SEPARAO E CONTAGEM DE CLULAS MONONUCLEARES DO

SANGUE PERIFRICO EM GRADIENTE DE FICOLL-HYPAQUE

O Ficoll-Hypaque consiste de uma mistura de polissacardeos neutros

hidroflicos de alta

densidade que se dissolve prontamente em soluo

aquosa. O nome "Ficoll" uma marca registrada atualmente de propriedade da

GE Healthcare Bio-Sciences. Os gradientes de Ficoll-Hypaque so utilizados
em laboratrios clnicos para separar os componentes celulares do sangue
perifrico (eritrcitos, leuccitos, etc.). A mistura Ficoll-Hypaque colocada
no fundo de um tubo e o sangue (coletado em presena do anticoagulante
EDTA para evitar a coagulao) vagarosamente colocado sobre a fase de
Ficoll. Aps ser centrifugado, as duas fases tornam-se bem visveis e a
separao ocorre da seguinte maneira: na fase superior fica o plasma e seus
constituintes solveis, na interface as clulas mononucleares, em seguida o
Ficoll e aps os eritrcitos e granulcitos que ficam sob a forma de um
sedimento celular no fundo do tubo.

Contagem

das

clulas

em

Cmara

de

Neubauer

Cada quadrante da cmara, coberto por uma lamnula, representa um

volume total de 0,1mm3. Como 1 cm3

equivalente a 1,0 mL, a

quantidade de clulas por mL e o nmero total de clulas pode ser

determinado. A profundidade central da cmara de 1 mm. No desenho
figuram 9 grandes reas de 1 mm2 . As 4 reas grandes angulares ( L )
so subdivididas em 16 reas com 0,25 mm de cada lado. Elas servem
para contagem de leuccitos. A grande rea central subdividida em 25
grupos quadrados de 0,2 mm de cada lado. Cada grupo consiste de 16
mini-reas com 0,05 mm de lado, tendo cada rea 0,0025 mm2 . Os 5
grupos marcados (E) so usados para contagem de eritrcitos.
observado que todas as reas tm uma borda tripla em cada lado. A
linha central o limite e determina quando uma clula deve ser includa
na contagem ou no.

PROCEDIMENTO
1. Coletar 10 mL de sangue utilizando como anticoagulante a
heparina;
2. Centrifugar o sangue a 1.000 rpm por 3 minutos ou pode deixar
sedimentar naturalmente;
3. Retirar com pipeta Pasteur aproximadamente 2,0mL de plasma
imediatamente acima da interface celular e colocar em um tubo
limpo;
4. Acrescentar ao plasma rico em clulas 2,0mL de soluo salina e
homogeneizar delicadamente;
5. Pode-se utilizar, em substituio ao plasma, uma suspenso de
clulas de bao de camundongo recm preparadas, pois ali
tambm se encontram quantidades muito grandes de clulas
sanguneas;
6. Depositar cuidadosamente com pipeta Pasteur, os 4,0mL da
mistura sobre 2,0mL de Ficoll-Hypaque que se encontra em um
tubo de ensaio protegido da luz. essencial que o material
depositado no se misture com a soluo de Ficoll formando duas
fases bem distintas;
7. Centrifugar a 2.000 rpm por 20 minutos;
8. Com pipeta Pasteur coletar cuidadosamente a nuvem de linfcitos
que se formou na interfase e j transferir estas clulas coletadas
para um tubo contendo soluo salina. Esta etapa importante
pois o Ficoll txico para as clulas e precisa ser rapidamente
diludo para no causar lise dos linfcitos;
9. Centrifugar estas clulas diludas em salina a 1.500 rpm por 5
minutos e repetir esta lavagem mais uma vez. Esta lavagem
importante para eliminar plaquetas contaminantes que ficam nesta
interfase e atrapalham a contagem.

10.

Aps a segunda lavagem ressuspender o sedimento celular

em 1,0mL de soluo salina e proceder diluio adequada de

acordo com as instrues do professor para fazer a contagem.
Nmero de clulas/mL= mdia do nmero de linfcitos por quadrante X inverso da
diluio X 104.
Nmero total de clulas= clulas/mL X volume original da suspenso celular
DILUIO DO DNA GENMICO QUANTIFICADO
Aps a quantificao, o DNA diludo pela frmula C.V=C1.V1 , onde:
C= Concentrao lida de DNA
V= Volume a ser pipetado do DNA concentrado
C1= Concentrao de trabalho
V2= Volume final correspondente entre 500 l a 1.000 l
Exemplo:
Desejo uma concentrao de 5 ng/l
C.V=C1.V1
313 ng/ l . V = 5ng/ l . 500 l
V= 5 . 500/ 313
V= 8 l de DNA
492 l de gua ultra pura

*Lembrar que 1 g = 1000 ng/ 1 l = 0.001 ml/ 100 l = 0.1 ml

ELETROFORESE; FAZER GEL