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Genoma e Biotecnologia
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Diagnstico Molecular
de Anemia Falciforme
1-Introduo anlise molecular
A anlise molecular pode ser realizada atravs de diferentes tcnicas, que so definidas
a partir de caractersticas moleculares especficas da doena em questo tais como
ocorrncia e frequncia de mutaes em determinadas populaes, localizao da
mutao, caractersticas especficas do gene em questo, tipo de mutao (mutao
pontual, grandes delees, inseres, etc), entre outras. Nesta oficina ns realizaremos o
diagnstico molecular da anemia falciforme atravs da anlise molecular de indivduos
normais, heterozigotos e homozigotos para a mutao HbS no gene da beta-globina.
2-Anemia Falciforme
A Anemia Falciforme faz parte de um grupo de doenas genticas recessivas hereditrias
chamadas de hemoglobinopatias. As hemoglobinopatias podem consistir de variaes
estruturais na hemoglobina, ou de talassemias. Estas doenas podem apresentar alta
incidncia em regies endmicas de malria e so especficas de acordo com a regio e
populao em estudo. Deste modo, o conhecimento sobre a origem tnica do paciente
pode ser de grande valia na anlise gentica de indivduos acometidos por algum tipo de
hemoglobinopatia. Das hemoglobinopatias de variao estrutural, a de maior significado
clnico a chamada Hemoglobina S (HbS), que apresenta altas incidncias na frica, Arbia
Saudita e ndia. Devido aos grandes deslocamentos e migraes de populaes humanas
nestes ltimos 500 anos, atualmente encontra-se indivduos afetados por diferentes formas
de hemoglobinopatias no mundo inteiro. Nos Estados Unidos, por exemplo, 10% da populao
negra potadora do alelo HbS.
Os indivduos portadores de dois alelos HbS (homozigotos) so acometidos de Anemia
Falciforme. A Anemia Falciforme caracterizada por anemia crnica e episdios de dor
severa. Estes sintomas so consequncia de uma alterao estrutural especfica na mlecula
de hemoglobina S. A hemoglobina S possu um formato de foice que impede que a mesma
circule livremente pelos capilares, podendo haver interrupo de fluxo sanguneo e morte
tissular. J os indivduos heterozogitos levam uma vida normal embora suas hemcias tenham
uma meia-vida mais curta.
3-Hemoglobina
Figura 1:
Hemoglobina com
as quatro cadeias
peptdicas.
Figura 3:
Sequencias de
DNA das cadeias
normal e mutada
do gene da betaglobina
Figura 2: Radical hemo com o
tomo de ferro no centro.
5-Extrao
sangue
de
DNA
de
Kary Mullis
A tcnica de
PCR foi criada em
1985 pelo Dr. Kary
Mullis, nos Estados
Unidos. Esta tcnica
uma das grandes
responsveis por
todo o avano na
rea de biomedicina
destes ltimos 15
anos.
em produtos alimentcios.
O mtodo pelo qual a PCR funciona descrito em seguida: dois pequenos
fragmentos de DNA, tipicamente de 20 pares de bases, so sintetizados em laboratrio.
Esses so os primers, que so complementares a
cada uma das extremidades da seqncia de
DNA de interesse, sempre na direo 5' > 3' (veja
figura 5 ). Num tubo de reao so adicionados
os primers, os nucleotdeos livres (adenina,
guanina, timina e citosina), amostras de DNA que
se quer analisar (DNA molde) e uma enzima
especial resistente ao calor chamada Taq DNA
polimerase, que promove a sntese de DNA. A
mistura aquecida a 95C, causando a
separao das duas fitas de DNA. Em seguida, a
mistura esfriada at 550C ou 650C, temperatura
na qual os primers se ligam s regies
complementares das fitas de DNA que esto
separadas. Neste momento, dentro do tubo de
reao, todo o DNA est na forma de fita
simples, menos as duas pequenas regies nas
quais os primers de 20 pares de bases se ligaram
nos dois lados da seqncia de DNA de interesse.
A temperatura ento elevada a 72C, e a Taq
DNA polimerase comea a sintetizar um novo DNA, comeando nas regies em dupla
fita, local onde cada um dos primers se ligou ao DNA molde. A Taq ir promover a
sntese de DNA somente a partir da regio em dupla fita. A sntese ocorre em uma taxa
de aproximadamente 20 nucleotdeos/segundo, e em cerca de 30 segundos a 1 minuto
uma nova cpia do fragmento que se quer analisar sintetizada. A reao agora
novamente aquecida a 95C, causando uma nova separao de todo DNA em fitas
simples. Ao final do primeiro ciclo h duas fitas da molcula original de DNA, mais duas
cpias da regio de interesse. A temperatura novamente reduzida, e agora os primers
iro se ligar aos 4 stios nas novas duas cpias e tambm na molcula original de DNA.
A temperatura do ciclo novamente elevada a 72C e as 4 fitas individuais so copiadas
em 8.
A primeira enzima de
restrio foi isolada
em 1968 por Werner
Arber, Hamilton O.
Smith, e Daniel
Nathans quando
trabalhavam na
Johns Hopkins
University, nos
Estados Unidos. Em
1978 os trs
receberam juntos o
prmio Nobel. Para
saber mais sobre essa
importante
descoberta, visite o
Nobel e-museum no
link
http://www.nobel.se/
medicine/laureates/
1978/
W. A r b e r
D. Nathans
H.O. Smith
reconhecido pela enzima utilizada. A enzima EcoRI, por exemplo, corta o DNA toda vez
que encontra a seqncia G/AATTC, enquanto a enzima DdeI corta o DNA somente no
hexanucleotdeo C/TNAG (N = a qualquer um dos quatros desoxinucleotdeos).Se um
stio especfico de restrio ocorre em mais do que um local na molcula de DNA, o DNA
ser cortado em diferentes locais resultando em muitos fragmentos de diferentes tamanhos
dependendo da localizao do stio na molcula de DNA. Ex: um polinucleotdeo
contendo 4 stios resultar em 5 fragmentos de DNA. Estes diferentes fragmentos sero
Beta-globina normal. A enzima DdeI corta a sequncia nas posies 27, 40, 62,
107, 287, 488, 576
9- Protocolo
Gel de
agarose
corado com
brometo de
etdio
O processo de
polimerizao de
gel de agarose
semelhante quele
que ocorre quando
fazemos gelatina.
Extrao de DNA
Lise celular
1. Adicione 100L de sangue em um tubo de 1,5 mL contendo 300 L da soluo RBC (Lysis
Solution).
2. Misture por inverso e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Inverta novamente
pelo menos uma vez durante a incubao.
3. Centrifugue por 20 segundos a 13000 rpm.
4. Remova o sobrenadante com a pipeta sem pipetar o precipitado branco (leuccito)
deixando um volume residual de cerca de 10 L.
5. Agite vigorosamente no agitador de tubos (vortex) por 20 segundos para homogenizar a
soluo com o extrato celular.
6. Adicione 100 L da soluo de lise celular (Cell lysis solution) e ressuspenda pipetando
para cima e para baixo. Se houver a presena de clulas agregadas incube a 370C at
a soluo se tornar homognea.
Precipitao protica
1- Deixe a amostra resfriar at atingir a temperatura ambiente.
2- Adicione 34 L da soluo de precipitao (DNA Precipitation Solution) de protena ao
lisado celular.
3- Agite vigorosamente no agitador de tubos (vortex) por 20 segundos para homogenizar a
soluo com o extrato celular.
4- Centrifuge a 13000 rpm por 3 minutos. As protenas precipitadas formam um precipitado
escuro. Se isso no aconteceu, repita o passo 3 e incube no gelo por 5 minutos e ento
repita o passo 4.
Diferentes tampes
tm sido
recomendados
para a eletroforese
de DNA. Os mais
usados so TAE
(Tris-acetatoEDTA) eTBE (Trisborato-EDTA). Os
fragmentos de DNA
migram
ligeiramente
diferentes nestes
dois tampes
devido a diferenas
na fora inica dos
dois tampes.
Precipitao do DNA
1- Tranfira o sobrenadante contendo o DNA (sem pipetar o precipitado de protena) para
um tubo de 1,5 mL contendo 100 L de isopropanol a 100%. Inverta o tubo gentilmente
50 vezes.
3- Centrifuge a 13000 rpm por 2 minutos, o DNA torna-se visvel como um pequeno precipitado
branco.
4- Descarte o sobrenadante por inverso e adicione etanol 70%.
5- Centrifuge a 13000 rpm por 2 minutos. Cuidadosamente descarte o etanol. Cuidado nesse
passo porque o precipitado (DNA) por ser descartado junto com o etanol.
6- Deixe a tampa aberta e inverta o tubo sobre um papel absorvente durante uns 15 minutos
ou at a completa evaporao do etanol.
Hidratao do DNA
1- Adicione 33 L da soluo para a hidratao do DNA (DNA Hydratation Solution).
2- Incube a soluo a 420C por 10 minutos.
3- Transfira a soluo contendo o DNA hidratado para o gelo.
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Etapas
na preparao do gel na
bandeja.
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6- Quando o corante azul atingir 1/3 do gel (aproximadamente 1 hora) desligue a fonte.
Visualizao dos fragmentos de DNA:
1- Aps desligar a fonte, retire cuidadosamente o gel da cuba e transfira-o para
um recipiente limpo com cuidado para no quebr-lo.
2- Coloque o lado azul do papelote contendo azul de metileno voltado para a
face do gel.
3- Passe os dedos sobre o gel de modo firme, mas sem quebr-lo, vrias vezes.
4- Coloque algum peso, por exemplo, um bquer vazio sobre o papelote azul.
5- Aguarde 15 minutos.
6- Remova o papelote azul e coloque o gel em um recipiente contendo um pouco de
gua destilada.
7- Troque a gua at que as bandas fiquem visveis.
8- Registre e anlise os resultados.
Questes:
1- Desenhe o perfil eletrofortico visualizado no seu gel.
2- Compare o tamanho dos fragmentos do gene da beta globina das amostras analisadas.
2- Qual o diagnstico de cada um dos indivduos testados?
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