Universidade Estadual de Santa Cruz UESC.

Professora: Andra Miura da Costa.

Aluna: Carolina Farias Bastos Arajo.

Pesquisa sobre mtodos de estudo das clulas:

Tipos de microscpio;
Princpios;
Utilizao.

Tipos de microscpio
Os microscpios dividem-se basicamente em duas categorias:
Microscpio tico: funciona com um conjunto de lentes (ocular e objetiva)

que ampliam a imagem transpassada por um feixe de luz que pode ser:

Microscpio de campo claro

Microscpio de fundo escuro

Microscpio de contraste de fase

Microscpio de interferncia
Microscpio eletrnico: amplia a imagem por meio de feixes de eltrons,

estes dividem-se em duas categorias: Microscpio de Varredura e de

Transmisso.
H ainda os microscpios de varredura de ponta que trabalham com um larga
variedades de efeitos fsicos (mecnicos, pticos, magnticos, eltricos).
Microscpio simples
Contm uma lente simples ou um sistema de lentes centradas, para ampliar um
objeto atravs de ampliao angular sozinho, dando ao espectador uma imagem
virtual ampliada ereto, no permitindo uma ampliao dos objetos superior a 50x. A
utilizao de uma nica lente convexa ou grupos de lentes ainda se encontram em
dispositivos de ampliao simples, tais como a lupa, e oculares como telescpios e
microscpios

Microscpio composto

 constitudo por mais do que um sistema de lentes e a formao da imagem

determinada, em grande parte pelo comprimento de onda da luz utilizada na
iluminao da amostra e pelas propriedades fsicas da mesma. Com base no tipo de
iluminao, podemos considerar os seguintes tipos:
Microscpio fotnico
A imagem transmitida por um feixe de fotos (luz visvel ou ultravioleta). Pode-se
ainda considerar os seguintes subtipos:
Microscpio comum
Utilizado para ampliar, com uma srie de lentes, estruturas pequenas impossveis
de visualizar a olho nu. constitudo por um componente mecnico que suporta e
permite controlar um componente ptico que amplia as imagens.

Microscpio ultravioleta
A radiao utilizada o ultravioleta que tem um comprimento de onda para a luz
visvel, o que permite melhorar o limite de resoluo comparativamente ao
microscpio de campo luminoso. A ptica constituda por lentes de quartzo, j que
o vidro no transmite este tipo de radiao.

Microscpio de fluorescncia
Permite observar microrganismos capazes de fixar substncias fluorescentes
(fluoro cromos). A luz UV, ao incidir nessas partculas, provoca a emisso
de luzvisvel e observa os microrganismos a brilhar em fundo escuro.

 Microscpio de campo escuro

Os corpsculos a examinar so fortemente iluminados por feixes luminosos que
penetram lateralmente, o que conseguido com condensadores especiais. Deste
modo, a nica luz que penetra na objetiva a difratada pelas partculas presentes
na preparao, pelo que passam a ser visveis em fundo escuro.

Microscpio de contraste de fase

Permite a observao de microrganismos vivos, sem colorao, atravs do
contraste devido diferena defase dos raios luminosos que atravessam o fundo
relativamente fase da luz que atravessa os microrganismos.

Microscpio de polarizao
O microscpio de polarizao possui dois prismas: um polarizador e outro
analisador. A luz ao penetrar em estruturas como msculo, ossos, celulose, fibras,
cabelos e entre outros se desdobra em dois feixes. O prisma deixa passar apenas
uma das vibraes luminosas, de modo que as estruturas que forem isotrpicas
sero anuladas e no seu lugar surgir uma imagem escura. As estruturas
birrefringentes (anisotrpicas) produziro um tipo de vibrao luminosa que ser
emitida, ficando brilhante. Somente as estruturas birrefringentes aparecero
brilhantes, ficando o restante material escuro.

Microscpio eletrnico
A imagem transportada por um feixe de eltrons. Pode-se considerar os
seguintes subtipos:
Microscpio eletrnico de varrimento (SEM)
Cria-se uma imagem ampliada da superfcie do objeto onde no necessrio cortar
o objeto para se observar, este pode ser colocado no microscpio sem grandes
preparativos. Podendo ampliar os objetos 100 mil vezes ou mais, sendo muito til
dado que permite obter imagens tridimensionais da superfcie do objeto.

Microscpio eletrnico de transmisso (TEM)

Dirige o feixe de eltrons para o objeto, cuja imagem se deseja aumentar e uma
parte dos eltrons atravessa o objeto, formando uma imagem aumentada. Exige
uma cuidada preparao do objeto, que necessita ser cortado em camadas muito
finas. Permite ampliaes do objeto at um milho de vezes.
Microscpio protnico
A imagem transportada por prtons. A ampliao de at 1.000.000 x.

Princpios bsicos de ptica eletrnica

Conceito de resoluo
A primeira pergunta que ouvimos do leigo ao ver um microscpio : Qual o
aumento? Na verdade, o aumento que tanto impressiona o usurio ocasional de
microscopia, no o parmetro mais importante a considerar. Parece-nos,
primeira vista, que se dispusesse de instrumentos perfeitos poderamos examinar
uma amostra com aumentos cada vez maiores, e perceber detalhes cada vez
menores, at distinguir os tomos, ou quem sabe, as partculas que os compem.
No isto o que ocorre: existe uma limitao fsica relacionada com a radiao
utilizada, para a menor distncia entre dois pontos que permite distingui-los
separadamente. A esta distncia chama-se "limite de resoluo", e um aumento
maior no revelar nenhum detalhe adicional da estrutura.
Entende-se por resoluo, a menor distncia entre dois pontos do material
em exame nitidamente distinguvel, em princpio, quanto menor, melhor; poder de
resoluo de um instrumento de ptica a capacidade de resolver detalhes. O
correto falar em melhor e no maior poder de resoluo. Assim, a resoluo do
olho humano da ordem de 0.1 mm, a de um microscpio de luz, cerca de 200 nm
(0.2 m), de um MEV de 10 A (1 nm) e de um MET, ao redor de 1-2 A (0.1-0.2
nm) .
O olho desarmado no distingue dois pontos situados a menos de 0.1 mm
devido natureza da retina, o rgo foto-receptor, que formado por um tapete
de clulas fotossensveis de formato cnico ou de bastonetes. O dimetro mdio
de cada unidade foto-receptora de cerca de 0.1 mm.
Assim, para dois sinais luminosos serem interpretados como dois pontos
independentes, os mesmos devem atingir duas unidades receptoras diferentes.
Dessa maneira, os impulsos nervosos gerados sero interpretados no crebro como
dois pontos distintos. Se a distncia for menor que 0,1 mm, os dois sinais sero
recebidos por apenas uma unidade foto-receptora e assim interpretados no
crebro como um sinal apenas. possvel melhorar a resoluo de nossa vista se
antepusermos entre o olho e o objeto uma lente ou complexo de lentes (uma lupa ou
microscpio) que amplia a distncia entre os pontos em observao. Usando o
microscpio de luz consegue-se melhorar o poder de resoluo do olho desarmado,
em cerca de 1000 X, chegando a micrometros.

Aps os trabalhos pioneiros de Leeuwenhoek no sculo XVII, a evoluo do

microscpio de luz atingiu seu apogeu j no fim do sculo XIX. Algumas inovaes
como contraste de fase ou contraste interferencial melhoram a contrastao do
espcime, mas no a resoluo. Um leigo poderia imaginar que seria possvel
distinguir pontos situados a menos de 200 nm no microscpio de luz (ML) caso uma
micrografia tomada fosse ampliada centenas ou at milhares de vezes. Entretanto,
a prtica revela que apenas sero ampliados borres sem melhoria da resoluo. A
limitao da resoluo do ML se deve a um fenmeno conhecido como difrao, que
deriva da natureza ondulatria da luz. Se interceptarmos um feixe de luz com um
anteparo, no qual h um pequeno orifcio, possvel projetar a imagem deste
orifcio em uma tela. O senso comum nos levaria a acreditar que uma mancha
luminosa deveria surgir, o que de fato acontece, entretanto ao redor da mancha
forma-se uma srie de anis concntricos, de intensidade que se reduz medida
que se afasta do centro. Esta figura conhecida como disco de Airy.

Figura 1. Esquema mostrando porque a difrao da luz, criando o disco de

Airy, faz com que a imagem de dois pontos muito prximos aparece fundida a
partir de distncias aproximadamente iguais metade do comprimento de onda
da luz.

O disco de Airy se deve interferncia das ondas luminosas que se iniciam

no orifcio, cujas cristas e depresses se sobrepem ou se anulam. Caso sejam
feitos dois orifcios, cada vez mais prximos, haver uma situao a partir da qual,
embora exista uma distncia real entre eles, suas imagens no sero distinguveis,
como acontece na situao mostrada pela figura 2A. Ao contrrio, as imagens sero
fundidas devido aos anis (figura 2B), quando ento dizemos que foi atingido o
limite de resoluo. Baseado nestes fenmenos, em fins do sculo XIX Abbe
formulou uma expresso matemtica para definir o poder de resoluo:
d = k / n sen [1].
Onde d = resoluo (quanto menor o valor, melhor!); k = uma constante de
proporcionalidade que depende do brilho da amostra; = comprimento de onda da
radiao usada no sistema de iluminao (no caso, luz visvel uma radiao
eletromagntica de entre 400 a 700 nm); n = ndice de refrao do meio; =
ngulo formado pelo eixo ptico e a reta que passa no bordo da lente e no seu
ponto focal. A expresso n sen conhecida como abertura numrica do sistema
ptico. Na prtica, a expresso k/n sen na melhor das hipteses 0.5 (e,
portanto d = 1/2 ). Dessa maneira, podemos, com aproximao considerar a
resoluo de um instrumento ptico como metade do comprimento de onda da
radiao empregada na iluminao. No caso das luzes visveis, usando a forma mais
curta (violeta, de 400 nm), teramos uma resoluo de 200 nm, que o atingvel
na prtica. Usando luz ultravioleta ( em torno de 200 nm), conseguiramos uma
resoluo de 100 nm, necessitando, contudo, o uso de lentes especiais de quartzo.
Nota-se pela expresso [1] que a nica maneira de diminuir d reduzindo .
De fato, existem muitas formas de radiaes eletromagnticas de bastante
inferior ao da luz, mas existem enormes dificuldades em manipul-las e gerar
imagens. Dentre elas temos, por exemplo, o feixe de eltrons. Eltrons so
partculas subatmicas, de carga negativa e massa muito pequena (ao redor de
1/1800 da massa do prton) rbitando em torno do ncleo. possvel arrancar
estes eltrons dos tomos, e gerar um feixe e esta tecnologia j estava disponvel
no incio do sculo XX. Os estudos de Louis de Broglie na dcada de 20 permitiram

estabelecer a dualidade partcula/onda das radiaes eletromagntica e no caso de

partculas em movimento, calcular seu . Assim, =h/mv [2] (h- constante de Plack
[6,55 x 10-27]; m = massa do eltron = 9,107 X 10-28 g; v = velocidade). Sendo a
energia cintica dos eltrons funo da voltagem de acelerao temos:
mv2/2=Ve[3] (V = voltagem de acelerao; e = carga do eltron [=1,603x 10 -19 c]).
Reunindo [2] e [3] temos e= 12/ V-0.5 A[4], onde V a sua voltagem de acelerao
(para se acelerar um feixe de eltrons, aplica-se aos mesmos uma tenso). Assim,
se V = 90.000 V (uma tenso que se usa em um MET) e = 0,04 A e, portanto d =
0,02 A. Infelizmente problemas de aberrao de esfericidade (feixes de eltrons
mais perifricos so mais fortemente defletidos do que os centrais, gerando
imagens em forma de borres de objetos pontuais). Em funo destes problemas
ainda no terem sido resolvidos na confeco das lentes eletrnicas atuais, a
resoluo do MET est limitada a 1-2 A. Os MEVs convencionais tem resolues da
ordem de 30-50 A, e recentemente usando canhes do tipo field emission tem-se
atingido valores prximos a 10 A.
Interao eltrons/tomo
No caso do MET a imagem gerada pelo feixe de eltrons que atravessa o
espcime, o qual deve ser suficientemente delgado para permitir a transmisso. A
imagem na realidade uma sombra do espcime, projetada na tela fluorescente,
em que, quanto maior os tomos dos elementos que compe certa poro do
espcime, maior a quantidade de eltrons que se desviam (espalhamento) da
trajetria e maior o contraste na imagem.
No MEV, o processo de gerao de imagem completamente distinto. Para
compreender como isto se d, teremos que discutir antes os fenmenos que se
sucedem quando um feixe de eltrons incide sobre a superfcie da amostra: (1) se o
espcime for suficientemente delgado, parte do feixe poder atravess-lo e
teremos os eltrons transmitidos; se o espcime for cristalino, com estruturas
peridicas estes eltrons transmitidos podem gerar imagens difratadas (imagem
em MET); (2) se a superfcie da amostra for condutora, parte dos eltrons poder
ser absorvida e originar uma corrente, ou fora eletromotriz; (3) dependendo da

substncia que forma a amostra, esta poder, sob o bombardeio de eltrons, ter
seus tomos excitados e ocorrer emisso de ftons (luz) e o fenmeno
conhecido como catodo luminescncia ou em outros termos, fluorescncia ( o
fenmeno que ocorre p.ex. na tela do MET (local onde se observa imagem) ou no
tubo de TV e na lmpada fluorescente); (4) parte dos eltrons pode ricochetear na
superfcie da amostra, sem perder energia. Temos ento, eltrons retroespalhados

(backscattered electrons), que podem ser eventualmente coletados e gerar

imagens (imagem em MEV); (5) parte dos eltrons incidentes, primrios, pode ser
retida nos tomos da amostra, com que se chocam deslocando simultaneamente
eltrons da rbita deste tomo que seriam ejetados, e que so referidos como

eltrons secundrios (imagem em MEV). (6) quando h emisso de eltrons

secundrios, ocorre no tomo que os gerou, um desbalano energtico, pois os
eltrons secundrios tm nvel de energia mais baixo que os primrios. Esta
diferena de energia dissipada em forma de raios X, que caracterstico em
termos de energia e de para cada elemento (Figura 3). Os raios X podem ser
coletados e analisados indicando qual o elemento que os emitiu. Esta tcnica
conhecida como microanlise de raios X, e o instrumento que o faz, a
microssonda. Na figura 3 podem-se tambm observar as regies da amostra onde
so gerados os sinais. Eltrons secundrios que so gerados em uma menor rea
permitem uma melhor resoluo do que os retroespalhados e raios X que so
gerados em uma rea maior, porem as informaes geradas por estes so apenas da
parte mais superficial da amostra.

Figura 2. Esquema da interao eltron/amostra gerando diferentes sinais e

as rea/volume da amostra envolvida na emisso de eltrons secundrios,
reproespalhados e raios X, aps a amostra ser irradiada pelos eltrons
primrios.

Utilizao

Nas cincias, a microscopia ptica foi de suma importncia, sendo aplicada na rea
da qumica (no estudo de cristais), fsica (na a investigao das propriedades
fsicas dos materiais), a geologia (na anlise da composio mineralgica e textura
de rochas) e, evidentemente, no campo da biologia (estudo das estruturas
microscpicas da matria viva), entre outros.
A microscopia ptica usada para o diagnstico mdico, campo que est sendo
chamado de histopatologia quando se trata de tecidos, ou em testes
de esfregao em clulas livres ou fragmentos de tecido.
Em uso industrial, microscpios binoculares so comuns. Alm de aplicaes que
necessitem verdadeira percepo de profundidade, o uso de oculares duplos reduz

o cansao visual associado com longos dias de trabalho em uma estao de

microscopia. Em certas aplicaes, microscpios de longo foco so benficos.
Utilizao para Microscopia de Luz nas Cincias Mdicas
AxioVision QuantiFISH (em ingls)
Detecta sinais de FISH no ncleo celular e mede o nmero de sinais por ncleo e
canal fluorescente.
AxioVision Ratio (em ingls)
Quantifica variaes de concentrao em imagens quantitativas e exibe os
resultados graficamente.
AxioVision TMA (em ingls)
Adquire microarrays completos de tecidos em uma imagem-mapa e identifica
ncleos automaticamente.
AxioVision Tracking (em ingls)
Analisa movimentos celulares em sries com lapso de tempo e determina distncia,
velocidade e direo da distncia percorrida.
AxioVision FRET (em ingls)
Analisa interao entre protenas e cidos nuclicos. Os resultados so exibidos
graficamente ao longo do tempo.
Laser TIRF 3
O novo padro: seis linhas de laser para investigao de processos prximos
membrana celular.
SIRF
Adquire processos da membrana prximos lamnula com tcnicas de iluminao
padro.