3.

0 Materiais e Mtodos
3.1 Materiais
3.1.1 Vidrarias e equipamentos
- Erlenmeyer de 100 mililitros
- Pipetas de 1, 2 e 5 mililitros
- Pr-pipetes
- Tubos de ensaio
- Cubetas
- Micropipetas
- Types
- Espectrofotmetro

3.1.2 Solues
- Soluo de enzima fosfatase alcalina 2 g/ml
- Soluo padro de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampo Tris-HCl pH 9,5
- Soluo de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM tampo Tris-HCl pH 9,5
- Soluo de Na2HPO4 0,4 mM em tampo Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5
- Solues tampo borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5
- Solues tampo citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5
- Soluo de NaOH 2 M

3.2 Mtodos
3.2.1 Construo de uma curva padro de PNP
Com o auxlio de pipetas e pr-pipetes, foram transferidas para tubos de ensaio
alquotas das solues indicadas segundo a tabela 1, homogeneizando os tubos
manualmente ao fim de cada adio. Em seguida, parte dessas solues foi
transferida para as cubetas e as mesmas foram levadas ao espectrofotmetro,
aonde o tubo B (branco) foi utilizado como referncia de calibrao do aparelho

durante o processo no qual se mediu a absorbncia de cada soluo por

espectrofotometria a 405 nm.
N do tubo

Soluo padro
Tampo Tris-HCl,
Soluo de
de PNP (ml)
pH 9,5 (ml)
NaOH 2M (ml)
B
3,2
1,0
1
0,3
2,9
1,0
2
0,6
2,6
1,0
3
0,9
2,3
1,0
4
1,2
2,0
1,0
5
1,5
1,7
1,0
6
1,8
1,4
1,0
Tabela 1: preparo dos tubos para construo da curva padro de PNP.

3.2.2 Curso temporal

Primeiramente identificou-se 9 tubos e adicionou-se 1,0 ml de NaOH 2 M a cada
um. Depois, transferiu-se com o auxlio de uma pipeta e pr-pipete 20 ml da
soluo tampo Tris-HCl 0,2 M pH 9,5 e 10 ml da soluo de PNPP 1 mM para
um Erlenmeyer de 100ml e, aps passado o tempo de pr-incubao de 5
minutos, 2 ml da soluo de enzima, afim de preparar o meio de reao. A
soluo no Erlenmeyer foi pr-incubada novamente por 5 minutos e em seguida
foi adicionado a mesma 2 ml de enzima, homogeneizando e transferindo-se
rapidamente o volume de 3,2 ml para o tubo B, no qual a soluo apresenta um
tempo de incubao 0. O mesmo volume foi transferido para os tubos 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8 sendo estes referentes, respectivamente, ao tempo de incubao de 3, 6,
9, 12, 15, 20, 30 e 45 minutos.
Posteriormente, a soluo de cada tubo de ensaio foi parcialmente transferida
para as cubetas e nessas foi feita a espectrofotometria de absorbncia, a 405 nm,
utilizando-se o tubo B como referncia da calibrao do aparelho, uma vez que o
mesmo possui tempo de incubao 0.
3.2.3 Influncia do pH
Seguindo a tabela 2, transferiu-se alquotas das solues indicadas utilizando-se
pipeta e pr-pipete para tubos de ensaio previamente identificados e os mesmos
foram pr-incubados por um perodo de 5 minutos em temperatura ambiente. Em
seguida, com o auxlio de micropipeta p200, foi adicionado 0,2 ml da soluo de
enzima aos tubos de 1 a 9 em intervalos de 1 minuto, homogeneizando-os. Os
mesmos foram incubados durante 15 minutos contados desde a adio ao tubo 1
e, aps esse tempo, foi adicionado, utilizando pipeta e o pr-pipete, 1,0 ml de
NaOH 2M aos tubos em intervalos tambm de 1 minuto. Nos tubos brancos,

primeiramente foi adicionado o 1,0 ml de NaOH e, em seguida, 0,2 ml da soluo

enzima.
A soluo de cada tubo foi transferida para as cubetas e foi feita a
espectrofotometria de absorbncia a 405 nm, utilizando-se o tubo branco de cada
um dos tampes como referncia de calibrao do aparelho.
N
do
tubo

Soluo tampo
Citrato-HCl (ml)

Soluo tampo
Tris-HCl (ml)

pH
5,5

pH
7,5

pH
6,5
2,0

pH
7,5

pH
8,5

pH
9,5

Soluo tampo
Borato-NaOH
(ml)
pH
pH
pH
9,5 10,5 11,5

B1
B2
2,0
B3
2,0
1
2,0
2
2,0
3
2,0
4
2,0
5
2,0
6
2,0
7
2,0
8
2,0
9
2,0
Tabela 2: preparo dos tubos para verificao da influncia do pH.

PNPP
1mM
(ml)

1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

3.2.4 Curva de substrato

Foram transferidos os volumes das solues indicadas segundo a tabela 3 para
tubos previamente identificados e os mesmos foram pr-incubados por 5
minutos. Aps esse tempo, utilizando-se uma p200, adicionou-se 0,2 ml da
soluo de enzima a todos os tubos exceto o tubo B, em intervalos de 30
segundos. Os tubos foram homogeneizados e incubados durante o tempo de 15
minutos em temperatura ambiante, contando-se a partir da adio de enzima ao
tubo 1. Em seguida, a reao foi paralisada atravs da adio de 1,0 ml de NaOH
2M aos tubos em intervalos tambm de 30 segundos e homogeneizao dos
mesmos. No tubo B foi primeiramente adicionado 1,0 ml de NaOH 2M e
posteriormente 0,2 ml da soluo de enzima.
As solues dos tubos foram, ento, transferidas para cubetas e o tubo B (branco)
foi utilizado como referncia na calibrao do espectrofotmetro durante a
espectrofotometria de absorbncia a 405 nm realizada nas solues.

N do
tubo

Tampo
PNPP
Tris-HCl pH
1 mM (ml)
9,5 (ml)
B
2,9
0,1
1
2,9
0,1
2
2,8
0,2
3
2,7
0,3
4
2,6
0,4
5
2,4
0,6
6
2,2
0,8
7
2,0
1,0
8
1,8
1,2
9
1,5
1,5
10
1,2
1,8
11
0,9
2,1
12
0,6
2,4
13
0,3
2,7
Tabela 3: preparo dos tubos para construo de uma curva de substrato.
3.2.5 Influncia do inibidor
Com o auxlio de pipetas e pr-pipete, transferiu-se alquotas das solues
indicadas segunda a tabela 4 para tubos de ensaio previamente identificados, os
quais foram pr-incubados durante 5 minutos em temperatura ambiente e, em
seguida, com utilizando uma p200, adicionou-se 0,2 ml da soluo de enzima aos
tubos de 1 a 13 em intervalos de 30 segundos, homogeneizando-os aps cada
adio. Os tubos foram incubados durante 15 minutos contando a partir da adio
da enzima ao tubo 1 e, aps esse tempo, foi adicionado 1,0 ml de NaOH 2,0 M
aos tubos em intervalos de 30 segundos afim de paralisar a reao. No tubo B foi
adicionado primeiramente o NaOH 2,0 M e, em seguida, 0,2 ml da soluo de
enzima, homogeneizando a soluo.
A soluo contida nos tubos foi transferida para cubetas e estas foram levadas ao
espectrofotmetro aonde foi medida a absorbncia de cada soluo, utilizando-se
o tubo B (branco) como referncia de calibrao para o aparelho.

N do
tubo

Tampo
PNPP
Tris-PI-HCl
1 mM
pH 9,5 (ml)
(ml)
B
2,9
0,1
1
2,9
0,1
2
2,8
0,2
3
2,7
0,3
4
2,6
0,4
5
2,4
0,6
6
2,2
0,8
7
2,0
1,0
8
1,8
1,2
9
1,5
1,5
10
1,2
1,8
11
0,9
2,1
12
0,6
2,4
13
0,3
2,7
Tabela 4: preparo dos tubos para verificao da influncia do inibidor.