta de sangue.
Assim, a comparao dos resultados entre os diferentes
estudos deve ser realizada levando-se em considerao o
local de obteno da amostra de sangue, bem como do tratamento (plasma ou sangue total) que se d a essas amostras. Um segundo inconveniente deve-se ao fato de tratarse de mtodos invasivos que, em menor ou maior grau,
embutem um risco de contaminao, tanto do atleta, quanto do avaliador. Um terceiro fator importante refere-se a
que, normalmente, no possvel a realizao das anlises
durante a atividade fsica, em tempo real, s podendo ser
feitas antes ou aps a mesma. Tendo em vista esses fatores, torna-se deveras interessante, do ponto de vista da avaliao fsica, o estudo mais aprofundado de novas tecnologias que possibilitem a reduo dos riscos e o aumento da
fidedignidade nas mensuraes das concentraes musculares de cido lctico durante o esforo fsico.
Tcnicas de espectroscopia tm sido utilizadas para anlise de tecidos biolgicos, apresentando resultados bastante confiveis, uma vez que se consiga adequar a tcnica
espectroscpica s informaes necessrias para uma anlise precisa da amostra20.
Quando a luz incide sobre uma substncia qualquer, ela
pode ser absorvida ou espalhada elasticamente. Espectroscopia de infravermelho (IR) mede a freqncia na qual uma
dada amostra absorve uma radiao IR e a intensidade desta absoro. Assim, o espectro de infravermelho representa a identificao de uma amostra com picos de absoro

390

correspondentes freqncia de vibrao entre os tomos

constituintes do material. A determinao das freqncias
permite identificar os componentes qumicos da amostra,
visto que cada grupo qumico conhecido por absorver
luz em uma dada freqncia. A intensidade de uma certa
absoro est relacionada com a concentrao de um respectivo componente, fornecendo, assim, uma anlise quantitativa. Espectroscopia Raman com transformada de Fourier usa radiao de laser com energia prxima do
infravermelho para excitar uma dada amostra e medir a luz
emitida pela mesma. Grande parte da luz espalhada pode
ter a mesma freqncia que a luz incidente (espalhamento
Rayleigh elstico). Entretanto, uma pequena frao da
luz incidente (hi) pode ter sua energia diminuda (h(iR) stokes) ou aumentada (h(i+R) anti-stokes) (espalhamento Raman inelstico) (figura 1). Visto que a energia
da luz proporcional freqncia, a mudana de freqncia da luz espalhada inelasticamente igual freqncia
vibracional da molcula espalhada. Esse processo de troca
de energia entre molcula, luz espalhada e luz incidente
conhecido como efeito Raman. Do ponto de vista energtico, o processo de espalhamento Raman pode ser descrito
como a transio de uma molcula do estado fundamental
para um estado vibracional excitado, acompanhada por uma
absoro simultnea de um fton incidente e emisso de
um fton espalhado (Raman). A luz Raman espalhada pode
ser coletada por um espectrmetro, onde sua intensidade
mostrada em funo de sua mudana de freqncia (deslocamento Raman). Visto que cada amostra molecular possui seu prprio conjunto vibracional molecular, o espectro
Raman de uma amostra em particular consistir de uma
srie de picos, cada um deslocado pela sua freqncia vibracional caracterstica daquela molcula, fornecendo assim a identificao para a molcula que est sendo estudada. O deslocamento Raman freqentemente medido em
comprimento de onda (cm-1), uma unidade conveniente para
relacionar a mudana de freqncia da luz espalhada em
relao freqncia da luz incidente.

Nveis Virtuais
W0

WAS
Nveis eletrnicos

Ws
W0
WR

Nvel Vibracional

Fig. 1 Esboo de transies de eltrons para obteno de componentes stokes e anti-stokes

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Clulas e tecidos so constitudos de protenas, cidos

nuclicos, polissacardeos, lipdios, vitaminas e outros componentes, os quais formam o complexo molecular com uma
estrutura extremadamente intricada. Todas as doenas, sem
exceo, so causadas por mudanas na bioqumica celular e/ou dos tecidos. O corrente desafio da medicina moderna o de encontrar uma tcnica analtica que investigue
essas alteraes por mtodos no-invasivos e no-destrutivos. Poucos mtodos analticos satisfazem esses requerimentos e so sensveis o suficiente para revelar detalhes de
composio e de estrutura. As tcnicas que tm mais se
destacado nesses estudos so as de espectroscopia NMR,
infravermelho (IR) e de Raman. Dentre elas, as tcnicas de
espectroscopia Raman e de infravermelho esto atualmente emergindo como mtodos poderosos para diagnstico
mdico, visto que alteraes microscpicas podem ser detectadas por espectroscopia ptica pelos sinais caractersticos da doena, resultando em um diagnstico in vivo noinvasivo.
Espectroscopia Raman e de IR podem fornecer informaes bioqumicas detalhadas, as quais podem ser utilizadas para detectar doenas em seu estgio inicial de desenvolvimento. Como a tcnica de espectroscopia vibracional
pode ser utilizada atravs de fibras pticas, a remoo de
amostra no necessria, o que representa uma grande
vantagem sobre as tcnicas convencionais de bipsia para
anlise histopatolgica21. Uma vez diagnosticado opticamente, o rgo doente pode ser tratado efetivamente antes
de alcanar um estgio avanado. Tcnicas de espectroscopia vibracional, como Raman e IR, tm sido recentemente
utilizadas para investigao de cncer em peles humanas e
em de animais22,23, assim como para diagnstico de aterosclerose24,25. Espectroscopia Raman tem tambm sido utilizada para estudar doenas inflamatrias de pele e avaliar o
efeito de drogas sobre a epiderme25. Dependendo da natureza da vibrao, a qual determinada por simetria da
molcula, as vibraes podem ser permitidas ou proibidas
em infravermelho ou Raman.
O objetivo do presente trabalho o estudo da espectroscopia Raman no infravermelho, como possvel metodologia
para a deteco do cido lctico em msculo esqueltico.
MATERIAL E MTODOS
Para a realizao dos experimentos foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 350g provenientes
do Biotrio do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da
UNIVAP. Os animais foram mantidos sob temperatura mdia de 25oC e ciclo claro/escuro de 12h, com gua e rao
ad libitum at o momento da experimentao.
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Fig. 2 Diagrama de blocos ilustrando o sistema de espectroscopia

Raman de bancada

No momento da experimentao, os animais foram anestesiados com pentobarbital sdico (40mg kg-1 i.v.) por via
intraperitoneal e fixados em mesa cirrgica. O msculo tibial anterior e o nervo tibial foram ento dissecados e isolados. O animal foi posicionado no equipamento de espectroscopia Raman (figura 2), para as aquisies dos espectros
caractersticos.
O sistema Raman
A espectroscopia Raman (ER) uma tcnica de espectroscopia vibracional usada para determinao de estrutura
molecular e para a identificao e quantificao de materiais. As principais aplicaes dessa tcnica na rea qumico-farmacutica tm sido a anlise no-destrutiva de produtos acabados slidos, lquidos e gases, e a rpida identificao
de amostras.
O diagrama em blocos do sistema Raman mostrado na
figura 2. Resumidamente, um laser de argnio de 5W
usado para bombear um laser de estado slido de Ti:safira.
O laser de argnio foi instalado e alinhado de maneira a
fornecer a mxima potncia. O laser de Ti:safira foi instalado e alinhado de maneira a fornecer a mxima ao laser
nos comprimentos de onda sintonizveis entre 750 e 950nm.
O sinal Raman espalhado na amostra coletado a 90 graus
utilizando-se filtros de rejeio do tipo notch e focalizados
na entrada da fenda do espectrgrafo. Os filtros notch eliminam a luz Rayleigh espalhada e transmitem o sinal Raman para o espectrgrafo para disperso. A luz dispersada
pelo espectrgrafo detectada por um CCD Deep Depletion
refrigerado por nitrognio lquido. O comprimento de onda
de excitao do laser de Ti:safira passa por um filtro hologrfico passa-faixa, eliminando a luz indesejada, transmitindo somente o comprimento de onda desejado. Ento,

391

cido lctico 86%

40000

10 0 0

35000

Intensidade (u.a)

Intensidade (u.a)

Msculo sem cido lctico injetado

12 0 0

800
600
400
200
0

830

30000
25000
20000
15000

1454

10000
5000
0
600

-2 0 0
700

80 0

900

10 00

1 10 0

12 0 0

1 30 0

14 0 0

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

Deslocamento Raman (cm-1)

1 5 00

Deslocamento Raman (cm-1)

o laser de excitao focalizado na amostra aps passar

pela ptica de disperso.
Aps a preparao de todo o sistema, foi realizada uma
aquisio de 50 segundos para obter o espectro Raman do
msculo sem o cido lctico (basal). Em seguida, foram
injetados 50l de cido lctico a 86%, em uma concentrao de 9,4mol/l com uma seringa de 1ml na regio proximal da musculatura. Aps a injeo, foi esperado um tempo de trs minutos e logo em seguida a realizao das
aquisies no sistema Raman, sendo cada aquisio realizada com um tempo de 50 segundos.
Injeo do cido lctico e aquisio dos espectros no
experimento in vitro
O msculo previamente preparado, como descrito anteriormente, foi fixado no porta-amostra, permitindo a realizao de aquisies contnuas de 200s, em intervalos de
quatro minutos.
Para verificar a difuso do cido na musculatura foi realizada uma injeo de 50l de cido lctico na concentrao de 9,4mol/l. Aps a injeo foram ainda realizadas sete
aquisies a intervalos de quatro minutos totalizando 11
aquisies.
Isso nos permitiu estabelecer um grfico demonstrativo
da difuso do cido lctico na musculatura. A distncia do
ponto de injeo at o ponto de incidncia do laser no msculo foi de 1,5cm, sendo a distncia mxima permitida pelo
comprimento do msculo tibial de rato.
Tratamento dos espectros
Os espectros obtidos com as aquisies no sistema Raman foram filtrados por um filtro digital e implementados
com a utilizao do software Matlab. Os espectros tiveram
boa parte de seus rudos excludos para melhor observao
do pico desejado e para que fosse possvel medir a intensidade dos picos, para comparao da difuso em diferentes
momentos aps a injeo do cido lctico.

392

Fig. 4 Espectro Raman do cido lctico a 86%. Podem ser observados

dois picos caractersticos bem demarcados em 830 e 1.454cm-1. O traado representativo de seis animais utilizados.

Msculo com cido lctico

1 50 0
83 0

Intensidade (u.a)

Fig. 3 Espectro caracterstico do msculo tibial de rato sem cido

lctico injetado. O traado representativo de seis animais.

14 5 4
1 00 0

50 0

0
60 0

8 00

10 0 0

1 20 0

1 40 0

16 00

Deslocamento Raman (cm-1)

Fig. 5 Espectro caracterstico do msculo tibial de rato com cido

lctico injetado. Podem ser observados os picos de cido lctico demarcados em 830 e 1.454cm-1. O traado representativo de seis animais utilizados.

RESULTADOS
Espectro Raman do msculo tibial de ratos
Foram realizados espectros Raman do msculo tibial de
ratos controle, isto , sem injeo de cido lctico. Na figura 3 podemos observar um espectro caracterstico do
msculo tibial de ratos sem cido lctico injetado.
Espectro Raman do cido lctico em cubeta de quartzo
O espectro Raman do cido lctico apresentou diversas
linhas caractersticas que podem ser bem resolvidas na faixa de freqncias do nosso sistema, que vai at 1.500cm-1.
Essas freqncias correspondem aos diferentes modos de
vibrao da molcula do cido lctico, tendo seus picos
principais caractersticos em 830 e 1.457cm-1.
A figura 4 mostra um espectro do cido lctico a 86%
(Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA), evidenciando os
vrios picos da amostra em cubeta de quartzo.
Espectro Raman do cido lctico em msculo tibial
de ratos aps a injeo de cido lctico
A figura 5 demonstra o espectro Raman do msculo tibial de ratos aps a injeo de cido lctico. Podemos obRev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 6 Nov/Dez, 2003

servar claramente a presena dos picos caractersticos do

cido lctico nas posies de 830 e 1.457cm-1.
Difuso do cido lctico observada atravs dos espectros Raman
A tabela 1 mostra os valores das aquisies seriadas para
avaliao da difuso do cido lctico no msculo tibial de
ratos. O resultado da anlise de regresso linear fornece
uma correlao positiva de 0,95 entre os valores de tempo
da aquisio e intensidade do sinal Raman, demonstrados
na tabela.

TABELA 1
Valores das intensidades em unidades arbitrrias (u.a),
obtidas em relao ao tempo das aquisies aps
a injeo do cido lctico. O resultado da anlise
de regresso linear fornece uma correlao positiva
de 0,95 entre os valores de tempo da aquisio
e intensidade do sinal Raman (p < 0,0001)
Aquisies

Tempo (min.)

Intensidade (u.a)

01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11

04
08
12
16
20
24
28
32
36
40
44

09.433
10.566
12.830
17.358
20.377
15.700
20.507
22.962
25.185
33.750
31.666

DISCUSSO
As tcnicas de espectroscopia Raman e de infravermelho esto atualmente emergindo como mtodos poderosos
para diagnstico mdico, visto que alteraes microscpicas podem ser detectadas por espectroscopia ptica pelos
sinais caractersticos da doena, resultando em um diagnstico in vivo no-invasivo.
Como mencionado anteriormente, a espectroscopia Raman e a de IR podem fornecer informaes bioqumicas
detalhadas, as quais podem ser utilizadas para detectar
doenas em seu estgio inicial de desenvolvimento. Como
a tcnica de espectroscopia vibracional pode ser utilizada
atravs de fibras pticas, a remoo de amostra no necessria, o que representa uma grande vantagem sobre as
tcnicas convencionais de bipsia para anlise histopatolgica. Dependendo da natureza da vibrao, a qual deterRev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 6 Nov/Dez, 2003

minada por simetria da molcula, as vibraes podem ser

permitidas ou proibidas em infravermelho ou Raman.
Em alguns materiais, o sinal Raman pode ser anulado
pela fluorescncia de impurezas se as amostras forem excitadas com luz visvel. Entretanto, com o recente desenvolvimento de espectrmetro de IR e Raman com transformada de Fourier operando prximo da regio do infravermelho
(NIR-FT-Raman), essa situao foi alterada completamente. Foi demonstrado que a maioria de amostras orgnicas
pode ser excitada com um laser de Nd:YAG com = 1.064nm.
Visto que muito dos componentes de material biolgico
no possuem bandas de absoro nesse intervalo, existe uma
probabilidade muita baixa de excitao de fluorescncia.
A partir disso, a tcnica de espectroscopia Raman tem sido
constantemente utilizada em medicina e biologia para diagnstico mdico, estudo em plantas, assim como para anlise de poluentes no meio ambiente.
Neste trabalho avaliamos a utilizao da espectroscopia
Raman como possvel ferramenta para identificao de
metablitos como o cido lctico, baseados no fato de que
cada componente bioqumico presente nos tecidos apresenta um espectro vibracional caracterstico, com bandas
estreitas e bem resolvidas. Como o interesse particular deste
trabalho foi a identificao de cido lctico intramuscular,
demonstramos que a tcnica apresentou significativa resoluo das bandas vibracionais, trazendo informaes da
presena desse metablito quando aumentada sua concentrao na musculatura observada.
Nos protocolos em que foi realizada a administrao exgena de cido lctico atravs de injeo intramuscular foi
possvel detectar claramente essa substncia e diferencila dos demais componentes musculares. Embora Pilotto et
al26 em seu trabalho afirmem que o sistema Raman foi capaz de detectar cido lctico em nveis fisiolgicos no sangue onde o sinal demonstrou maior intensidade e menor
rudo, o que facilitou no tratamento computacional do espectro Raman obtido. No msculo, a relao sinal/rudo
modificada, apresentando aumento significativo de rudo e
diminuio do sinal da substncia estudada, o que dificulta a deteco fisiolgica do cido lctico.
No uso do sistema Raman para deteco de cido lctico ficou clara a necessidade de protocolos mais especficos, em que a instabilidade do sistema seja amenizada com
relao ao tipo de laser empregado e ao tipo de alinhamento do sistema antes de cada experimento. O tipo de
sistema empregado neste trabalho constitui, sem sombra
de dvida, uma poderosa ferramenta para a anlise qualitativa de amostras biolgicas. No entanto, sua alta complexidade dificulta sua utilizao por profissionais da rea de
Fisiologia do Esforo, fora do laboratrio de experimenta-

393

o. Trata-se ainda de uma tecnologia em desenvolvimento,

na qual se percebe a necessidade de um sistema mais robusto e fechado, que apresente maior especificidade e menor
custo, para ser utilizado na prtica por profissionais da rea.
Por outro lado, Pilotto et al21 descreveram as dificuldades encontradas no uso do sistema Raman de fibra ptica,
principalmente no que diz respeito intensidade de rudo
causado pelo forte sinal Raman emitido pela prpria fibra
ptica, interferindo diretamente no sinal do cido lctico.
Por esse motivo, para chegar a esses resultados foi utilizado o sistema Raman de bancada.
Quanto ao deslocamento Raman dos picos, foi observada pequena variabilidade experimental, o que Silveira20
descreve como sendo a captao de sinal pelo espectrgrafo podendo sofrer pequena variao de deslocamento pela
grade de corte posicionada para a busca do sinal desejado.
Com relao s intensidades dos picos encontrados, o sistema evidenciou um pico mais intenso prximo de 830cm-1
como foi citado por Pilotto et al.21 e um menos intenso
prximo de 1.456cm-1, sendo caracterstico da substncia.
Embora o segundo pico no tenha sido observado nos resultados do protocolo in vitro em que o sinal estava prejudicado, exigindo um nmero grande de acumulaes durante as aquisies, esta discrepncia deveu-se provavelmente,
segundo Silveira20, baixa potncia conseguida no alinhamento do laser de Ti:safira.
No protocolo in vitro foi relevante o aumento da intensidade dos picos no decorrer da difuso do cido lctico, ou
seja, foi possvel demonstrar a difuso da substncia do
local da administrao at o ponto onde se fez a colheita
do sinal, na tentativa de monitorar a difuso do cido lctico na musculatura esqueltica (tabela 1). Por outro lado,
em dois pontos ocorreu queda na intensidade do sinal Raman, indo ao encontro do que cita Silveira20, que mesmo
durante um acmulo e aquisies constantes podem ocorrer pequenas diferenas nas intensidades de colheita do sinal pelo espectrgrafo, ocasionado principalmente pela
instabilidade da potncia do laser ou por problemas de geometria na incidncia da luz na amostra. Como a composio diferenciada dos tecidos responsvel pela diferena
espectral observada, o diagnstico do processo patolgico
ou a classificao do tecido pode ser obtida pela identificao dessas diferenas espectrais, utilizando todo o espectro ou transies e vibraes mais importantes20.
A tcnica de espectroscopia Raman apresenta grande interesse na rea mdica pela sua especificidade molecular.
Porm, a intensidade do sinal Raman retroespalhado extremamente fraca comparada com outros processos de decaimento radioativo, principalmente a fluorescncia. De

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maneira geral, a intensidade do sinal Raman 1.000 vezes

menos intensa do que a emisso fluorescente. Por isso, fazse necessria a utilizao de instrumentao adequada para
a colheita desse fraco sinal; entretanto, em algumas ocasies
o sinal acaba prejudicando a realizao do experimento e a
anlise dos resultados por um fator de variao da intensidade de sinal.
Um fator interessante e muito importante nas aplicaes
da espectroscopia Raman em amostras biolgicas a correta escolha do comprimento de onda de excitao. A maioria das molculas biolgicas possui transies dos nveis
eletrnicos em comprimentos de onda na regio do ultravioleta e visvel. Fazendo-se uso de laseres visveis para a
excitao Raman, como o laser de on de argnio, por exemplo, a fluorescncia dessas biomolculas acaba predominando sobre o sinal Raman. Como essas molculas no apresentam transies eletrnicas para excitao no infravermelho
prximo, a fluorescncia quase que inexiste, sendo a opo
por laseres com comprimento de onda entre 700 e 900nm
prefervel.
A tcnica de espectroscopia Raman demonstrou grande
potencial para a deteco do cido lctico em msculo tibial de ratos, embora seja preciso melhor adequao dos
protocolos ao tipo de sistema empregado, para que em trabalhos futuros no haja problemas de instabilidade no equipamento como o ocorrido neste. As dificuldades encontradas na padronizao dos experimentos so naturais, devido
ao estgio de desenvolvimento de uma nova tecnologia,
demonstrando, obviamente, que ainda existem diversos
fatores que necessitam de maiores estudos para sua aplicao profissional.
No entanto, os resultados iniciais obtidos neste trabalho
demonstram claramente que o sistema capaz de identificar o cido lctico presente na musculatura esqueltica em
concentraes semelhantes s fisiolgicas, pois o poder de
definio vibracional deste sistema permite alta resoluo.
Alm disso, o sistema foi capaz de avaliar a difuso do
cido lctico em relao ao tempo, mesmo com a interferncia do baixo sinal Raman.
Por outro lado, so necessrias adaptaes desse sistema
para que este possa ser utilizado em situaes reais de esforo fsico em humanos, em que sabidamente ocorre a adio de fatores complicadores como o movimento e a presena da pele humana, que constitui uma barreira captao
do sinal.

Todos os autores declararam no haver qualquer potencial conflito de interesses referente a este artigo.
Rev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 6 Nov/Dez, 2003

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