AnaPaulaAlves Diss

Desenvolvimento Embrionrio: das Clulas ao Corao.
Ana Paula Alves

2011
Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG

Instituto de Cincias Exatas - ICEx
Programa de Ps Graduao em Fsica
Desenvolvimento Embrionrio: das Clulas ao Corao.
Ana Paula Alves
Orientador: Prof. Ubirajara Agero Batista

Co-orientador: Prof. Oscar Nassif de Mesquita
Dissertao apresentada ao departamento de Fsica da Universidade Federal de Minas Gerais, para a obteno de Ttulo de
Mestre em Fsica
rea de Concentrao: Fsica Biologica .
2010
Quando uma criatura humana desperta para um grande sonho e sobre ele lana toda a fora de
sua alma, todo o universo conspira a seu favor. (Goethe)
Agradecimentos
Quero agradecer ao meu orientador Professor Ubirajara Agero pelo compromisso com este
trabalho, alm do grande entusiasmo e compreenso. Ao Professor Oscar Nassif de Mesquita
pela oportunidade de conhecer o trabalho do grupo e me encaminhar ao Bira. Aos colegas
do laboratrio de Fsica de Sistemas Biolgicos da UFMG, Lvia, Ulisses, Paula, Pedro,
Barbara e ao Edgar. Aos funcionrios da ocina mecnica do departamento de fsica da
UFMG, Sr. Joo e ao Thiago e ao funcionrio da ocina eltrica, Rubens. Eles contribuiram
bastante no desenvolmento da montagem experimental deste trabalho. minha famlia, pelo
apoio, especialmente minha me e minha irm. Aos amigos do mestrado, pelos momentos de
descontrao e de bandejo, especialmente gostaria de agradecer ao clube da luluzinha pelas
muitas risadas, e pelo grande apoio em todas as horas. Aos meus amigos de alguns anos,
boa parte da turma de 2005 de fsica. Gostaria de agradecer tambm agncia nanciadora
CAPES pela bolsa de mestrado no periodo de 2 anos.
iv
Resumo
Usamos a Microscopia de Desfocalizao (MD), tcnica desenvolvida no laboratrio de
Fsica de Sistemas Biolgicos para obter informaes sobre Desenvolvimento Embrionrio.
Estudamos clulas extradas de embries de galinha nos primeiros estgios de desenvolvimento, o batimento cardaco e o crescimento de vasos no embrio. Desenvolvemos um
processo de extrao e cultura de clulas mesenquimais somticas no laboratrio. As clulas
mesenquimais somticas vo dar origem aos tecidos e rgos do embrio, nosso objetivo
neste trabalho caracterizar a dinmica celular (membrana + citoesqueleto). Para tanto
foram obtidas clulas aderidas, em cultura, as quais exibiam diversos formatos. Atravs
das anlises de correlao temporal do contraste obtemos os tempos de relaxao das utuaes na membrana. Para uma mesma clula foram encontrados diferentes tempos de
relaxao na membrana celular, diferentemente dos resultados obtidos com clulas de outros
vertebrados analisados no laboratrio. Neste trabalho conseguimos relacionar o tempo de
relaxao encontrado na membrana com a direo do movimento da clula, resultados preliminares mostram que a clula se move na direo da regio da membrana que apresenta
menor tempo de relaxao. Alm disso, foram feitas anlises da freqncia de batimento
cardaco fazendo a transformada de Fourier do sinal do batimento cardaco do embrio de
galinha durante o desenvolvimento embrionrio. Os resultados obtidos mostram que em
estgios iniciais do desenvolvimento a freqncia de batimento aleatria e similar freqncia das clulas do corao em cultura, os cardiomicitos, tornando-se denida com o
desenvolvimento do embrio. Outro grande interesse neste trabalho conseguir acompanhar
o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embrionrio. Para tanto, conseguimos
obter o embrio em estgios no qual no apresentava vasos, e em estgios posteriores j
vascularizado. Assim temos um sistema poderoso para estudar como ocorre o crescimento
de vasos no tempo, durante o desenvolvimento embrionrio.
Palavras-chave:clulas
mesenquimais somticas, desenvolvimento embrionrio, MD
Abstract
We use the defocusing microscopy, technique developed at laboratory, Physics of Biological Systems, for information on Embryonic Development. We study cell extracted from
chicken embryos in the early stages of development, heartbeat and vessel growth in the embryo. We developed an extraction and culture procedure to obtain somatic mesenchymal
cells applied our laboratory. Somatic mesenchymal cells will give rise to tissues and organs
in embryo, our goal in this work is to characterize the cellular (membrane + cytoskeleton).
Adherent cells were obtained in culture, which exhibited a variety of formats. Through the
analysis of temporal correlation of the contrast of gray level we obtain the relaxation times
of the uctuations in the membrane. For the same cell were found dierent times in the
cell membrane, unlike the results obtained with cells of other vertebrates analyzed in the
laboratory. Relate the relaxation time found in the membrane with the movement of the cell,
preliminary results show that the cell moves toward the membrane region of least time. Also,
tests were made of the frequency of heart rate by doing the Fourier transform of the signal
from the heartbeat of the chicken embryo during embryonic development. The results show
that in the early stages of developing the beat frequency is similar to the random frequency
of heart cells in culture, cardiomyocytes, making it set to the developing embryo. We also
get the embryo stages in which had no pots, and in later stages as vascularized. So we have
a powerful system for studying how growth occurs in the time of vessels during embryonic
development.
Keywords:
somatic mesenchymal cells, Embryonic Development, Defocusing Microscopic
II
Sumrio
Resumo
Abstract
II
Lista de Figuras
IV
1 Introduo
2 Desenvolvimento Embrionrio
2.1 Introduo Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2 Formao do Embrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gastrulao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Formao e Regresso da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . .
Folhetos Embrionrios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Mesoderme Paraxial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Somitognese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.3 Formao do Corao Durante o Desenvolvimento Embrionrio . . . . . . . . 16
Batimento Cardaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3 Microscopia de Desfocalizao
20
3.1 Campo Eltrico da Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Espao Real e espao dos vetores de onda . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Propagao do campo eltrico atravs de um objeto de fase. . . . . . . 23
3.2 Propagao do Campo Eltrico atravs do microscpio desfocalizado . . . . . 25
4 Montagem Experimental
28
III
IV
SUMRIO
4.1 Extraindo Embries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

Protocolo de Extrao de Embries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.2 Extraindo clulas dos somitos do embrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Porta-Amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Meio de cultura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Cultura de Clulas Mesenquimais Somticas. . . . . . . . . . . . . . . 35
4.3 Cultura de Embrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5 Resultados e Discusses
41
5.1 Clulas Mesenquimais Extradas dos Somitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Caracterizando a membrana das clulas mesenquimais somticas. . . . 43
5.2 Frequncia de Batimento Cardaco Durante o Desenvolvimento Embrionrio. . 48
5.3 Crescimento de vasos em embrio de galinha
(Gallus gallus). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
6 Concluses
A Programa para auto-correlao temporal.
Referncias Bibliogrcas
Lista de Figuras
2.1 Estgios Embrionrios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2 Formao da Blastoderme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3 Grastulao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4 Regresso da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.5 Divises da Blastoderme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.6 Regies da mesoderme incluindo Mesoderme Intermediria e Paraxial com os
respectivos derivados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.7 Somitos no embrio: estgio 10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.8 Somitogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.9 Corte transversal da regio pericardial do embrio em vrios estgios . . . . . 16
2.10 Corao corte ventral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.1 Sistema de Coordenadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2 Esboo de um objeto de fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.3 Esquema ptico do microscpio com ptica corrigida no innito . . . . . . . . 25
4.1 Esboo da montagem experimental para obteno dos embries . . . . . . . . 31
4.2 Embrio no estagio 10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.3 Montagem experimental para extrao de material dos somitos . . . . . . . . 34
4.4 Montagem esquemtica do microoscopio usado para obter lmes das clulas . 37
4.5 Montagem da caixa de acrlico sobre a Lupa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
5.1 Tempo de aderencia das Clulas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.2 Clulas aderidas a partir do terceiro dia de cultura . . . . . . . . . . . . . . . 43
5.3 Diferentes regies da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
V
VI
LISTA DE FIGURAS
5.4 Correlao temporal das regio da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . 45

5.5 Clulas aderidas extradas dos somitos inicialmente, 2 e 1 horas depois . . . . 46
5.6 Correlao temporal para diferentes regies das clulas observadas em intervalos de tempo de 1 a 2 horas
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.7 Sinal obtido da variao da interface do corao. . . . . . . . . . . . . . . . . 48

5.8 Espectro de potncia pela freqncia em (Hz), para um cardiomiocito. . . . . 49
5.9 Espectro de potncia pela freqncia em (Hz) para um embrio cultivado em
vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.10 Freqncia do pico do espectro pela idade do embrio em: horas e nmero de
somitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.11 Embrio no estgio 10 em meio de cultura de Agar+Albumina. . . . . . . . . 52
5.12 Embrio no estgio 17 (60 horas), em meio de cultura de Agar+Albumina. . . 53
5.13 (a) Vasos do arco interno, na regio da rea pelucida em um embrio de 36
horas.(b) Vasos do arco interno em um embrio de 49 horas. . . . . . . . . . . 53
5.14 Embrio est no estgio 29, com o sistema vasculatrio est bem avanado . . 54
Captulo 1
Introduo
Nesta dissertao apresentaremos os primeiros trabalhos de uma nova linha de pesquisa

em Desenvolvimento Embrionrio que se inicia no Laboratrio de Fsica de Sistemas Biolgicos do Departamento de Fsica da UFMG. Essa linha no laboratrio se iniciou a partir dos
trabalhos do professor Ubirajara Agero na Universidade de Indiana EUA, com o professor
James Glazier. Interessados em caracterizar as regies que compem embrio de galinha
no estgio 10 atravs das propriedades elsticas. Eles aplicaram uma deformao na regio
de interesse e obtiveram diferentes valores para mdulo de Young em cada regio do embrio, a saber: rea opaca, pelcida, notocorda, somitos e tubo neural [1]. Atualmente
temos realizado vrios experimentos com embrio de galinha com o objetivo de extrair informaes do comportamento celular, do batimento cardaco e do crescimento de vasos durante
o Desenvolvimento Embrionrio.
Interessados em analisar clulas extradas dos embries no estgio 10 (33-38) horas,
desenvolvemos um protocolo de extrao e cultura de clulas mesenquimais. As clulas
mesenquimais possuem grande capacidade de diferenciao, so precursoras dos tecidos:
conjuntivo, epitelial, sseo, cartilaginoso e muscular, que so compostos de clulas j especializadas.
1
Captulo 1.
Introduo
A MD uma tcnica ideal para estudar objetos de fase, clulas bem aderidas em uma
lmina so objetos de fase ideais para a aplicao da microscopia de desfocalizao. Os
objetos de fase so transparentes quando esto no foco, tornando-se visveis quando desfocalizados por um microscpio ptico operando em campo claro. A desfocalizao do objeto
introduz uma diferena de fase entre a luz difratada e a luz no difratada que produz um contraste no nulo quando interferem no plano imagem. A Microscopia de Desfocalizao agora
com seus limites de validades bem denidos uma tcnica ideal para extrair informaes
quantitativas da dinmica que ocorre na membrana celular [2].
Usamos a Microscopia de Desfocalizao (MD), para analisar a membrana das clulas
extradas dos embries de galinha. O objetivo deste trabalho foi explorar as informaes
extradas das clulas mesenquimais atravs da MD. Esta tcnica j est bem estabelecida, e
atravs dela conseguimos obter informaes que caracteriza de forma eciente a dinmica que
ocorre na membrana celular. Atualmente existem na literatura vrios trabalhos que usam
marcadores para identicar os tipos de clulas que se originam de clulas mesenquimais.
Quando uma clula mesenquimal se diferencia em um broblasto, por exemplo, ocorre a
produo de matriz extracelular que neste caso o colgeno. Assim o marcador usado reage
com uma protena presente no colgeno mudando a colorao do meio. E para diferentes
matrizes extracelulares produzidas existem diferentes marcadores com protocolos bem estabelecidos pela literatura, o que permite caracterizar de forma precisa os diferentes tipos de
clulas originadas das clulas mesenquimais [3].
O prximo passo deste trabalho vericar se atravs MD conseguimos caracterizar diferentes grupos de clulas mesenquimais. Para tanto precisaremos usar marcadores em nossa
cultura, e assim para cada grupo separadamente seria estudado a dinmica que ocorre na
membrana celular. Resultados obtidos em [4][5] mostram que a MD uma tcnica muito
robusta para caracterizar a dinmica na membrana celular.
No presente trabalho conseguimos atravs da MD e das anlises de correlao temporal,
do contraste em nivel de cinza, determinar o tempo de relaxao da membrana celular.
Atravs deste tempo de relaxao podemos caracterizar as utuaes na membrana como
rpidas ou lentas. Para tanto, mapeamos a membrana das clulas mesenquimais e em cada
regio obtemos o tempo de relaxao temporal, o qual se mostrou bastante heterogneo.
Neste trabalho observamos que a heterognedade do tempo de relaxao da membrana est
Captulo 1.
Introduo
relacionada com o movimento da clula. Nossos experimentos conrmaram que as clulas

sempre se movimentam na direo da membrana que possue menor tempo de relaxao
temporal.
Alm disso, foram feitas anlises da freqncia de batimento cardaco e do crescimento de
vasos durante o desenvolvimento embrionrio. Resultados preliminares mostram que durante
o desenvolvimento embrionrio o corao do embrio dene uma freqncia de batimento que
tende a aumentar at atingir o valor do animal adulto. Inicialmente as contraes do corao
so fracas e bastante aletorias, com o desenvolvimento do embrio passam ser mais fortes e
regulares. A vascularizao do embrio inicia-se com a formao do corao, posteriormente
denem-se duas redes de vasos uma mais interna ao corpo do embrio, na regio denominada
por rea pelcida e a outra externa ao corpo, na regio denominada por rea opaca, na
qual os vasos so mais visveis. Conseguimos obter algumas fotos que mostram diferentes
estgios do processo de vascularizao. Nosso objetivo conseguir acompanhar a criao de
vasos no tempo. Conhecer a dinmica do crescimento de vasos muito interessante porque
vrias doenas so identicadas pelo crescimento desordenado de vasos. E conhecendo este
comportamento podemos fazer ensaios com possveis inibidores proliferao dos vasos.
Nesta dissertao desenvolvemos vrios protocolos de mtodos experimentais para o estudo
do embrio de galinha, e pretendemos que estes protocolos sejam utilizados no laboratrio
nos prximos anos.
Esta dissertao est organizada da seguinte forma:
Captulo 1 esta a introduo ao trabalho.
No Captulo 2 ser apresentado o Desenvolvimento Embrionrio, apresentando o desenvolvimento do embrio desde momento em que ele formado ainda no oviducto (dentro da
galinha) at nos estgios posteriores que ns estudamos.
No Captulo 3 ser introduzida a tcnica Microscopia de Desfocalizao, mostrando suas
aplicaes e limites de validade.
No Captulo 4 ser apresentado a montagem experimental e os protocolos de extrao e
cultura de clulas extradas dos embries, alm do protocolo de cultura de embrio em vitro.
No Captulo 5 sero apresentados os resultados obtidos para utuaes em clulas, batimento cardaco, resultados preliminares da formao de vasos e a discusso dos resultados
obtidos.
Captulo 1.
Introduo
No Captulo 6 sero apresentados as perspectivas e concluses deste trabalho.
Captulo 2
Desenvolvimento Embrionrio
2.1
Introduo Geral
Neste capitulo faremos uma reviso bsica dos termos envolvidos no desenvolvimento do
embrio de galinha Gallus gallus. No sero apresentadas discusses detalhadas sobre a
biologia do desenvolvimento, pois o objetivo do presente capitulo apenas abordar os fatos
em ordem cronolgica familiarizando o leitor com os termos que sero citados posteriormente.
Descreveremos o desenvolvimento do embrio de galinha desde a fase inicial dos primeiros
agregados celulares at a formao do corao. Os primeiros estgios do desenvolvimento
de todos os vertebrados so muito parecidos, e os embries de galinha em especial, devido
facilidade em obter, manipular e monitorar durante o desenvolvimento tem sido um modelo
popular para estudos da formao embrionria ha muito tempo (mais de 2000 anos), desde
Aristteles, o qual estudou progressivamente os estgios da embriognese abrindo ovos de
galinha diariamente [6] [7] [8].
Na gura 2.1 esto apresentados todos os estgios de desenvolvimento do embrio de galinha [9]. Este um trabalho pioneiro sendo um dos artigos da literatura de desenvolvimento
5
Captulo 2.
Figura 2.1: Estgios Embrionrios. Retirado de [9].
embrionrio mais citados, pois apresenta um mapeamento completo do desenvolvimento do

embrio de galinha, desde o momento em que o ovo eclodido, nasce da galinha, at o
nascimento do embrio.
A grande vantagem de trabalhar com embries de galinha, que o desenvolvimento
embrionrio em galinha um processo bastante rpido. Nas primeiras 48 horas de incubao,
o embrio se transforma de um disco de clulas para uma estrutura trilaminar, contendo
trs folhetos germinativos que vo dar origem s estruturas embrionrias [10]. Atravs da
gura 2.1 conseguimos acompanhar de forma simplicada a formao do embrio: entre os
estgios H-H (1-3') o embrio um disco com espessamento celular na futura regio caudal,
posteriormente o espessamento celular se alonga formando uma linha entre estgios H-H
(3-4), e o disco passa a ter um formato oval. E entre estgios H-H (5-7) a linha regressa.
Ao longo deste processo estruturas vo se formando e o embrio sofre uma torsso entre os
estgios H-H (13-14), passando de uma estrutura em 2D para o espao 3D. No estgio H-H
35 o feto estar completamente formado.
Captulo 2.
2.2
Formao do Embrio
Nesta seco inicialmenete ser introduzida uma denio dos conceitos bsicos da embriologia em galinha. Vamos apresentar o processo de formao do embrio de galinha Gallus
gallus a partir dos primeiros agregados celulares at a formao de estruturas mais complexas.
Oviducto: canal que inicia no ovrio da galinha e segue at a cloaca, anus da galinha.
Ovo: uma clula, formada pela fecundao do vulo da galinha pelo espermatozide
do galo. Durante e copula os espermatozides do galo penetra pelo oviducto da galinha e
fecunda o vulo. O ovo galado, vulo fecundado, ao descer pelo oviducto revestido pela
albumina, formando uma parede de revestimento, a clara, que vai proteger ovo de impactos
mecnicos.
Vitelo: reserva de nutrientes do ovo, a gema propriamente dita.

Clivagem: um processo de sucessivas divises da ciclatrcula, regio ativa do ovo, esta
regio contm o citoplasma ativo do ovo recm ovulado ver gura 2.2.
Blastoderme: uma camada unidimensional de clulas. Formada pelo processo de sucessivas clivagens que ocorre na ciclatrcula. Esta regio ser de grande importncia na
formao do embrio. A blastoderme est localizada logo acima do vitelo.
Blastmeros: clulas lhas resultante de sucessivas divises da ciclatura por mitose.
Figura 2.2: Formao da Blastoderme: (A) primeira clivagem. (B) Segunda e terceira
clivagem. (C) Quarta segmentao formando os primeiros blastmeros. (D) O nmero de
blastmeros aumentam rapidamente na regio central, a ciclatrcula cresce e a passa a se
chamar blastoderme. Retirado de [11].
A regio da ciclatrcula cresce ocupando parte do vitelo e passa a se chamar blastoderme
Captulo 2.
ou blastodisco. No momento que a blastoderme contm de 32 a 64 clulas inicia-se o processo

de separao dos blastmeros centrais, que no tem contato com o vitelo, dos blastmeros
perifricos, que tem contato com o vitelo, por uma fenda chamada de cavidade subgerminal,
esta cavidade esta mostrada na gura 2.5 (A).
O nmero das clulas na regio central aumentam muito mais rpido e so menores que
as clulas marginais. Assim a massa celular central e constituda por vrias camadas de
pequenas clulas acima da cavidade subgerminal. Na regio perifrica ocorrem clivagens horizontais que separam as clulas em camadas superiores, mas as clulas inferiores desta regio
ainda continuam em contato com o vitelo. Nesta fase possvel distinguir a blastoderme em
duas regies como mostra a gura 2.2.
rea pelcida: formada pelos blastmeros centrais, encontra-se sobre a cavidade subgerminal. Como no h aderncia desta rea ao vitelo ela se apresenta transparente [11].
rea opaca: formada pelos blastmeros perifricos. Como esta rea no se separa do
vitelo em profundidade, tem um aspecto mais denso e se apresenta mais turva (ou opaca)
[11].
Para se ter uma idia dos tempos envolvidos no desenvolvimento da galinha, apresentaremos resumidamente o seu ciclo de vida. A galinha (Gallus gallus) vive em torno de sete anos.
O desenvolvimento embrionrio comea com as clivagens ainda no oviducto da galinha, formando a blastoderme que contm duas regies bem denidas, a rea opaca e a rea pelcida.
Posteriormente aps ser eclodido e incubado inicia-se a Gastrulao, que vai dar origem a
linha primitiva, no estgio H-H 14 comea a formao dos rgos no embrio e aps 21 dias
de incubao o embrio est pronto para nascer.
Gastrulao
Para prosseguir o desenvolvimento embrionrio fora da galinha, o ovo deve ser incubado a
37, 500 C e mantido a uma umidade relativa de 50%. Nas primeiras horas de incubao inicia-
se o processo da gastrulao. No nal deste processo o germe do embrio estar formado

pelos trs folhetos germinativos, ectoderme, mesoderme e endoderme.
A gastrulao
consiste na migrao das clulas do Epiblasto para o espao entre o Epiblasto e

Hipoblasto, como mostra a gura 2.3. Esta migrao ocorrer atravs da linha primitiva e
da fosseta primitiva do n de Hensen, que sero denidas a seguir.
Captulo 2.
Figura 2.3: Gastrulao: consiste no deslocamento do nodulo de Hensen da regio ventral

para a regio dorsal. Retirado de [11].
Formao e Regresso da Linha Primitiva

Formao da linha primitiva: a maior caracterstica da gastrulao em aves, anfbios e
mamferos a formao da linha primitiva. Nota-se um espessamento celular na regio caudal
que se alonga para a futura regio da cabea do embrio como mostra a gura 2.1 entre os
estgios H-H (1-3'). A linha primitiva termina em uma zona mais brilhante, conhecida por
n de Hensen. Durante a formao da linha primitiva a blastoderme perde sua forma circular
e alonga-se. A linha primitiva dene o eixo do embrio e se estende da regio posterior
anterior do embrio. As clulas migram entrando do lado dorsal, ao longo da futura regio
da coluna vertebral, e movem para o lado ventral, separando assim a poro esquerda da
direita do embrio. As clulas convergem para formar a linha primitiva, e formam uma
depresso dentro da linha. Esta depresso chamada de sulco primitivo, atravs da qual
clulas migram passando para parte interna da blastocole, cavidade entre o hipoblasto e
epiblasto. Na regio anterior da linha primitiva surge uma regio com espessamento de
clulas chamado de N de Hensen. No centro deste n aparece uma depresso em forma de
funil na qual as clulas podem passar para parte interna da blastocole.
Regreso da linha primitiva: agora comea uma nova fase da gastrulao, com a
regresso da linha primitiva mostrado na gura 2.1 entre os estgios H-H (5-7). O n de
Captulo 2.
10
Hensen desloca da futura regio do clebro, na rea pelcida, para a posio mais posterior,
futura regio anal, veja a gura 2.4(A). Ao mover o n de Hensen em direo posterior, o
notocorda passa a cobrir a parte anterior comeando no nvel da futura regio mdia do
clebro, como mostra em 2.4(B). Pode-se observar a regresso da linha primitiva na gura
2.4(B), sinalizada pela linha grossa em vermelho, enquanto a linha preta na representa
o aumento do notocorda. A gura 2.4(C) mostra o n de Hensen, na extremidades da
linha primitiva marcado com carbono, regredindo para a regio posterior do embrio e
simultaneamente observa-se a formao das estruturas que vo dar origem ao embrio.
Figura 2.4: Regresso da Linha Primitiva adaptao de [11]. (A) Crescimento da linha
primitiva, alongando a regio da ara pelcida e posteriormente a regresso da linha. (B)
Regresso da linha primitiva e crescimento do notocorda, linha primitiva sinalizada pela
linha grossa e a linha na representa o crescimento do notocorda. (C) Regresso da linha
primitiva e o surgimento da prega ceflica e somitos durante este processo. O ponto marcado
na extremidade da linha primitiva, o ndulo de Hensen, que regressa para a regio posterior
do embrio.
Como conseqncia da seqncia pelo qual so formados a regio da cabea e notocorda,
os embries de aves e vertebrados em geral exibem um gradiente de desenvolvimento nteroposterior que atenuado em estgios de maior maturidade. Enquanto as clulas da poro
Captulo 2.
11
posterior do embrio participam da gastrulao, as clulas no m da poro anterior esto

comeando a formar os rgos. Tudo isso ocorre paralelamente a somitognese, formao
de blocos compactados de clulas, os somitos. Assim nos prximos dias de incubao o m
anterior do embrio exibir um desenvolvimento maior que o m posterior.
Folhetos Embrionrios
Grande parte das clulas centrais da blastoderme formaram o Epiblasto gura 2.5 (A). Outra
parte destas clulas migraram para a cavidade subgerminal, formando arquiplagos celulares
contendo de 5 a 20 clulas. Esse conjunto de vrios arquiplagos celulares forma o hipoblasto
primrio, gura 2.5 (B). Na regio posterior do embrio localiza-se o crescente de Koller, as
clulas desse crescente migraram da regio anterior para posterior ligando os conjuntos de
clulas formando assim o hipoblasto secundrio gura 2.5 (C).
Figura 2.5: (A)Formao do Epiblasto. (B)Formao do hipoblasto primrio. (C)Formao

do hipoblasto secundrio. Retirado de [11].
O embrio forma-se inteiramente a partir do epiblasto, do qual se origina os trs folhetos
germinativos: ectoderme (ecto=externo), mesoderme (meso=meio), endoderme (endo=interno),
aminion e mesoderme extra-embrionria. Enquanto o Hipoblasto d origem ao saco vitelino.
Posteriormente da Ectoderme se originam a pele, sistema nervoso e a crista neural. Da
Mesoderme se originam a notocorda, msculo rins e sangue. E da Endoderme se originam

tubo digestivo, faringe e tubo respiratrio.
Captulo 2.
12
A endoderme formada pelas primeiras clulas a migrarem atravs do n de Hensen,

estas clulas esto marcadas em amarelo na gura 2.3. Dentro da bastocole as clulas do
hipoblasto, em verde na 2.3, migram connando as clulas da endoderme entre as clulas do
epiblasto. As prximas clulas a entrarem na blastocole, atravs do n de Hesen, assumem
uma posio entre o endoderme e o epiblasto formando a mesoderme, clulas marcadas
em rosa na gura 2.3. Enquanto as clulas presuntivas da mesoderme e endoderme esto
movendo internamente, as percussoras da ectoderme proliferam no epiblasto. Alm disso,
as clulas da ectoderme migram ao redor da gema pelo epiblasto. A gema cercada pelo
ectoderme. A gastrulao em aves traa um fechamento, a ectoderma cerca a gema, a
endoderme substituiu o Hipoblasto, e a mesoderme se posiciona entre estas duas regies.
Mesoderme Paraxial.
Nesta subseco vamos apresentar a mesoderme Paraxial. O Ectoderme no estgio da neurulao do embrio pode ser dividida em cinco regies, mesoderme intermediria, cordamesoderme, mesoderme paraxial, mesoderme lateral e tubo neural mostrado na gura 2.6.
Figura 2.6: Regies da mesoderme incluindo Mesoderme Intermediria e Paraxial com os

respectivos derivados. Retirado de [11].
A mesoderme paraxial, uma regio que vai dar origem aos somitos, blocos de clulas
do mesoderme em ambos os lados do tubo neural. As clulas da regio que iro formar a
cabea e os somitos, que produziro tecidos conectivos, a saber: osso; msculo; cartilagem
Captulo 2.
13
e derme. A mesoderme intermediria, forma o sistema urogenital. A corda-mesoderme

contm material que dar origem ao notocorda. A placa da mesoderme lateral dar origem
ao corao, veias sanguneas, clulas do sangue e sistema circulatrio, bem como a linhagem
da cavidade do corpo, alm disso, formar membranas extra-embrionrias, importantes para
transportar nutrientes no embrio.
Uma das tarefas da gastrulao criar a camada da mesoderme entre a endoderme e a
ectoderme. A formao da mesoderme e rgos da endoderme ocorrem simultaneamente
formao do tubo neural. O notocorda estende debaixo do tubo neural da base da cabea at
a cauda. Com a regresso da linha primitiva, as pregas neurais comeam a se juntar ao centro
embrio, a mesoderme paraxial se separa em blocos de clulas chamado somitos. Embora
os somitos sejam estruturas transientes, elas so extremamente importantes na organizao
do padro segmental dos embries de vertebrados. Os somitos determinam o caminho de
migrao das clulas da crista neural e o eixo do nervo espinhal.
Somitognese
A somitognese o processo de formao dos somitos, massas celulares compactadas enleiradas imediatamente na lateral da dobra neural gura 2.7. Os somitos daro origem as
clulas que formaro as vrtebras e costelas, a derme da pele dorsal, o msculo esqueltico
das costas e os msculos esquelticos da parede do corpo e membros.
Primeira estrutura organizada metamericamente que aparece no embrio de galinha so
os somitos. Estes se originam da diviso do mesoderme dorsal para formar blocos de massas
celulares.
A adio regular dos somitos durante o crescimento do embrio em idade faz com que
o nmero de somitos seja um critrio convel para analisar o estagio de desenvolvimento.
Embries que tenham sido incubados por um dado nmero de horas encontram-se em estgios
bastante diferentes, enquanto embries com o mesmo nmero de somitos variam muito pouco
entre si. Assim normalmente designamos o estgio do embrio com base no nmero de pares
de somitos que ele tem formado. A palavra par usualmente omitida, mas entendemos que
um embrio de 6 somitos um embrio de 6 pares de somitos [12]. At agora tratamos do
estgio de desenvolvimento do embrio em horas, porque ainda no tinha sido introduzido
a somitognese e sua importncia para designar o estgio do embrio.
Captulo 2.
14
Figura 2.7: Em (A) est apresentado o embrio indenticando a regio dos somitos. Em
(B) est mostrando um zoom dos somitos, massas celulares compactadas.
Componentes importantes da somitogenese so: periodicidade, epitelizao, especicao

e diferenciao. Os primeiros somitos aparecem na poro anterior do tronco, e os novos
somitos brotam do nal da mesoderme paraxial em intervalos regulares.
A partir das 25 horas comeam a se formar os primeiros pares de somitos e a cada 90
minutos surge um novo par e assim sucessivamente at o embrio estiver completamente desenvolvido com 52-somitos. Existe na literatura muitos trabalhos sobre os mecanismos que
controlam a periodicidade na formao dos somitos, um agente chave a expresso gnica
[6] [13]. Apresentaremos um modelo para ilustrar como ocorre diviso da mesoderme.
expresso na parte mais caudal da mesoderme no segmentada uma onda cclica a cada 90
minutos metamerizando-a, como se fosse uma onda na praia que vai deixando conchas na
areia como mostra a gura 2.8 [6]. A associao do processo de segmentao foi primeiramente reconhecido em embries de galinha como ondas cclicas expressas nas clulas da
Captulo 2.
15
mesoderme que esto relacionadas aos fatores de transcrio do gene c-hairy1[13]. Este gene
fortemente expressado na mesoderme pre-somtica, onde mRNAs exibem ondas cclicas
de expresso as quais correspondem a periodicidade de formao de um somito a cada (90
min). O movimento aparente destas ondas devido aos pulsos coordenados da expresso
c-hairy1, no esta ligada ao deslocamento de clulas ao longo do eixo ntero-posterior tampouco com a propagao de um sinal. A expresso rtmica do c-hairy1 uma propriedade
autnoma da mesoderme paraxial funciona como um relgio oscilador. Este oscilador foi
denominado de relgio de segmentao, pois controla a transcrio peridica de um grupo
de genes, chamados genes cclicos. Estes genes cclicos, ativam e desativam a transcrio
do c-hairy1 dentro de um processo auto- recursivo [6] [13]. Alm disso, a expresso gnica
est relacionada com a posio na qual o somito se separar da mesoderme no segmentada.
O processo de diferenciao das clulas somticas em estruturas mais complexas tambm
envolve fatores de expresso gnica [13] [14].
Figura 2.8: Um modelo da Somitognese determinando a segmentao horria
e a frente de onda: so caracterizados pelo FCF (Fator de crescimento de broblasto)

este est marcado (lils), e pela concentrao de acido retinoco (verde) [6]. A cada 90 min
um novo par de somitos surge. A expresso gnica da onda cclica controlada pelo relgio
oscilador de segmentao que esta marcado ao lado esquerdo do embrio (laranja). A linha
preta marca o limite entre a mesoderme no segmentada (pre-somtica) e a segmentada.
Retirado de [6].
Captulo 2.
2.3
16
Formao do Corao Durante o Desenvolvimento Embrionrio
Nesta seco descreveremos a formao anatmica dos primeiros estgios do corao de

galinha (Gallus gallus) acompanhada de sua funo siologica. O corao um dos primeiros
rgos a funcionar durante o desenvolvimento do embrio, nos embries de galinha possvel
acompanhar seu desenvolvimento em embries cultivados in vitro. O corao derivado da
mesoderme, e uma estrutura no pareada, mas surge de um primrdio pareado o qual
a primeira estrutura a estar extremamente separada de um dos dois lados na linha mdia
gura 2.9.
Figura 2.9: Corte transversal da regio pericardial do embrio em vrios estgios de desenvolvimento mostrando a formao do corao. (A) s 25 horas, (B) s 26 horas, (C) s 27
horas, (D) s 28 horas. Retirado de [11].
O corao origina-se da mesoderme lateral, na embriognese esta camada se divide em
duas, a camada mais interna se une mesoderme formando a esplanctopleure e a mais externa mesoderme formando o somatopleure, como mostra a gura 2.9 (A). Os primeiros
clusters de clulas surgem internamente na esplanctopleure entre a camada da mesoderme e
a endoderme como mostra gura 2.9 (A). Estes clusters de clulas formaram espessamentos
que daro origem a estruturas tubulares, o primrdio do endocrdio, um par de estruturas
tubulares delicados como mostra gura 2.9 (B), estas estruturas daro origem a linhagem
endotelial do corao. Grande parte do espessamento original mesodrmico formar a parte
lateral dos tubos como o primrdio do epicrdico, que est destinado a aumentar a parte de
Captulo 2.
17
revestimento externo do corao, e camadas musculares pesadas do corao como o miocrdio. Em seguida o primrdio do endocrdio, estruturas tubulares, ou tubo endocardial, vo
se aproximando um do outro. Esse processo concomitante ao fechamento do intestino
gura 2.9 (C), todos os fenmenos aqui ocorrem sincronizadamente. E nalmente quando o
embrio completa 29 horas os tubos se fundem formando um nico tubo, o Endocrdio como
mostra a gura 2.9 (D). A parte interna o Endocrdio, a parte do meio o Miocrdio e o
revestimento externo posteriormente formar o Epicrdio.
Figura 2.10: (A) As primeiras migraes celulares para formar os tubos do corao, (B)
tubos formados, (C) fuso dos tubos, (D) deslocamento do tubo resultante para a direita.
A linha numerada (1-4) representada o corte da seco transversal da gura 2.9. Retirado
de [12].
Analisando a formao do corao sob um plano ventral. Sob este plano possvel observar as clulas na regio do primrdio do endocrdio formando um espessamento celular
gura 2.10(A). Este espessamento dar origem s estruturas tubulares gura 2.10(B), estas
estruturas tubulares se encontram primeiro separadas e localizadas ao lado da linha mdia.
E posteriormente, quando estes tubos esto mais calibrados so aproximados um do outro
gura 2.10(C). Em um momento posterior ocorre a fuso dos tubos formando o Endocrdio, e
Captulo 2.
18
o corao deslocado para direita. Atravs de um estudo cuidadoso das seces do corao
foi descoberto presena de uma gelia cardaca entre o miocrdio e o endocrdio [12]. Em
embries vivos esta gelia aparece homognea e tem uma funo importante de prender o endocrdio ao miocrdio, e fazer com que se movam juntos sincronizadamente quando o corao
comea a pulsar. funcionalmente interessante no apenas como uma unidade mecnica
do endocrdio e miocrdio durante estgios prematuros, mas, posteriormente ela servir de
substrato em que as clulas migraro movendo e formando tecidos celulares bem organizados. As regies fundamentais esto comeando a ser formadas. No nal do desenvolvimento
do corao em direo a seu ao seu despejamento nal sero formados: ventrculo, trio,
seios venosos e artrias troncosas.
s 33 horas de incubao, no estgio de 9-somitos, o corao est alargado e deslocado
para a direita da linha mdia. Neste momento se iniciam as primeiras contraes. Das 36-38
horas, no estgio de 16 somitos, o sangue comea a circular. O trio e o ventrculo esto
se estabelecendo. Alm disso, parte do corao se encontra mais dobrado para a direita.
E apartir do estgio H-H 14 veja na gura 2.1 o embrio encontra-se bem deslocado para
direita. Neste estgio o embrio passa de sua forma planar para a forma mais cncava.
A funo siolgica do corao durante o desenvolvimento embrionrio est diretamente
relacionada ao processo de sua formao anatmica. A seguir veremos que a dinmica das
contraes est diretamente relacionada ao processo de formao do corao.
Batimento Cardaco
As contraes do corao vo se denindo durante a formao do corao. Inicialmente os
batimentos so aleatrios e irregulares e com o desenvolvimento do corao esta freqncia
vai se tornando menos aleatria. A partir do quarto dia de incubao estes batimentos
tornam-se mais regulares e provalvemente a freqncia de batimento do embrio j estar
bem prximo de um individuo adulto (5 batimentos/s) [15] [16] [17][18].
Estgio 10 [33-38 horas]- 10 somitos. Durante este estgio comeam as primeiras

contraes do corao que tornam-se aparentes no nvel da regio ventricular, estas contraes so ambas irregulares e intermitentes. As contres se iniciam bem antes do sangue
comear a circular no embrio. Contraes regulares e circulao efetiva do sangue sero
estabelecidas durante estgios posteriores do desenvolvimento [15].
Captulo 2.
19
Estgio 11 [40-45 horas]-13 somitos. Durante este perodo as contraes cardacas

que inicialmente comearam na area ventricular tornam-se regulares [15].
Estgio 12 [45-49 horas]-16 somitos. Neste estgio o trio est formado, e as batidas
cardacas passam a ser controladas pelo trio, agora uma taxa mais rpida que quando
estavam com o controle do marca-passo ventricular. No m deste estgio, a circulao do
sangue torna-se aparente na direo cefalica-caudal [15].
Assim no quarto dia de incubao o corao j esta completamente formado e os batimentos j so bem prximos de uma galinha adulta.
Captulo 3
Microscopia de Desfocalizao
Neste captulo ser apresentado a Microscopia de Desfocalizao, tcnica que comeou a

ser desenvolvida durante o doutorado do Professor Ubirajara Agero no laboratrio de Fsica
de Sistemas Biolgicos da UFMG, com o Professor Oscar Nassif de Mesquita [4] [19] [5][20].
Ao estudarem estruturas nas membranas de macrfagos, clulas brancas que fazem parte do
sistema imune, eles observaram que ao variar o foco as estruturas na membrana mudavam o
contrate. A observao deste fenmeno levou ao desenvolvimento da tcnica. Desde ento
tem-se feito vrios trabalhos no nosso laboratrio para mostrar a capacidade da tcnica,
torn-la mais robusta e disseminar sua aplicao no meio cientco.
Na dissertao do aluno Ulisses Moreira Silveira Andrade, investigou-se os limites da
aproximao paraxial que foi utilizada no desenvolvimento do modelo terico da tcnica. Os
resultados obtidos experimentalmente mostraram-se bastantes promissores comparados com
os tericos [2]. Para aplicar esta tcnica necessrio apenas um microoscopio e um deslocador
de alta preciso, no laboratrio usamos um deslocador piezoeltrico, Digital Piezo Controller
(PI E-710-3CD). Atravs da Microscopia de Desfocalizao possvel obter informaes
quantitativas de objetos de fase, que outras tcnicas pticas no conseguem extrair. As
membranas biolgicas bem aderidas em um substrato so objetos ideais para aplicao da
20
Captulo 3.
21
Microscopia de Desfocalizao pois se comportam como um objeto de fase.
Os objetos de fase so transparentes quando esto no foco, tornando-se visveis quando

desfocalizados por um microscpio ptico operando em campo claro. A desfocalizao do
objeto introduz uma diferena de fase entre a luz difratada e a luz no difratada que produz
um contraste no nulo quando estas interferem no plano imagem. Devido a esta caracterstica
difcil observar estes objetos no microscpio ptico, sendo necessrio o uso de tcnicas de
contraste de fase. Uma das tcnicas mais usadas o contraste de fase descrita por Zernike
em 1935. Nesta tcnica a mudana na intensidade da imagem proporcional a mudana de
fase no objeto. Enquanto que na Desfocalizao a intensidade local da imagem do objeto
proporcional a curvatura local. Esta tcnica extrai informaes fsicas da membrana celular,
pois a curvatura um parmetro importante na dinmica de superfcies e a partir deste dado
pode-se obter informaes das atividades que ocorrem na clula.
Grande parte dos bilogos que trabalham com tcnicas tradicionais de contraste de fase
no conseguem explorar muitas informaes quantitativas da dinmica que ocorre na membrana celular. Atualmente o laboratrio tem colaborado bastante com bilogos que buscam
obter maiores informaes de membranas, procurando entender os processos dinmicos que
ali ocorrem.
Aqui ser esboado um tratamento matemtico desta tcnica apenas apresentando-a.
Pois um tratamento mais rigoroso e detalhado foi desenvolvido em trabalhos anteriores
[20][2].
3.1
Campo Eltrico da Luz
~ r, t) de frequncia, , e dependncia harSupondo um campo eltrico monocromtico E(~
mnica temporal, eit , que se propaga na direo do vetor de onda ~k, podemos escrever:
~ (~r, t) = E
~ (~r) eit .
E
(3.1)
Substituindo a equao do campo eltrico 3.1 na equao de onda .

~ =
2 E
~
2E
.
t2
(3.2)
Captulo 3.
22
Obtm-se:
~ r)eit + 2 E(~
~ r)eit = 0.
2 E(~
Usando a relao: k =
(3.3)
= obtm-se a equao
~ r) = 0.
~ r) + k 2 E(~
2 E(~
(3.4)
A parte espacial do campo eltrico satisfaz a equao 3.4 que conhecida por equao de
Helmholtz.
Espao Real e espao dos vetores de onda

Vamos trabalhar com campos eltricos escalares, que se propagam na direo do eixo z.
Podemos tratar o sistema, que se encontra no espao real em termos do espao dos vetores
de onda. A gura 3.1 apresenta estes espaos.
Figura 3.1: Coordenadas do Sistema de Referncia: (a) No espao real. (b) No espao dos
vetores de onda. Onde ~q a projeo transversal de ~k no espao dos vetores de onda e ~
a projeo no plano xy de ~r. Retirado de [2].
importante introduzir este conceito porque a seguir trataremos do perl do objeto de
fase h(~), este pode ser denido no espao dos vetores de onda, ~q aplicando a transformada
de Fourier.
Aplicando a transformada de Fourier:
Z
h(~q) =
h(~
)ei~q.~ d
(3.5)
Captulo 3.
23
Para obtermos h(~) podemos aplicar a transformada inversa:

Z
h(~
) =
h(~q)ei~.~qd~q
(3.6)
Propagao do campo eltrico atravs de um objeto de fase.

Agora vamos propagar campo eltrico atravs de objetos de fase. Como descrito anteriormente, membranas celulares bem aderidas em um substrato se comportam como objetos de
fase. Objetos de fase so aqueles que mudam a fase da luz incidente sem que ocorra perda
de intensidade. A gura 3.2 apresenta um esboo de um campo eltrico atravessando um
objeto de fase, que podemos pensar ser a regio de uma clula dentro de um meio, separados
pela membrana celular.
~ 0 o campo eltrico incidente, h(~

Figura 3.2: Esboo de um objeto de fase. Onde E
) a
amplitude do objeto , n1 e n2 so ndices de refrao do meio por onde o campo eltrico se

propaga , ~ o vetor posio no plano (x, y) perpendicular direo z de propagao do
campo eltrico.
A variao da fase do campo eltrico no espao livre, com ndice de refrao n1 , propagando por uma distncia d dada por:
0 = n1 k0 d.
(3.7)
Considerando o objeto de fase, a fase introduzida dada por:

(~
) = n1 k0 (l + h()) + n2 k0 [d (l + h(~
))],
(3.8)
Captulo 3.
24
Assim, a diferena de fase dada por:

(~
)
(3.9)
= (~
) 0
= (n1 n2 )k0 (l d) + (n1 n2 )k0 h(~
)
= nk0 (l d) nk0 h(~
)
= constante + (~
),
(3.10)
Onde n = n2 n1 .
Ento, temos que o campo eltrico ao passar por um objeto de fase dado por:
(3.11)
~ ) = E0 ei(~) .
E(~
Retirando o termo contante da fase , pois esta no interfere nos clculos e substituindo
em 3.11 obtemos:
E(~
) = E0 ei(~) = E0 eink0 h(~) ,
(3.12)
onde E0 o campo eltrico incidente.

A equao 3.12 uma aproximao local para o campo eltrico difratado e deixa de ser
vlida para componentes de Fourier de h(~) com nmeros de onda comparveis ou maior
que o nmero de onda da luz incidente no meio.
Para (~) << 1, o campo eltrico incidente da equao 3.12 dado por:
E(~
) E0 [1 i(~
)] = E0 [1 + ink0 h(~
)] .
(3.13)
Como denimos em 3.6, possivel escrever E(~) no espao dos vetores de onda ~q. E o
vetor ~q representa a ondulao na interface. Assim o campo eltrico ao atravessar um objeto
de fase no espao dos vetores de onda dado por:
E(~q) = E0 1 + ink0
h(~q)e
i~
.~
q

d~q .
(3.14)
Captulo 3.
3.2
25
Propagao do Campo Eltrico atravs do microscpio

desfocalizado
Nesta seco apresentaremos a propagao do campo eltrico atravs do microscpio desfocalizado. No microscpio com ptica corrigida no innito, o objeto colocado no foco da
objetiva, assim a imagem formada no innito, por isso necessrio introduzir uma lente
para que a imagem seja conjugada na ocular a qual conhecida como lente de tubo. A gura
3.3 representa um esboo do sistema ptico utilizado no laboratrio.
Figura 3.3: Esquema ptico do microscpio com ptica corrigida no innito: S a fonte de
luz branca, L1 a lente objetiva com distncia focal f1 , L2 a lente de tubo com distncia
focal f2 , O o objeto que est no foco de L1 , d a distncia entre lentes, I o plano imagem
que est no plano focal de L2 . (a) Esboo do Microscpio. (b) Microscpio desfocalizado,
introduzido uma pequena desfocalizao f na distncia focal da lente L1 , a imagem
desfocalizada no plano I.
O termo
k0 f1
kf2
que o fator de magnicao do microscpio, e o sinal negativo signica
que a imagem invertida.

Para encontrar o campo eltrico ao passar pelo microscpio desfocalizado, calculado
Captulo 3.
26
o campo aps passar por cada elemento ptico como mostrado em [20][2]. O campo nal
obtido ao passar pelo microscpio desfocalizado e levando se em conta essa desfocalizao
dado por:

Z
~0
E(~
, f ) = cei( ) E0 1 + ink0
f 2
h(~q)ei~.~qd~q)ei 2k q
Onde c =
1
i2
(3.15)
k0 f1
kf2
E (~0 ) dado por:

k02 f1
f2
d
0
~
( ) = k(f1 f ) + k0 d + k0 f2 + 2
+
k0 k0
2f2 k
(3.16)
Vamos obter o contraste de fase de um objeto desfocalizado.

O contraste dado por:
C(~
, f ) =
I(~
, f ) I0
=0
I0
(3.17)
Obtendo a intensidade para um objeto desfocalizado:

= |E(~
, f )|2

Z

f
i f
q2
2
2
i~
.~
q
i 2k 2
2k
= c |E0 | 1 + ink0
h(~q)e
d~q e q e

Z
f 2
i~
.~
q
q ) .
= I0 1 2nk0
h(~q)e
d~qsen(
2k
I(~
, f )
(3.18)
Substituindo 3.18 em 3.17 obtemos:
Z
i~
.~
q
C(~
, f ) = 2nk0
h(~q)e

d~qsen
O contraste uma funo oscilatria com frequncia

2
temos: sen f
2k q =
f 2
2k q
q2
2k .
f 2
q
2k

.
(3.19)
Para pequenas desfocalizaes
E a relao do contraste de fase torna-se:

Z
C(~
, f ) = 2nk0
f 2
q h(~q)ei~.~qd~q
2k
(3.20)
Como k = n2 k0 obtemos:
Z
C(~
, f )
= nk0
n
=
f
n2
f 2
q h(~q)ei~.~qd~q
n2 k0
q 2 h(~q)ei~.~qd~q
(3.21)
Captulo 3.
27
Portanto temos uma expresso para o contraste de fase da qual possvel obter caractersticas quantitativas de clulas aderidas em especial da dinmica que ocorre nas membranas
celulares.
Para f = 0 microscpio no desfocalizado a equao do contraste torna-se:
C(~
, f = 0) =
n
f
n2
q 2 h(~q)ei~.~qd~q = 0.
Este resultado mostra que os objetos de fase no so visveis quando esto no foco. A
desfocalizao introduz uma diferena de fase f , entre a luz difratada e a no difratada
que ao se interferirem no plano imagem produz um contraste diferente de zero, e assim
possvel visualizar o objeto.
Captulo 4
Montagem Experimental
Neste captulo ser apresentada toda a montagem experimental desenvolvida neste trabalho, bem como todos os protocolos de extrao e cultura de embries, alm dos procedimentos usados pra se estabelecer a cultura de clulas extradas dos embries. Nesse trabalho
foi possvel adaptar os protocolos de extrao e cultura de embrio existentes na literatura
ao laboratrio de Fsica de Sistemas Biolgicos do Departamento de Fsica. Alm de estabelecer um protolo de extrao e cultura de clulas mesenquimais somticas extradas dos
embries em estgios prematuros.
4.1
Extraindo Embries
Os embries de galinha so obtidos de ovos fertilizados fornecidos pela empresa Rivelli.

Utilizamos uma linhagem para frangos de corte do tipo Cobb Avian tipo 1. Usando uma
incubadora que mantm o ambiente a 37 0 C e umidade de 50 % obtm-se embries de galinha
em vrios estgios de desenvolvimento. Os embries so extrados seguindo o protocolo
descrito em [1], que explicitaremos com mais detalhes a seguir.
28
Captulo 4.
29
Protocolo de Extrao de Embries

Material:
Incubadora que mantm o ambiente a 37 0 C e 50 % de umidade, a que utilizamos tem
capacidade para incubar 20 ovos.

Ovos fertilizados.
Papel ltro cortado em forma de anel.
Pratos petri fundo com 10cm de dimetro.
Um aro de arame.
Tesoura ponta na.
Pina metlica de ponta na.
PBS (do ingls
Phosphate-Buered Saline ) com pH de 7,4.
Bquer de 1L.
Preparando PBS (Phosphate-Buered Saline).

O PBS pH 7,4 preparado a partir da diluio de duas solues bases: soluo doadora
(D) e a soluo aceitadora (A).
Preparando a soluo aceitadora:
Dissolver 5 mM de N a2 HP O4 (Fosfato de Sdio Dibsico Anidro) em 600 mL de H2 O
deionizada (DI). Um mol de N a2 HP O4 corresponde a m=141,96 g, assim a massa

correspondente a 5 mM ser m=426 mg.
Preparando a soluo doadora:
Dissolver 10 mM de N aH2 P O4 (Fosfato de Sdio Monobsico Anidro) em 500mL de
H2 O DI. Um mol de N aH2 P O4 corresponde a m=137,99 mg, ento a massa corre-
spondente a 10 mM ser m=690 mg.

Para obter o PBS de pH 7,4: 44,6 mL da soluo doadora dluda em 355,4 mL da
soluo aceitadora. Posteriormente acrescenta-se 3,27g de NaCl, o pH dever ser medido
Captulo 4.
30
para a conrmao aps o acrscimo de NaCl, pois o pH da soluo ser levemente alterado.
A osmolaridade desta soluo aproximadamente 0.14M.
Procedimentos
1. Limpar os ovos com lcool 70%.
2. Para romper a casca do ovo: deve-se segurar o ovo horizontalmente na mesma posio
retirado da incubadora, sobre o prato petri de 10 cm de dimetro, abrir o ovo e remover
a casca. Na maioria dos casos, a blastoderme estar posicionada na parte superior e
aproximadamente na regio central da gema.
3. Identicar a regio onde est o embrio, esta regio no ser ntida nos primeiros
estgios .
4. Retirar o excesso da clara com o aro de arame na regio prxima ao embrio, com
cuidado pra no destruir o embrio, pois este muito frgil. necessrio retirar todo
o excesso de clara para permitir uma boa adeso do papel ltro em forma de anel
membrana vitelina.
5. Colocar o anel sobre a membrana vitelina, de forma a cobrir a regio onde o embrio
se encontra. importante que o anel esteja bem aderido a membrana para evitar que
este despreenda da membrana durante o experimento.
6. Recortar com a tesoura a regio ao redor do anel.
7. Retirar o anel de papel da superfcie da gema com a pina na, o anel deve conter em
seu meio o embrio. Retirar o anel sempre obliquamente superfcie, para evitar que
o embrio se depreenda do anel e que no ocorra acmulo de gema.
8. Em um prato petri de 10 cm colocar PBS, lavar o embrio no PBS de forma a retirar
todo o excesso de gema. Deixando assim a regio em que o embrio se encontra
totalmente transparente. Isso importante porque facilitar a visualizao do embrio
na Lupa ou no microscpio.
9. Assim o embrio est pronto para ser cultivado ou para extrair material dos somitos. Sendo que para serem cultivados necessrio a produo de um meio de cultura
Captulo 4.
31
Figura 4.1: (a) Incubadora com 20 ovos. (b) Bancada preparada para extrao dos embries.
(c) Os embries sendo preparados para extrao das clulas dos somitos. (d) Os embries
levados Lupa para observar o batimento cardaco e o crescimento de vasos.
Agar+Albumina que ser descrito posteriormente quando tratarmos de cultura de embrio.
10. O bquer ser utilizado para colher o restante do ovo, o qual o embrio foi retirado.
Em mdia conseguimos obter 75 % de embries dos 20 ovos colocados na incubadora.
No nal dos experimentos tnhamos o equivalente a 1L de material restante dos ovos.
Imagens do processo de extrao so mostradas na gura 4.1.
importante que todo material usado neste protocolo seja limpo com lcool etanol 70%
e esterilizado. O processo de esterilizao usado neste trabalho ser descrito a seguir:
Esterilizao
Captulo 4.
32
1. Levar o material ao microondas juntamente com um bquer de 1L de gua e deixar

por 4min. A gua do bquer deve ser trocada cada 4min. Este processo repetido 4
vezes, que equivale deixar o material 16 minutos no microondas. Durante os 4min que a
gua permanece no microondas ela comea a entrar em ebulio, assim o sistema atinge
uma temperatura prxima 100 0 C. esta temperatura grande parte das bactrias
que conseguem sobreviver a temperatura ambiente morrem. sempre importante
entre um intervalo e outro manter a porta do microondas fechada.
2. Posteriormente todo o material deve permanecer na luz UV por 20 minutos para destruir o restante dos microorganismos.
4.2
Extraindo clulas dos somitos do embrio
Um dos primeiros padres estruturados que surgem no embrio em desenvolvimento so os

somitos. As clulas dos somitos ainda possuem grande capacidade de diferenciao, mas
comeam a apresentar alguma especializao com surgimento de epitlio nas bordas. Para
extrair clulas dos embries precisamos de um embrio que j tenha somitos desenvolvidos,
entretanto como queremos obter parmetros que caracterize clulas no especializadas,
necessrio que o embrio se encontre em um estgio prematuro, ou seja, com pouca diferenciao celular. O embrio no estgio 10 atende estes requisitos segundo [9]. Para se obter
o embrio no estagio 10 o ovo deve permanecer de (33-38) horas na incubadora a 37 o C e
a 50 % de umidade. Como descrito no capitulo 2, neste estgio j houve a segmentao da
mesoderme somtica, e o embrio apresenta de 7 a 10 pares de somitos, mas seu sistema
nervoso ainda encontra-se bastante prematuro. A regio de interesse para a extrao de
clulas so os somitos mostrados na gura 4.2, a gura apresenta um embrio com 9 pares
de somitos.
O material removido dos somitos extrado usando uma micropipeta com uma ponta de
15 m a 20 m de dimetro. Construimos as pipetas com um puxador comercial de pipetas,
Pipette Puller (CE-HEKA). Realizamos vrias tentativas at encontrar os parmetros que
nos permitiram obter a pipeta com a ponta de dimenses desejadas. Desenvolvemos a
montagem para conectar a micropipeta, por uma mangueira, uma seringa e assim conseguir
sugar o material dos somitos. A micropipeta esta ligada a um deslocador (x,y,z), o qual
Captulo 4.
33
Figura 4.2: Embrio com 9 pares de somitos. Esto identicadas acima as principais estruturas do embrio no estgio H-H 10 segundo [9]. Esta foto foi obtida com uma Lupa (modelo
GWH10X-D OLYMPUS-JAPAN), calibrao da Lupa 1pixel=0.007mm.
permite escolher com bastante preciso o somito do qual ser sugado o material 4.3.
O material removido dos somitos colocado em portas-amostra de acrlico com aproximadamente 0.5ml de meio de cultura RPMI 1640. Como segue os protocolos a seguir.
Porta-Amostras
Para observar as clulas com objetiva de pequena distncia de trabalho foi necessrio desenvolver portas-amostra especiais os materiais e procedimentos esto descritos a seguir.
Material:
Reservatrio de acrlico de 1,5ml.
Lamnulas de microscpio (CORNING).
Graxa de silicone para AUTO-VCUO.
Mistura de LCOOL-ETER 50% de cada.
Papel de seda branco.
Captulo 4.
34
Figura 4.3: Montagem Experimental. (a) Micropipeta acoplada por uma seringa a um
deslocador (x,y,z). (b) Embrio aps remover material de um somito.
Todo procedimento abaixo foi realizado dentro do uxo laminar para evitar a contaminao das amostras.
Procedimentos
1. As lamnulas permanecem mergulhadas na mistura de LCOOL-ETER 50% em um
recipiente fechado de um dia para outro. Esta soluo retira qualquer gordura da
superfcie das lamnulas permitindo ou facilitando a adeso das clulas
2. As lamnulas devem ser secadas usando papel de seda branco.
3. Os reservatrios de acrlico sero colados s lamnulas usando a graxa de silicone para
auto-vcuo.
Atualmente existe no mercado alguns porta-amostras, apropriados para cultivar clulas
que posteriormente sero analisadas em objetivas de pequena distncia de trabalho. Entretanto como no conseguimos adquirir estes porta-amostras em tempo abil concluso
do mestrado desenvolvemos porta-amostras com reservatrios de acrilico, lamnulas e graxa
de silicone. Inicialmente encontramos diculdade em conseguir clulas aderidas nos portaamostras fabricados, pois as colas usadas para aderir o reservatrio de acrilico lamnula
eram txicas s clulas. Posteriormente testamos uma graxa de silicone para auto-vcuo e
obtemos sucesso na cultura. Desde ento obtemos clulas bem aderidas nos porta-amostras
fabricados.
Captulo 4.
35
Meio de cultura:
As clulas foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com SFB (Soro Fetal Bovino),
com protenas inativadas. Foram usadas concentraes 10 % e 20 % de SFB.
Procedimentos para fazer 50 ml de meio de cultura:

1-Preparando 50ml de RPMI com 10% SFB.
Aps esterilizar todo material a ser utilizado na preparao do meio. Em um bquer de
80 ml colocado 45 ml de RPMI, e em um bquer de 15 ml so medidos 5 ml de SFB que
ser ento adicionado ao bquer de 80ml. Usamos antibiotico para evitar contaminao por
bactrias, Penicilina (100Unidades/ml).
2-Preparando 50ml de RPMI com 20% SFB.

Em um bquer de 80 ml colocado 40 ml de RPMI, e em um bquer de 15 ml so medidos
10 ml de SFB que ser ento adicionado ao bquer de 80 ml. Todo este procedimento dever
ser realizado dentro de um ambiente esteril, a capela. Foi observado um maior nmero de
clulas aderidas nas amostras que estavam com meio suplementado a 20% de SFB.
Cultura de Clulas Mesenquimais Somticas.

A cultura de clulas mesenquimais somticas obtida atravs do material removido dos
somitos que ser mantido em cultura com meio RPMI 1640. O cultivo de clulas muito
suscetvel contaminaes. Assim, antes de iniciar o processo de colhimento de material dos
somitos para ser colocado em cultura, todo material a ser utilizado na cultura deve estar
previamente separado e esterilizado.
Material:
Material retirado dos somitos.
Portas-amostra de acrlico, esterilizados.
Meio de cultura.
Cmera de CO2 mantida a 370 C e com 5% de CO2 .
Placas petri de 10cm de dimetro com tampas descartveis.
Penicillina 1% da soluo total.
Captulo 4.
36
Procedimentos
1. O material retirado dos somitos dever ser colocado no porta-amostra de acrlico e levado rapidamente capela para evitar qualquer tipo de contaminao com o ambiente.
O esquema de extrao de material dos somitos mostrado na gura 4.3-(a).
2. Acrescentar 1ml de meio de cultura RPMI 1640 ao reservatrio de acrlico.
3. Os portas-amostra so colocados em placa petri, e levados a cmera de CO2 onde
permaneceram de 2 a 3 dias. Cada placa de petri pode conter at dois portas-amostra.
O meio de cultura deve ser trocado todos os dias para manter o meio sadio e evitar
possveis contaminaes. As clulas realizam metabolismo rpido e consequentemente o pH
do meio muda, conseguimos identicar a variao de pH pela mudana da colorao no meio
de cultura. Quando os portas-amostra so colocadas na cmera de CO2 o meio contm uma
colorao rsea e posteriormente quando as clulas iniciam o metabolismo o meio torna-se
mais amarelo. Se ocorrer uma contaminao por fungo, por exemplo, o tom amarelado
normalmente torna-se bastante escuro. Isso pode ocorrer durante a obteno de clulas, e
nesse caso as clulas devem ser descartadas e o procedimento para obteno das clulas deve
ser recomeado do princpio.
Para vericar se as clulas aderiram s lamnulas necessrio aguardar de 2 a 3 dias.
Posteriormente realizada uma lavagem nas amostras com meio de cultura suplementado
com SBF, neste processo as clulas no aderidas so removidas da amostra. A amostra
dever ser levada do uxo para a montagem experimental da gura 4.4, normalmente tampamos a amostra com uma lamnula de microscpio previamente esterilizada para evitar
contaminaes.
Utilizamos a montagem mostrada no esquema da gura 4.4 para realizarmos os experimentos. A montagem feita sobre um microscpio invertido (Nikon Eclipse TE300) com
uma objetiva de imerso a leo (CFI Plan Apochromat 60X oil) com aumento de 60X e
abertura numrica 1,4.
Para manter o sistema 37 0 C, placas de cermicas so ligadas a um controlador de
temperatura e funcionam como aquecedores. Toda a montagem experimental apresentada na
Captulo 4.
37
Figura 4.4: Esboo da montagem experimental. A luz da lmpada de tungstnio halgena

passa por um condensador e ilumina a amostra. A amostra est entre duas placas de cermica
que funcionam como aquecedores mantendo o ambiente a 37 0 C, estas so ligadas a um
controlador de temperatura. A amostra livre para deslocar em x, y, z usando um deslocador
piezoeltrico, Digital Piezo Controller (PI E-710-3CD). As estruturas so visualizadas com
uma objetiva de imerso a olo com aumento de 60X, e as imagens so capturadas por uma
camera CCD (UNIQ Vision lnc) e processadas por um computador.
gura 4.4 isolada por uma caixa de acrlico. Usamos um termmetro digital (EQUITHERM
SERIE-27341) para vericar se a temperatura prximo as amostras permanece a 37 0 C.
A imagem obtida por uma cmera CCD (UNIQ Vision lnc) que est ligada ao computador. Para capturar os lmes usamos o programa X-CAP (EPIX). E para analisar os
lmes usamos o ImageJ, software livre http://rsbweb.nih.gov/ij/.
4.3
Cultura de Embrio
Para analisar a freqncia do batimento cardaco e o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embrionrio desenvolvemos um sistema de cultura de embries no Laboratrio
de Fsica de Sistemas Biolgicos. Para tanto zemos uma adaptao do protocolo descrito
em [21]. O meio de cultura Agar-Albumina, contm os nutrientes necessrios para o embrio
Captulo 4.
38
sobreviver at 36 horas in vitro.
Preparando meio de Cultura de embries.

Material:
0.18g de Agar (HIMEDIA RM-666).
30 ml de soluo salina (0.791g de NaCl dissolvido em 100 ml de gua destilada).
0.6 ml de Penicilina (100Unidades/ml).
Placas petri de 35mm.
2 Bquers de 100ml.
30ml de clara na extrada de 8 ovos frescos.
Recipiente com grande rea supercial, e com tampa, reservatrio de porta-amostras.
Todos materiais utilizados neste protocolo devem ser submetidos ao processo de esterilizao.
Procedimentos
1. Colocar 30 ml de salina em um bquer de 100 ml e levar a um aquecedor ou microondas.
Quando a salina comear a entrar em ebulio deve-se adicionar 0.18g de Agar e
devemos mexer at que o Agar esteja completamente dissolvido. Inicialmente a soluo
tem uma colorao turva e isso indica que o Agar ainda no est completamente
dissolvido, quando o Agar esta completamente dissolvido a soluo ter uma colorao
transparente.
2. Extrair 30ml de clara na, parte mais lquida da clara, de 8 ovos frescos.
3. Aquecer a clara em banho-maria. Neste procedimento a gua deve estar temperatura menor ou igual 50 0 C para evitar que as enzimas presentes na clara sejam
desnaturadas, o que leva perda da atividade biolgica do meio.
4. A clara aquecida em banho-maria adicionada no bequer contendo o Agar dissolvido
em salina. necessrio adicionar a clara devagar para evitar a criao de bolhas na
soluo. As bolhas so indesejadas, pois atrapalham na obteno dos lmes.
Captulo 4.
39
5. Forrar com papel toalha o reservatrio de porta-amostras e molhar para manter o

ambiente mido, evitando assim que o meio resseque.
6. A soluo distribuida em placas petri de 35 mm, mantendo temperatura ambiente
o meio adquire uma consistncia de gelatina.
Aps o embrio ser extrado, no estgio de interesse, de acordo com o protocolo descrito acima e colocado em meio de cultura. O embrio levado montagem experimental
apresentada na gura 4.5 para obteno dos lmes, que posteriormente sero analisados.
A montagem experimental apresentada na gura 4.5 foi desenvolvida para obter lmes
do embrio in vitro. A montagem feita sobre uma Lupa, modelo GWH10X-D OLYMPUSJAPAN. Esta montagem foi realizada com a colaborao dos funcionrios da ocina mecnica
e eltrica do Departamento de Fsica da UFMG.
Figura 4.5: Montagem da caixa de acrlico sobre a Lupa, internamente a caixa esta acoplada
a uma resistncia que funciona como um aquecedor para manter o sistema a 37 0 .
Para manter o sistema 37 0 C e umidade de 50 % montamos uma caixa de acrlico com
um orifcio central, onde a amostra ser colocada. Ao redor do orifcio na caixa de acrlico
foi acoplada uma resistncia que funciona como um aquecedor em imerso gua. A gua
umedece a regio ao redor da amostra, mantendo assim o ambiente nas condies necessrias
sobrevivncia do embrio in vitro. Entretanto, como a lupa est localizada logo acima da
Captulo 4.
40
caixa, a imagem do embrio embaava devido a grande umidade do ambiente, sendo assim,
foi necessrio retirar a gua do sistema. A resistncia usada era ideal para funcionar imersa
gua, ao retirar a gua do sistema ela superaquecia o ambiente. Assim foi necessrio ligar
ao sistema um transformador, que diminuiu a tenso da resistncia. Desta forma foi possvel
manter o sistema a uma temperatura constante prximo aos 370 C. Um termmetro digital
foi usado para medir a temperatura prximo as amostras, e vericar a estabilidade desta
temperatura. Atualmente j instalamos controladores de temperatura para esta montagem,
o que dever melhorar nosso sistema experimental. A imagem obtida por uma cmera
CCD, a captura feita usando o X-CAP e para analisar dos lmes usamos o Imagej, mesmo
sistema descrito anteriormente para observar clulas.
Captulo 5
Resultados e Discusses
Neste capitulo, em primeiro lugar, sero apresentados os resultados obtidos usando a

Microscopia de Desfocalizao, para analisar o tempo de relaxao da membrana das clulas
mesenquimais somticas. Posteriormente, sero discutidos os resultados da freqncia de
batimento cardaco e a criao de vasos durante o desenvolvimento embrionrio.
5.1
Clulas Mesenquimais Extradas dos Somitos
Nas primeiras tentativas para se estabelecer o protocolo de extrao, cultura e o tempo

de aderncia lamnula das clulas extradas dos somitos, clulas mesenquimais somticas,
usamos uma objetiva de 40X para observar as amostras, pois o porta-amostra, placa-petri,
era bastante espesso e no conseguimos analisar as amostras com objetiva 60X, que possui
pequena distncia de trabalho.
41
Captulo 5.
42
Para estabelecer o tempo de aderncia das clulas lamnula as amostras foram levadas
ao microscpio a partir do primeiro dia aps a extrao. A gura 5.1 apresenta as amostras
observadas aps o primeiro, segundo e terceiro dia de cultura.
Figura 5.1: (a) Primeiro dia aps a extrao, dicilmente se observa clulas aderidas. (b)
Segundo dia aps a extrao, poucas clulas aderidas. (c) Terceiro dia aps a extrao,
maior quantidade de clulas aderidas.
Usualmente clulas de cultura necessitam de algumas horas para aderirem ao substrato
mas como podemos observar na gura 5.1, apenas aps o segundo e terceiro dia que o
material permanece em cultura possvel observar clulas aderidas lamnula. Em poucas
amostras foram observados clulas aderidas no segundo dia de cultura, enquanto o maior
nmero de clulas aderidas em 75% das amostras observado a partir do terceiro dia de
cultura.
Foram testadas concentraes diferentes de SFB (Soro Fetal bovino) 10% e 20% da
soluo total de meio de cultura RPMI 1640. Para ambas concentraes foram observadas
clulas aderidas, entretanto foi observado um nmero maior de clulas aderidas para as
amostras com 20% de SFB.
Aps estabelecer o protocolo de extrao, cultura e o tempo de aderncia das clulas
laminula, a proxima etapa deste trabalho foi conseguir observar clulas com uma objetiva
de maior aumento, 60X. A distncia de trabalho da objetiva de 60X pequena, assim foi
necessrio desenvolver porta-amostras de acrlico, cubetas de acrlico aderidos com uma graxa
de silicone laminulas de microscpio, e com estes porta-amostras foi possvel analisar as
clulas em uma objetiva de maior aumento.
A gura 5.2 apresenta clulas extradas dos somitos desfocalizadas de aproximadamente
1, 5m, mantidas em cultura com 20% de SFB e com mesmo perodo de incubao na cmera
de CO2 , entretanto estas clulas exibem formatos bem diferentes. Para fazer uma caracteri-
Captulo 5.
43
zao mais rigorosa destas clulas seria necessrio usarmos marcadores, atravs destes seria
possivel detectar quais os tipos de clulas presentes nas amostras. Entretanto neste trabalho
o objetivo principal foi obter parmetros quantitativos da dinmica na membrana celular,
atravs dos quais conseguiriamos caracterizar o comportamento de uma clula.
Figura 5.2: Clulas extradas dos somitos e bem aderidas na lamnula. Esta gura apresenta
as clulas a partir do terceiro dia, do qual o material extrado dos somitos permaneceu bem
aderido em cultura.
Caracterizando a membrana das clulas mesenquimais somticas.

Para caracterizar as clulas foi obtido o tempo de relaxao da membrana. Para isto foram
feitas analises de correlao temporal do contraste de lmes digitalizados. A gura 5.3
apresenta uma clula que exibe duas regies com comportamentos diferentes. A seta indica
a direo de movimento de cada regio da membrana.
Os tempos de correlao temporal foram obtidos a partir de um lme de 10 minutos capturado pelo programa X-CAP(EPIX) e processado usando um plugin do Imagej, Correlao
Temporal Mdia Pixel segue em Anexo. Atravs deste plugin obtemos as curvas correlao
temporal para o contraste, que podem ser ajustadas pela equao 5.1, que apresenta um
decaimento exponencial simples.
t
C(~r, t0 ) hC(0)C(t)i = (nf )2 k 2 e .
(5.1)
Onde ~r a distncia pixel a pixel, t o tempo entre um pixel e o pixel de referncia.

n a diferena dos ndices de refrao entre o meio e o objeto de fase, as clulas. f
Captulo 5.
44
Figura 5.3: Atravs da correlao temporal encontramos resultados diferentes para diferentes
regies da membrana celular. Nesta gura esto identicadas duas regies 1 e 2 que exibem
comportametos diferentes.
a desfocalizao introduzida na imagem, e esta desfocalizao que gera a diferena de
fase, que nos permite observar o objeto como descrito no capitulo 3. O termo k2 a curvatura local da membrana. Para caracterizar o tempo de relaxao da membrana foi feito
um mapeamento em toda membrana celular e obtemos resultados diferentes para regies
diferentes, o grco 5.4(a) mostra o tempo de relaxao caracterstico para a regio que apresenta maior motilidade, regio 1 sinalizada na gura 5.3. Obtemos tambm o tempo de
relaxao da regio da membrana que apresenta menor motilidade, regio 2 sinalizada na
gura 5.3. Usualmente as clulas de vertebrados estudadas no laboratrio como macrfagos
e broblastos apresentam um comportamento isotropico em toda membrana celular, bem
diferente do comportamento apresentado pelas clulas mesenquimais extradas dos somitos.
Nos grcos 5.4(a) e 5.4(b) os pontos experimentais estam bem ajustados uma exponencial simples, equao 5.1, atravs do ajuste da curva obtemos um tempo de relaxao
para a regio de menor motilidade e outro para a regio de maior motilidade. O tempo de
relaxao da regio de maior motilidade menor que o tempo da regio de menor motilidade.
A membrana celular das clulas mesenquimais somticas no apresentava um tempo de relaxao homogneo, assim foi necessrio fazer novos experimentos, nos quais fosse possivel
Captulo 5.
45
(a)
(b)
Figura 5.4: Tempo de relaxao obtido do ajuste da equao 5.1 de autocorrelaco temporal
do contraste em nivel de cinza para as regies de: a)Maior motilidade, menor tempo de
relaxao obtido foi = (6.6 0.1)s. b)Menor motilidade, maior tempo de relaxao obtido
foi = (17 3)s.
acompanhar celo comportamento celulra por um longo tempo. Alm disso, obtemos o tempo
de relaxao em cada regio da membrana para lmes curtos. Como mostrado na gura 5.3
para o lme curto podemos observar a membrana aderindo em uma direo e desaderindo
na direo oposta.Ento, ns monitoramos a clula por um longo tempo, a m de analisar
o comportamento de clulas com diferentes tempos de relaxao obtidos em membrana. Os
resultados so muito interessantes durante um lme de (1-2) horas possvel ver o deslocamento de clulas, como mostrado na gura 5.3.
As clulas mesenquimais so bastante invasivas, pois elas vo se deslocando pelo embrio,

diferenciando e montando os tecidos [22]. Alm disso, estas clulas tem caractersticas bastante semelhantes s clulas cancergenas [23]. Sendo assim esperado que a dinmica na
membrana celular seja diferente das clulas de vertebrados j analisadas no laboratrio. A
partir da observao dos lmes vericou-se que as regies das clulas apresentavam dinmicas diferentes. Algumas partes da membrana celular esto aderindo em uma direo da
lamnula enquanto outras estavam desaderindo em outra regio. Para relacionar o tempo
de relaxao da membrana com o movimento da clula foram feitos lmes de longa durao
Captulo 5.
46
com 1 e 2 horas. A gura 5.5 apresenta uma foto inicial do lme de 1 e 2 horas, e uma foto
no nal do lme mostrando o deslocamento da clula no intervalo de tempo analisado. Com
os lmes longos foi possvel acompanhar o comportamento da clula em um tempo maior,
observar a direo do deslocamento da clula, enquanto que os lmes curtos de 10min foram
obtidos para analisar o tempo de relaxao da membrana celular.
Figura 5.5: Fotos de clulas aderidas extradas dos somitos inicialmente, 2 e 1 horas depois,
as setas na regio 1 indicam as regies de maior motilidade, menor tempo de relaxao
temporal. As setas na regio 2 indicam as regies de menor motilidade, maior tempo de
relaxao temporal. A seta GRANDE indica a direo do movimento da clula.
Novamente encontramos o tempo de relaxao em toda membrana e os resultados obtidos
mostram que o tempo de relaxao menor na regio para qual o movimento da clula est
direcionado. Os grcos 5.6 e 5.6 apresentam os tempos de relaxao, obtidos nas regies de
maior motilidade da membrana e de menor motilidade respectivamente. Os lmes mostram
uma regio da membrana espalhando e aderindoem uma direo da lamnula (regio com
menor tempo de relaxao) enquanto o maior tempo de relaxao da membrana est na
regio contraria direo do movimento da clula.
Os resultados desta anlise mostraram que as clulas mesenquimias somticas, extradas
dos somitos, exibem comportamentos diferentes na membrana celular. Para caracterizar esta
Captulo 5.
47
(a)
(b)
Figura 5.6: Grcos de correlao temporal do contrate em nivel de cinza ajustado com a
equao 5.1 para diferentes regies das clulas observadas em intervalos de tempo de 1 a 2
horas. No grco a) O tempo de relaxao obtido foi = 7 2s para a regio de maior
motilidade. No grco b) o tempo de relaxao obtido foi = 20 2s para a regio de menor
motilidade.
diferena, analisamos o tempo de relaxao da membrana, o qual bastante heterogneo.

Os tempos obtidos foram: da ordem de = 7 2s nas regies de maior motilidade e da
ordem de = 20 2s nas regies de menor motilidade. Associando o tempo de relaxao
da membrana com o movimento da clula obtemos um resultado bastante consistente. As
anlises mostram que as regies na qual encontramos o menor tempo de relaxao a regio
de maior motilidade da membrana celular. Enquanto que na regio na qual encontramos o
maior tempo de relaxao da membrana a molitidade menor. Assim podemos armar que
a clula sinaliza a direo do seu movimento, ou seja a clula sempre se move na direo
da regio de maior motilidade. Precisamos agora obter uma estatstica maior para comprovar denitivamente nossos resultados. Um outro fator importante que podemos explorar
nos prximos experimentos usar marcadores de clulas, com estes possvel analisar se
um mesmo grupo de clulas tem comportamentos semelhantes. Em nossas amostras tinhamos grupos variados de clulas, algumas apresentaram grande motilidade analisadas em
um tempo maior enquanto outras cavam completamente paradas.
Captulo 5.
5.2
48
Frequncia de Batimento Cardaco Durante o Desenvolvimento Embrionrio.
Nesta seo ser apresentado o comportamento da freqncia de batimento cardaco do

embrio de galinha(Gallus gallus), cultivado in vitro em meio de Agar + albumina durante
o desenvolvimento embrionrio. A freqncia de batimento cardaco comea irregular e vai se
denindo durante o desenvolvimento embrionrio, as primeiras contraes comeam quando
os embries se encontram no estgio 10 (33-38 horas). Aqui vamos apresentar tambm
resultados encontrados para a freqncia de batimento de cardiomicitos em cultura, clulas
do corao para comparao.
Para obter a freqncia de batimento foram feitos lmes de 900 frames durante 60 segundos. Foram feitos lmes dos coraes de embries extrados de acordo com o protocolo
descrito 4. Usamos o plugin, Mouse Listener (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/mouselistener.html) para capturar a posio (x,y) da interface do corao. A posio x mantida
como uma posio xa enquanto a componente y desloca a medida que o corao se contrai
nos 900 frames do lme. Assim obtemos o sinal das contraes, variao da componente y,
do corao durante um minuto, a cada intervalo de uma hora. A gura 5.7 apresenta um
exemplo do sinal obtido das contraes do corao. Usamos o programa Mathcad (PTC
software) para fazer a transformada de Fourier do sinal. Inserimos a posio da interface do
corao e o tempo para obter o espectro de potncia pela freqncia em (Hz).
Figura 5.7: (a) Sinal obtido da variao da interface do corao, posio y, mostrando um
zoom em uma regio.
Captulo 5.
49
Apresentaremos no grco 5.8, o resultado do espectro de potncia pela frequncia

em (Hz) de um cardiomiocito, clula do corao, para comparao com as contraes nos
primeiros estgios de desenvolvimento embrionrio
Figura 5.8: Espectro de potncia pela freqncia em (Hz), para um cardiomiocito, clula
do corao de camundongo de cultura primria.
Os embries foram cultivados in vitro e acompanhamos as contraes ao longo de algumas
horas para obter os espectros de potncia. A partir do sinal apresentado na gura 5.7,
obtm-se a transformada de Fourier das contraes do corao. A gura 5.9 apresenta o
espectro de potncia pela freqncia em (Hz). Inicialmente o espectro bastante aleatrio,
similar ao comportamento do espectro obtido para o cardiomiocito apresentado no grco
5.8, e posteriormente observa-se a denio de um pico em uma determinada frequncia de
batimento.
O grco 5.10(a) apresenta os resultados obtidos para dois embries cultivados in vitro.
Apresentaremos a frequncia do maior pico em funo da idade do embrio em horas. Os
pontos apresentam um comportamento bastante interessante, inicialmente a frequncia de
batimento pequena e vai aumentando com a idade do embrio. Espera-se que esta curva
atinja um ponto de saturao quando a freqncia de batimento cardaco do embrio estiver
denida, esse tempo da ordem de 9 dias.
Como discutido no captulo 2, o nmero de somitos um parmetro ideal para indicar o
estgio embrionrio, a idade do embrio que se desenvolve in vitro, assim o grco 5.10(b)
apresenta a freqncia do batimento cardaco pelo nmero de somitos. Os resultados apresentados no grgico 5.10(b) foram obtidos para dois embries cultivados in vitro. Apesar
Captulo 5.
50
Figura 5.9: Espectro de potncia pela freqncia em (Hz), para um embrio cultivado em
vitro a partir das 36hs ate 49hs.
do grco 5.10(b) ter poucos pontos seu comportamento similar ao do grco 5.10(a),
conseguimos obter um comportamento padro que descreve a frequncia de batimento do
corao de galinha nos primeiros estgios do desenvolvimento embrionrio.
Estes resultados so muito interressantes, entretanto no so inditos, quando iniciamos
o trabalho sobre a freqncia de batimento cardaco procuramos na literatura trabalhos relacionados e no encontramos, entretanto ao fazer a reviso bibliogrca mais rigorosa, aps
obter estes resultados foram encontrados alguns trabalhos antigos, publicados em livros de
peridicos. Desde 1932 existem pesquisadores, investigando a freqncia de batimento do
corao de galinha durante o desenvolvimento embrionrio. No artigo de 1932 [24] foi investigado a freqncia de batimento cardaco do corao de galinha (Gallus gallus) durante
o desenvolvimento embrionrio, desde as primeiras contraes do corao at o momento
Captulo 5.
51
(a)
(b)
Figura 5.10: Freqncia do pico do espectro obtido atravs da Transformada de Fourier pela
idade do embrio em: horas e nmero de somitos a)Idade do embrio em Horas. b)Idade
do embrio em nmero de somitos
em que o embrio nasce. Neste artigo apresentado um grco das batidas do corao em
um minuto pela idade do embrio em horas. Inicialmente o grco tem um comportamento
exponencial similar aos resultados que obtemos nesta dissertao, e a partir do nono dia de
incubao a curva satura at o momento do nascimento. Alm disso, no artigo [24] foi analisado a freqncia de batimento do corao de galinha para machos e fmeas e os resultados
obtidos mostram que no ha diferena signicativa entre as freqncias de batimentos de
ambos sexos. Em outro artigo de 1967 [25], foi feito uma anlise da freqncia de batimento
cardaco do corao de galinha (Gallus gallus) pela idade do embrio em horas por dois
mtodos diferentes, um mtodo no invasivo (embrio no exposto ao ambiente), e outro
invasivo (embrio exposto ao ambiente). Os resultados mostram que o comportamento
da curva em ambos casos o mesmo, entretanto, anlises dos batimentos usando o mtodo
invasivo mostram-se menores comparadas com os resultados dos batimentos do mtodo no
invasivo. Em todos os trabalhos citados, a frequncia de batimento inicialmente tem um
comportemento exponencial e posteriormente atinge um patamar de saturao. Portanto,
os resultados da literatura comprovam o comportamento exponencial para a frequncia de
batimento crdico que obtemos neste trabalho nos estgios iniciais do desenvolvimento embrionrio. Ainda assim, esperamos que nosso mtodo seja til para identicar parmetros
importantes que levam o corao a iniciar seu batimento, principalmente quando comparamos esses resultados com cultura de cardiomicitos.
Captulo 5.
5.3
52
Crescimento de vasos em embrio de galinha
(Gallus gallus).
O sistema circulatrio muito importante no desenvolvimento embrionrio, sua tarefa
complicada porque alm de crescer e ser continuamente remodelado para acompanhar o
crescimento global do embrio, ele deve permanecer totalmente funcional para suprir as
necessidades das clulas embrionrias desde o incio do desenvolvimento. Alm disso, um
modelo interessante para se estudar e entender o processo de formao de vasos, que um
ponto de partida para se estudar doenas como o cncer, que induz regies irrigadas de
vasos sanguneos. Sendo assim, pretendemos usar nosso sistema para estudar a formao
dos vasos, nesta seo ser apresentado algumas fotos extradas dos embries mantidos na
incubadora.
A gura 5.11 apresenta um embrio no estgio 10, este embrio apresenta poucas estruturas do sistema vasculatrio. No conseguimos identicar nenhum vaso na area opaca e
possvel identicar os primeiros vasos que esto se formando na regio da rea pelucida,
regio interna do embrio.
Figura 5.11: Embrio no estgio 10 em meio de cultura de Agar+Albumina.

A primeira e mais importante estrutura do sistema vascular o corao que analisamos
anteriormente. As estruturas tubulares que se fundem formando o corao estudado no
capitulo 2, daro origem aos primeiros grandes vasos do sistema vasculatrio. A circulao no
embrio de galinha pode ser dividida em circulao de dois arcos distintos sendo que o corao
Captulo 5.
53
uma estrutura comum e est localizado no centro. Um arco completamente circulatrio

estabelecido internamente com o corpo do embrio. E um segundo arco determina veias
localizadas nas membranas extra-embrionrias envolvendo a gema. As veias vitelinas se
comunicam com o corao por meio de veias que atravessam o corpo embrionrio [12].
Figura 5.12: Embrio no estgio 17 (60 horas), em meio de cultura de Agar+Albumina.

Nesta gura est apresentando os vasos na regio da rea opaca (so vasos mais calibrados),
e os vasos na regio da rea pelucida (vasos mais nos).
Na gura 5.12 conseguimos observar que o sistema vascular do embrio est em um
estgio bem avanado, as duas arterias principais j esto formadas e a regio da area opaca
encontra-se completamente vascularizada.
Figura 5.13: (a) Vasos do arco interno, na regio da rea pelucida em um embrio de 36
horas.(b) Vasos do arco interno em um embrio de 49 horas.
Captulo 5.
54
A seguir apresentaremos na gura5.14 um embrio extrado no sexto dia de incubao.

Em (A) est apresentado o embrio sobre a superce do ovo identicando as regies 1 e 2.
As regies 1 e 2 so imagens extradas das ramicaes dos vasos no embrio.
Figura 5.14: Embrio no estgio 29, neste estgio o sistema vasculatrio est bem avanado e
comea envolver toda a superfcie do ovo. Na foto (A) do embrio sobre ovo est identicado
as regies 1 e 2, estas regies so mostradas as imagens obtidas pela lupa. Em 1 est
apresentado as ramicaes das extremidades dos vasos, e em 2 apresentado o tronco do
qual se origina as ramicaes.
Com as fotos obtidas oberva-se que o crescimento de vasos no embrio de galinha um
processo que pode ser acompanhado, pois ocorre na ordem de horas . Apesar dos embries
de galinha no apresentar um desenvolvimento bem caracterstico, em nossos experimentos
conseguimos observar que os primeiros vasos se formam no embrio apartir das 36 horas de
incubao. E segundo [9] as primeiras vesiculas pticas ocorrem entre os estgios 9(29-33
horas) e 10(33-38 horas).Um dos prximos objetivos deste trabalho acompanhar a formao
dos vasos no tempo. Queremos acompanhar a evoluo no tempo de um embrio no estgio
10 para o estagio 29 por exemplo. A gura 5.13 mostra que estamos progredindo bastante
Captulo 5.
55
para observar esse fenmeno em um embrio. Para tanto precisamos aprimorar o sistema de
observao do embrio in vitro no microscpio.
Captulo 6
Concluses
Neste trabalho, desenvolvemos protocolos, tambm como toda montagem experimental, para extrao e cultura de clulas mesenquimais somticas e de embries de galinha
Gallus gallus adaptados ao Laboratrio de Fsica de Sistemas Biolgicos do Departamento

de Fsica da UFMG. Usando a Microscopia de Desfocalizao foi possvel observar clulas mesenquimais somticas aderidas em substrato desfocalizadas aproximadamente 1,5m,
aps o segundo dia de cultura. A partir das anlises de correlao temporal do contraste
obtemos os tempos de relaxao de diferentes regies na membrana celular. Os tempos
de relaxao obtidos foram bastante heterogneos. Para relacionar o tempo de relaxao
da membrana com o comportamento das clulas foram capturados lmes longos de (1-2)
horas. Os resultados indicam que a clula apresenta uma sinalizao do seu movimento.
Em nossas anlises, as clulas sempre se movimentam em direo a regio da membrana
que apresenta menor tempo de relaxao. Alm disso, temos grande interesse em analisar
o tempo de relaxao da membrana durante o processo de diferenciao celular. Clulas
mesenquimais tm capacidade de se transformarem em outros tipos de clulas devido a sua
grande plasticidade. No processo de diferenciao a rigidez da membrana varia, com isso
esperamos que o tempo de relaxao da membrana tambm sofra alteraes. Alm disso,
analisamos o batimento cardaco e o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embrionrio. Utilizamos uma Lupa com aumento de 7.5X para obter os lmes dos embries em
diferentes estgios de desenvolvimento. Estudamos a evoluo da freqncia de batimento
do corao de galinha nas primeiras horas do desenvolvimento. Para tanto, obtemos o espectro de potncia a partir da posio (x-y) na interface do corao capturados durante as
contraes. Em estgios iniciais as contraes so irregulares e fracas, como as contraes em
1
Captulo 6.
Concluses
culturas de cardiomicitos, tornando-se mais regulares e fortes em estgios posteriores. As

anlises da frequncia de batimento mostram que inicialmente a freqncia de batimento
bastante irregular bem prxima da freqncia de batimento de uma nica clula do corao,
o cardiomiocito, tornando mais regular durante o desenvolvimento embrionrio. Alm disso,
conseguimos observar o crescimento de vasos no embrio de galinha, obtemos estgios no
qual o embrio no apresentava vasos e estgios bem vascularizados. Na prxima etapa
deste trabalho queremos acompanhar o crescimento de vasos no tempo e conseguir obter
paramentos da dinmica de crescimento.
Apndice A
Programa para auto-correlao

temporal.
import ij.*;
import ij.process.*;
import ij.gui.*;
import java.awt.*;
import ij.plugin.*;
import ij.plugin.filter.*;
public class CorrelaoTemporalMediaPixel_ implements PlugIn {
public void run(String arg) {
ImagePlus imp = WindowManager.getCurrentImage();

if (imp==null)
{IJ.noImage(); return;}
Roi roi = imp.getRoi();

if (!(roi!=null && roi.getType()==roi.LINE) )
{IJ.error("Straight line selection required."); return;}
double angle = 0.0;

if (roi.getType()==Roi.LINE) {
Line line = (Line)roi;
angle = roi.getAngle(line.x1, line.y1, line.x2, line.y2);
} else if (roi.getType()==Roi.POLYLINE)
angle = ((PolygonRoi)roi).getAngle();
int nSlices=imp.getStackSize();
double[] data = ((Line)roi).getPixels();

int tamanholinha = (int)data.length-1;
double[][] dados = new double[tamanholinha][nSlices];
double[] correlacao = new double[nSlices];
double[] media = new double[tamanholinha];
for (int j=0;j<nSlices;j++) {

IJ.showProgress((double)j/nSlices);
imp.setSlice(j+1);
double[] ddata = ((Line)roi).getPixels();
for(int i=0; i<tamanholinha;i++){

dados[i][j]=(double)ddata[i];
media[i]+=dados[i][j];
}
}
for (int i=0; i<tamanholinha; i++)
media[i]=media[i]/nSlices;
for (int k=0; k<tamanholinha; k++)

{
IJ.showProgress((double)k/tamanholinha);
for (int j=0; j<nSlices;j++)

{
double temp = 0;
for (int i=0; i<nSlices-j; i++)
temp += (dados[k][i]-media[k])*(dados[k][i+j]-media[k])/(media[k]*media[k]);
correlacao[j] += temp/(nSlices-j);
}
String headings = "t\t<C(0)C(t)>";

IJ.setColumnHeadings(headings);
for(int i=0;i<nSlices;i++)
{
correlacao[i] = correlacao[i]/tamanholinha;
IJ.write(i+"\t"+(float)correlacao[i]);
IJ.register(CorrelaoTemporalMediaPixel_.class);
}
//IJ.write("media="+media);
//IJ.write("tamanho linha="+tamanholinha);
//IJ.write("nSlices="+nSlices);
IJ.showProgress(1.0);
Referncias Bibliogrcas
[1] U. Agero, James A. Glazier, and M. Hosek. Bulk elastic properties of chicken embryos during somitogenis. BioMedical Engineering Online, 9:19, 2010.
[2] U.M.S. Andrade. Microscopia de Desfocalizao e seus Limites de Validade. Master's thesis, Universidade Federal de Minas Gerais, 2010.
[3] C. Vater, P. Kasten, and M. Stiehler. Culture media for the dierentiation of mesenchymal stromal
cells. Acta Biomaterialia, 2010.
[4] U. Agero, C.H. Monken, C. Ropert, R.T. Gazzinelli, and O.N. Mesquita. Cell surface uctuations
studied with defocusing microscopy . Physical Review, E 67:051904, 2003.
[5] J.C. Neto, U. Agero, D.C.P. Oliveira, R.T. Gazzinelli, and O.N. Mesquita. Real-time Measuraments of
Surface Dynamics on Macrophages and the Phagocytosis of Leishmania Parasites. Experimental Cell
Research,
303:207217, 2005.
[6] O. Pourqui. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mechanisms of development,
121(9):10691079, 2004.
[7] C. Tickle. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.
Mechanisms of development,
121(9):10191029, 2004.
[8] C.D. Stern. The Chick:: A Great Model System Becomes Even Greater. Developmental cell, 8(1):917,
2005.
[9] V. Hamburger and H.L. Hamilton. A series of normal stages in the develoments of the chick embryo.
Journal of Morphology,
88:232272, 1951.
[10] Marianne Bronner-Fraser. Methods in Avian Embryology. Academic Press Limited 24-28 Oval Road,
Lodon NM1 7DX, 1996.
[11] Scott F. Gilbert. Developmental of Biology. Sinauer Associates Inc, 2007.
[12] Bradley M. Patten. Early Embryology of the Chick. The Blakiston Company, 1951.
[13] C. Vilhais-Neto, G., M. Maruhashi, T. Smith, K., M. Vasseur-Cognet, S. Peterson, A., L. Workman, J.,
and Olivier Pourqui. Rere controls retinoic acid signalling and somite bilateral symmetry. Mechanisms
of development,
463:953957, 2010.
[14] A. Aulehla and O. Pourqui. Signaling Gradients during Paraxial Mesoderm Development. Cold Spring
Harbor Perspectives in Biology,
2:a000869:114, 2009.
[15] Simn Muoz-Armas Mara Victoria da la Cruz and Luis Muoz-Castellanos. Development os the Chick
Heart.
The Johns Hopkins University Press, 1972.
[16] I. BERUL, C. A Beat Is Born: Embryonic Development of Arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular

Electrophysiology,
17:13601361, 2006.
[17] A. SARRE, P. MAURY, P. KUCERA, L. KAPPENBERGER, and E. RADDATZ. Arrhythmogenesis in

the Developing Heart During Anoxia-Reoxygenation and Hypothermia-Rewarming:An In Vitro Model.
Journal of Cardiovascular Electrophysiology,
17:13501359, 2006.
[18] L. Polo-Parada, X. Zhang, and A. Modgi. Cardiac Cushions Modulate Action Potential Phenotype
During Heart Development. Developmental Dynamics, 238:611623, 2009.
[19] U. Agero, L.G. Mesquita, B.R.A. Neves, R.T Gazzinelli, and O.N. Mesquita. Defocusing Microscopy.
Microscopy Reserch and Technique,
65:159165, 2004.
[20] U. Agero. Microscopia de Desfocalizao Aplicada ao Estudo de Fagocitose por Macrfagos. PhD thesis,
UFMG, 2003.
[21] C. Cui. Dynamics of Cell Movement and Tissue Motion in Gastrulation and Micromass Cell Culture.
PhD thesis, University Graduate School, July 2005.
[22] JN Petitte, G. Liu, and Z. Yang. Avian pluripotent stem cells. Mechanisms of development, 121(9):1159
1168, 2004.
[23] T. Reya, S.J. Morrison, M.F. Clarke, and I.L. Weissman. Stem cells, cancer, and cancer stem cells.
Nature,
414(6859):105111, 2001.
[24] J.Y. Bogue. The heart rate of the developing chick. Journal Experimental of Biology, 9:351, 1932.
[25] JR Cain, UK Abbott, and VL Rogallo. Heart rate of the developing chick embryo. In Proceedings of the
Society for Experimental Biology and Medicine. Society for Experimental Biology and Medicine (New
York, NY),
volume 126, page 507, 1967.

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Desenvolvimento Embrionrio: das Clulas ao Corao.

Ana Paula Alves

Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG

Desenvolvimento Embrionrio: das Clulas ao Corao.

Ana Paula Alves

Orientador: Prof. Ubirajara Agero Batista

rea de Concentrao: Fsica Biologica .

mesenquimais somticas, desenvolvimento embrionrio, MD

somatic mesenchymal cells, Embryonic Development, Defocusing Microscopic

2.1 Introduo Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2 Formao do Embrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Formao e Regresso da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . .

3.1 Campo Eltrico da Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.1 Extraindo Embries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

5.1 Clulas Mesenquimais Extradas dos Somitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

A Programa para auto-correlao temporal.

2.2 Formao da Blastoderme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.4 Regresso da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

5.4 Correlao temporal das regio da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . 45

5.7 Sinal obtido da variao da interface do corao. . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Nesta dissertao apresentaremos os primeiros trabalhos de uma nova linha de pesquisa

relacionada com o movimento da clula. Nossos experimentos conrmaram que as clulas

No Captulo 6 sero apresentados as perspectivas e concluses deste trabalho.

Figura 2.1: Estgios Embrionrios. Retirado de [9].

embrionrio mais citados, pois apresenta um mapeamento completo do desenvolvimento do

Vitelo: reserva de nutrientes do ovo, a gema propriamente dita.

Blastmeros: clulas lhas resultante de sucessivas divises da ciclatura por mitose.

ou blastodisco. No momento que a blastoderme contm de 32 a 64 clulas inicia-se o processo

se o processo da gastrulao. No nal deste processo o germe do embrio estar formado

consiste na migrao das clulas do Epiblasto para o espao entre o Epiblasto e

Figura 2.3: Gastrulao: consiste no deslocamento do nodulo de Hensen da regio ventral

Formao e Regresso da Linha Primitiva

posterior do embrio participam da gastrulao, as clulas no m da poro anterior esto

Figura 2.5: (A)Formao do Epiblasto. (B)Formao do hipoblasto primrio. (C)Formao

Mesoderme se originam a notocorda, msculo rins e sangue. E da Endoderme se originam

A endoderme formada pelas primeiras clulas a migrarem atravs do n de Hensen,

Figura 2.6: Regies da mesoderme incluindo Mesoderme Intermediria e Paraxial com os

e derme. A mesoderme intermediria, forma o sistema urogenital. A corda-mesoderme

Componentes importantes da somitogenese so: periodicidade, epitelizao, especicao

Figura 2.8: Um modelo da Somitognese determinando a segmentao horria

e a frente de onda: so caracterizados pelo FCF (Fator de crescimento de broblasto)

Formao do Corao Durante o Desenvolvimento Embrionrio

Nesta seco descreveremos a formao anatmica dos primeiros estgios do corao de

Estgio 10 [33-38 horas]- 10 somitos. Durante este estgio comeam as primeiras

Estgio 11 [40-45 horas]-13 somitos. Durante este perodo as contraes cardacas

Neste captulo ser apresentado a Microscopia de Desfocalizao, tcnica que comeou a

Microscopia de Desfocalizao pois se comportam como um objeto de fase.

Os objetos de fase so transparentes quando esto no foco, tornando-se visveis quando

Campo Eltrico da Luz

~ r, t) de frequncia, , e dependncia harSupondo um campo eltrico monocromtico E(~

Substituindo a equao do campo eltrico 3.1 na equao de onda .

Espao Real e espao dos vetores de onda

Para obtermos h(~) podemos aplicar a transformada inversa:

Propagao do campo eltrico atravs de um objeto de fase.

~ 0 o campo eltrico incidente, h(~

amplitude do objeto , n1 e n2 so ndices de refrao do meio por onde o campo eltrico se

Considerando o objeto de fase, a fase introduzida dada por:

Assim, a diferena de fase dada por:

onde E0 o campo eltrico incidente.

Propagao do Campo Eltrico atravs do microscpio

que o fator de magnicao do microscpio, e o sinal negativo signica

que a imagem invertida.

E (~0 ) dado por:

Vamos obter o contraste de fase de um objeto desfocalizado.

relacionada com o movimento da clula. Nossos experimentos conrmaram que as clulas

Blastmeros: clulas lhas resultante de sucessivas divises da ciclatura por mitose.

se o processo da gastrulao. No nal deste processo o germe do embrio estar formado

posterior do embrio participam da gastrulao, as clulas no m da poro anterior esto

Componentes importantes da somitogenese so: periodicidade, epitelizao, especicao

e a frente de onda: so caracterizados pelo FCF (Fator de crescimento de broblasto)

que o fator de magnicao do microscpio, e o sinal negativo signica

Phosphate-Buered Saline ) com pH de 7,4.

Preparando PBS (Phosphate-Buered Saline).

Apresentaremos no grco 5.8, o resultado do espectro de potncia pela frequncia

A seguir apresentaremos na gura5.14 um embrio extrado no sexto dia de incubao.