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UNIVERSIDADE DO OESTE PAULISTA Unoeste

CURSO DE FARMCIA

AVALIAO DA PARTICIPAO DO SISTEMA GLUTAMATRGICO NO EFEITO

ANTIDEPRESSIVO DO EXTRATO DE ERVA MATE (Ilex paraguariensis) EM
CAMUNDONGOS

PRESIDENTE PRUDENTE

2015

AVALIAO DA PARTICIPAO DO SISTEMA GLUTAMATRGICO NO EFEITO

ANTIDEPRESSIVO DO EXTRATO DE ERVA MATE (Ilex paraguariensis) EM
CAMUNDONGOS

Projeto de pesquisa apresentado como

exigncia para obteno de bolsa de
pesquisa Universidade do Oeste Paulista
Unoeste, sob orientao do professor
MSc.

PRESIDENTE PRUDENTE

2015

SUMRIO

1. APRESENTAO

A depresso um transtorno grave e debilitante que afeta milhes de

pessoas em todo o mundo. caracterizada por permanente tristeza, anedonia,
culpa, baixa auto-estima, distrbios do sono, falta de concentrao e pensamentos
suicidas. A Organizao Mundial da Sade elegeu a depresso maior como a quarta
causa de incapacidade em 1990 e acredita que em 2020, este transtorno de humor
seja o segundo causador de incapacidades em todo o mundo. Pacientes acometidos
por depresso maior ou transtorno bipolar apresentam uma taxa de suicdio em
torno de 15%, de forma que estes transtornos promovem sofrimento incalculvel,
prejuzos funcionais que limitam a vida social do paciente e acarretam altos custos
financeiros.
A observao de que os sintomas clnicos dos pacientes com depresso so
influenciados com a manipulao farmacolgica do sistema monoaminrgico trouxe
a hiptese de que a depresso resulta de uma deficincia funcional ou quantitativa
das monoaminas, em especial da serotonina e noradrenalina em regies cerebrais.
Esta idia suportou por mais de meio sculo a hiptese monoaminrgica da
depresso, e apoiados nesta teoria os antidepressivos comumente utilizados na
clnica foram desenvolvidos. Porm a hiptese monoaminrgica, por si s no pode
explicar a neuropsicofarmacologia da depresso, nem to pouco o mecanismo de
ao dos antidepressivos clssicos, uma vez que apesar dos antidepressivos
utilizados na clnica aumentam os nveis das monoaminas em minutos ou horas, o
efeito teraputico s observado depois de algumas semanas. Em concordncia,
apenas cerca de 50-60% dos pacientes com depresso atingem a remisso dos
sintomas clnicos com o primeiro antidepressivo clssico utilizado. Estas
inconsistncias

aliadas

ao

fato

da

manipulao

de

outros

sistemas

de

neurotransmissores, como o glutamatrgico, desencadearem efeito antidepressivos

abriram espao para a pesquisa de novas estratgias no tratamento dessa doena.
Medicamentos que afetam o sistema glutamatrgico, podem desencadear um
efeito antidepressivo, tanto em animais, como em humanos. Alm disso, apesar dos
antidepressivos clssicos desencadearem efeito teraputico apenas aps semanas

de uso, baixas doses de ketamina, um modulador do sistema glutamatrgico,

desencadeia efeito antidepressivo rpido e sustentado por uma semana com apenas
uma administrao. Apesar dessas vantagens, pequeno avano no desenvolvimento
de drogas que modulem o sistema glutamatrgico tem sido feito, muito
provavelmente pela grande quantidade de efeitos colaterais desencadeados por
essas substncias o que leva a busca por novas substncias com atividade
antidepressiva.
A erva-mate (Ilex paraguriensis) tem sido extensivamente utilizada como
bebida nos pases da Amrica Latina e principalmente no sul do Brasil. uma planta
com grande quantidade de compostos qumicos identificados e efeitos benficos
relatados. As aes do extrato de erva-mate no Sistema Nervoso Central (SNC) j
foram demonstradas por alguns pesquisadores, e o saber popular aponta para os
benefcios do uso da bebida preparada com as folhas da erva-mate no bem estar
psicolgico.
Desta forma, este projeto tem como objetivo avaliar o efeito antidepressivo do
extrato aquoso de erva-mate em camundongos e a participao do sistema
glutamatrgico neste efeito.

2. JUSTIFICATIVA

A depresso uma doena crnica e recorrente que afeta cerca de 20% da

populao mundial (YAN et al., 2010) acarreta em considervel morbidade
psiquitrica, pode levar ao suicdio, perda de produtividade (EBMEIER et al., 2006) e
maior utilizao de servios de sade (NEMEROFF, 2007). Os antidepressivos so a
classe de frmacos que tem sido amplamente utilizado nas ltimas quatro dcadas
para o tratamento da depresso. Uma variedade de drogas antidepressivas atua por
diferentes mecanismos, incluindo os sistemas serotonrgico, adrenrgico e
dopaminrgico

(WONG

LICINIO,

2001).

Contudo,

os

antidepressivos

convencionais produzem vrios efeitos colaterais e requerem vrias semanas de

tratamento para produzir efeito teraputico (NESTLER et al., 2002). Desta forma,
de interesse o desenvolvimento de terapias antidepressivas alternativas ou de
substncias que possam aumentar a eficcia clnica no tratamento da depresso.
A erva-mate (Ilex paraguariensis) uma planta popular em pases da Amrica
Latina, e foi introduzida a alimentao de regies como o Brasil pelos nativos
guaranis por suas propriedades medicinais e tambm por uma questo cultural
(BRACESCO et al., 2011). Muitas propriedades medicinais dos extratos de ervamate tm sido relatadas, entre elas efeitos em nvel de SNC. Estudos pr-clnicos
demonstraram o efeito desses extratos em nvel de memria e aprendizado
(PREDIGER et al., 2008), e o conhecimento etnofarmacolgico sugere a utilizao
do mate como co-adjuvante no tratamento de transtornos do humor.
Assim, sendo a depresso uma doena de alta incidncia mundial, cuja
terapia disponvel para a remisso dos sintomas neuropsicolgicos pouco
satisfatria e considerando a erva-mate como uma potencial estratgia teraputica
devido aos seus efeitos medicinais relatados ao longo dos anos, este projeto
justificado. Considera-se ainda a necessidade do estudo dos efeitos de uma bebida
largamente utilizada por todo Brasil, contribuindo para o entendimento dos
mecanismos envolvidos nos efeitos benficos dessa bebida. Ainda, uma vez que o

extrato aquoso de erva-mate seja capaz de desencadear efeito antidepressivo em

animais, interessante ressaltar as vantagens da utilizao das plantas medicinais
no tratamento de doenas em geral, no somente pela facilidade ao acesso, como
tambm pelo custo e pela aceitao.

3. OBJETIVOS

3.1

OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito tipo-antidepressivo da administrao aguda de extrato aquoso

de erva-mate (Ilex paraguariensis) em camundongos e a participao do sistema

glutamatrgico.
3.2

OBJETIVOS ESPECFICOS

Avaliar o efeito tipo-antidepressivo da administrao aguda do extrato aquoso

de erva-mate (Ilex paraguariensis) a camundongos submetidos ao TNF e ao
TSC;

Determinar o envolvimento do receptor NMDA no efeito tipo-antidepressivo

decorrente da administrao aguda do extrato aquoso de erva-mate (Ilex
paraguariensis) a camundongos;

Estudar o envolvimento da NOS no efeito tipo-antidepressivo decorrente da

administrao aguda do extrato aquoso de erva-mate (Ilex paraguariensis) a
camundongos;

Investigar o efeito da administrao aguda do extrato aquoso de erva-mate

(Ilex paraguariensis) a camundongos nos nveis corticais e hipocampais de
NO.

4. PRINCPIOS E FUNDAMENTOS

4.1 DEPRESSO
Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS), 450 milhes de indivduos
tem problemas mentais e psicossociais (BORDIN, 2006). A depresso considerada
como problema de sade pblica, econmico e social. As pessoas com depresso
desencadeiam sentimento de inferioridade, contnua alterao do humor e rejeio
social, prejudicando suas relaes pessoais (PETERSON, 2007) . Alguns fatores
esto relacionados ao aparecimento da depresso, entre eles: estresse, relaes
conflituosas, desemprego, dificuldades financeiras, baixa renda e escolaridade alm
de divrcio (MESQUITA, 2005; ZANATTA et al. 2010).
A depresso pode ser caracterizada como um transtorno mental do humor
que ocorre em todas as faixas etrias. Por razes ainda pouco esclarecidas vem se
tornando mais frequente. Estima-se que de 30 a 50% dos pacientes com depresso,
no se recuperam totalmente com a utilizao de medicamentos para este fim
(ROZENTHAL,2004). Segundo WHO (2001,p.9), A depresso grave atualmente a
principal causa de incapacitao em todo mundo, e ocupa o quarto lugar entre as
dez principais causas de doenas, a nvel mundial (BARBOSA, 2011).
O fator gentico-hereditrio est presente nesta doena, que quando no
tratada corretamente, pode perdurar por muito tempo, com srio risco vida,
trabalho, famlia e lazer, podendo acarretar em alto risco de suicdio (LAFER et al.,
2000).
Regies do encfalo como o crtex pr-frontal, crtex cingulado anterior,
complexo amigdalide, giro parahipocampal e hipocampo esto envolvidas no
processamento da emoo e na integrao desta com a cognio e as funes

viscerais (FRANGOU, 2006). A depresso est associada a alteraes morfolgicas

dessas regies, como atrofia, vulnerabilidade seletiva a morte celular de neurnios
regionais, alteraes neuroqumicas, mudanas na sinalizao intracelular e na
expresso gnica (TSANKOVA et al., 2007). A patofisiologia da depresso envolve
fatores genticos e ambientais que contribuem para a vulnerabilidade de um
indivduo ao desenvolvimento da depresso de forma que a etiologia e a
neurobiologia destes transtornos ainda no se encontram totalmente elucidados
(SHALTIEL et al., 2007).
A teoria de monoaminrgica da depresso (HENDLEY e SNIDER,1968) ainda
a mais aceita para explicar a etiologia e a patognese da depresso, atribuindo
esta

psicopatologia

um

prejuzo

na

neurotransmisso

serotonrgica

noradrenrgica e mais recentemente, dopaminrgica (KAPUR & MANN,1992). A

ao de antidepressivos tricclicos (TCAs) e inibidores da monoamina oxidase
(MAOIs), eficazes em aumentar os nveis das monoaminas e o fato de drogas como
a reserpina induzirem depresso, suportaram por mais de meio sculo a hiptese
monoaminrgica da depresso, e apoiados nesta teoria os antidepressivos
comumente utilizados na clnica foram desenvolvidos (ORDWAY et al., 1999).
A primeira substancia antidepressiva foi identificada por acaso, em 1950.
Observou-se uma melhora do humor em pacientes que estavam sendo tratados com
medicamentos para tuberculose. Um derivado deste medicamento, um inibidor da
enzima monoamina oxidase (IMAO) iproniazida - mostrou sua capacidade de
reduzir os sintomas depressivos, formando assim a primeira farmacoterapia efetiva
para este distrbio. Depois os TCAs, inicialmente usado como anti-histamnicos,
foram usados na clnica para tratar transtornos depressivos. Outras classes de
drogas como antidepressivos, betabloqueadores, antipsicticos e estratos de
espcies vegetais, tm sido utilizadas com sucesso em alguns casos. (FERREIRA,
2010).
A descoberta

dos alvos

moleculares para

primeira

gerao

de

medicamentos antidepressivos levou ao desenvolvimento das drogas da segunda e

terceira gerao, tais como os inibidores seletivos da recaptao de serotonina
(ISRS). Todos estes frmacos agem com o mesmo mecanismo farmacolgico,
chamado monoaminrgico, caracterizado pela reverso do dficit que leva ao estado
de depresso. Estes frmacos exercem seu efeito antidepressivo por aumentarem a

disponibilidade de monoaminas na fenda sinptica, por inibirem sua recaptao,

agindo direta e indiretamente nos sistemas transportadores pr-sinpticos, ou por
inibirem a degradao dos mediadores (MANN,1999; PAUWELS, 2000).
A

hiptese

monoaminrgica,

por

si

no

pode

explicar

neuropsicofarmacologia da depresso, nem to pouco o mecanismo de ao dos

antidepressivos clssicos (SANACORA et al., 2012), e algumas inconsistncias
nesta teoria tem sido apontadas. Os antidepressivos utilizados na clnica aumentam
os nveis das monoaminas em minutos ou horas, enquanto o efeito teraputico s
observado depois de algumas semanas (RACAGNI e POPOLI, 2008). Em
concordncia, apenas cerca de 50-60% dos pacientes com depresso atingem a
remisso dos sintomas clnicos com o primeiro antidepressivo clssico utilizado
(TRIVEDI et al., 2006). Ainda, o fato de que nem todas as drogas que aumentam os
nveis de monoaminas so necessariamente efetivas no tratamento da depresso d
consistncia idia da necessidade de outros sistemas neurotransmissores
envolvidos tanto na neurobiologia da depresso, quanto no mecanismo de ao dos
antidepressivos (LANNI et al., 2009). O sistema glutamatrgico, tem sido apontado
como responsvel pelo efeito dos antidepressivos clssicos, uma vez que, apesar
desses medicamentos atuarem atravs do aumento rpido dos nveis das
monoaminas, parece que esta classe de medicamentos converge em ltima
instncia para a regulao da plasticidade sinptica e do processo de informaes
mediados por receptores de glutamato (SANACORA et al., 2008).
4.2 SISTEMA GLUTAMATRGICO
O sistema glutamatrgico envolve uma srie de receptores que so ativados
pelo aminocido glutamato que por sua vez o principal neurotransmissor
excitatrio e sinalizador qumico utilizado no SNC. A exposio a eventos
estressores promove aumento na liberao de glutamato no crebro.
Esse neurotransmissor pode se unir a uma grande variedade de receptores,
os quais so denominados ionotrpicos e metabotrpicos (GASIC e HOLLMAN,
1994). Os receptores ionotrpicos so uma famlia de canais inicos caracterizados
de acordo com seu agonista mais seletivo: N-metil-D-aspartato (NMDA), alfa-amino3-hidrxi-metilisoxazole-propionato

(AMPA)

kainato

(Ka).

Os

receptores

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metabotrpicos acoplam-se a protenas ligantes de nucleotdeos da guanina

(protenas-G) e modulam efetores intracelulares, como a hidrlise de fosfolipdeos
de membrana (Grupo I) e a atividade da adenilato ciclase (Grupos II e III)
(DUVOISIN et al., 1995). Em excesso, a liberao de glutamato leva a
despolarizao da membrana celular, ativao de receptores permitindo assim a
entrada de Ca++ e conseqente ativao de diversas rotas enzimticas que
culminam em morte celular. Alm disso, o influxo massivo de Ca ++ aumenta a
formao de espcies reativas de oxignio (ROS) pela ativao da enzima
dependente de clcio-calmodulina, a xido ntrico sintase (NOS), e a sobrecarga de
clcio mitocondrial, o que contribui para o desequilbrio da homeostase celular
(CAMACHO e MASSIEU, 2006). A NOS ativada produz xido ntrico (NO) a partir da
L-arginina. Uma vez formado, o NO pode ainda interagir com o radical livre
superxido levando a formao de peroxinitrito, um potente oxidante, que pode
causar nitrao e/ou oxidao de protenas, peroxidao de lipdeos e dano direto
ao DNA, levando a morte celular (RADI et al.,1991a; RADI et al., 1991b)
A modulao do sistema glutamatrgico, tem sido relatada como uma
interessante e promissora estratgia no tratamento da depresso (MACHADOVIEIRA, MANJI, ZARATE, 2009). Estudos post mortem demonstraram nveis
aumentados de glutamato no plasma (MAURI et al., 1998), no fluido cerebroespinhal
(FRYE et al., 2006) e no tecido cerebral (FRANCIS et al., 1989) de indivduos com
transtornos do humor.
Estudos pr-clnicos tm demonstrado que medicamentos que afetam o
sistema glutamatrgico, podem desencadear um efeito antidepressivo, tanto em
animais (YILMAZ et al., 2011), como em humanos (LI et al., 2010). Antagonistas nocompetitivos do NMDA como a memantina e a amantadina, j demonstraram efeitos
antidepressivos em estudos prvios com humanos (FERSZT et al., 1999). Alm
disso, a administrao de uma nica dose de ketamina, outro antagonista no
competitivo do NMDA, capaz de desencadear um efeito antidepressivo rpido e
sustentado por pelo menos alguns dias (VALENTINE et al., 2011).
Ainda, muitos trabalhos tm demonstrado que a inibio da NOS pode,
dependendo da dose, promover um efeito tipo-antidepressivo (KASTER et al., 2005;
ZENI et al., 2011). Desta forma, acredita-se que a via de sinalizao NMDA-L-

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arginina-NO desempenha um importante papel na patofisiologia da depresso, como

tambm no mecanismo de ao dos antidepressivos (ZOMKOWSKI et al., 2010).
Apesar de consistentes evidncias apontarem para o envolvimento do
sistema glutamatrgico na patofisiologia da depresso, um pequeno progresso no
desenvolvimento de medicamentos que atuem modulando este sistema foi realizado,
o que pode ser atribudo aos efeitos colaterais decorrentes da sua utilizao. Deste
modo o entendimento de substncias que atuem modulando este sistema
apresentam-se como uma promessa substancial no tratamento de transtornos do
humor.
4.3 ERVA MATE (Ilex paraguariensis)
A erva mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil), pertence famlia botnica
Aquifoliacea, uma rvore nativa do Sul da Amrica do Sul, cultivada no Paraguai,
Argentina, Uruguai e no Sul do Brasil, onde tem uma grande participao econmica
e cultural. Seu caule um tronco de cor acinzentada e pode medir de 20 a 25 cm de
dimetro nas plantas jovens. Sua altura dependendo da idade e do clima, pode
alcanar de 15 a 18 metros de altura (OLIVEIRA, OLIVEIRA, SANTOS,2005).
As folhas constituem a parte mais importante da planta. So altas, oblongas
com nervuras salientes e suas bordas so providas de pequenos dentes visveis
principalmente da metade do limbo para a extremidade (OLIVEIRA, OLIVEIRA,
SANTOS,2005). Quando sapecadas e trituradas, as folhas so utilizadas para a
preparao de bebidas alimentcias e estimulantes, como o chimarro, o ch e o
terer, tpicas de cada regio. Tambm vem sendo consumida no mercado europeu
como matria-prima para obteno de produtos fitoterpicos (MARIOT et al., 2004).
A produo e comercializao do produto no Brasil regulamentada pelo
Ministrio da Sade, Diviso de Alimentos (Portaria 464|97) e os critrios de
qualidade encontram- se fixados nas portarias 233|98 e 234|98 da Secretaria de
Vigilncia Sanitria (MARIOT et al., 2004).
4.3.1 Propriedades e ao medicinal

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A erva mate apresenta constituio qumica rica em aminocidos, alcaloides

(metilxantinas), flavonoides, vitaminas do complexo A, B, C e E, taninos, cido
clorognico e seus derivados, alm de numerosas saponinas triterpnicas derivadas
do cido urslico (BASTOS et al., 2007; BRACESCOA et al., 2011). Os nveis de
polifenis dos extratos de Ilex paraguariensis so maiores do que os encontrados no
ch verde e comparveis com os nveis encontrados nos vinhos tintos (GUGLIUCCI
et al., 2009).
A pesquisa acerca das propriedades medicinais da erva-mate teve incio a
muito tempo atrs, porm nos ltimos 15 anos, numerosos estudos focaram nos
efeitos benficos dessa planta (HECK e MEIJA, 2007). Efeitos antioxidantes
(BRAVO et al., 2007), antiinflamatrios (LANZETTI et al., 2008), vasodilatadores,
hipocolesterolmico (MATSUMOTO et al., 2009), anti-mutagnico (MIRANDA et al.,
2008) e hipoglicemiante tem sido apontados. Alm disso, o efeito das saponinas do
mate como inibidor da NOS j foi relatado (PUANGPRAPHANDTAND e MEJIA,
2009).
Recentemente, tem-se dedicado muita ateno ao estudo do efeito das
plantas medicinais no tratamento de distrbios depressivos. Em particular, o extrato
de Hypericum perforatum conhecido por suas propriedades antidepressivas e
usado na terapia da depresso (SHIRAI et al., 2005). Extratos do Hypericum
perforatum tm sido usados na ltima dcada como antidepressivos na Alemanha e
esto hoje dentre os antidepressivos mais utilizados naquele pas. Em 1997, com
mais de 3,7 milhes de prescries, o Hypericum foi responsvel por 25% das
prescries de antidepressivos na Alemanha (LAAKMANN et al., 1998).
Recentemente,

inmeros

outros

estudos

demonstram

efeito

tipo-

antidepressivo de diversas plantas medicinais em modelos animais preditivos de

atividade antidepressiva. J foi demonstrado que espcies como a Siphocampylus
verticillatus (RODRIGUES et al, 2002), Cissampelos sympodialis (MENDONANETO et al., 2008), Rosmarinus officinalis (MACHADO et al., 2009), Tabebuia
avellanedae (FREITAS, A. E., 2010), Radix tenuifolia Willd (LIU et al., 2010) e
Crocus sativus (WANG et al., 2010) obtiveram resultados significativos.
O mate apresenta efeito fitoterpico e estimulante, possui propriedades sobre
o Sistema Nervoso Central (SNC). indicado no tratamento de cefalia, depresso
nervosa e reduz a fadiga (NEWAL, 2002). Alm disso, o efeito do extrato aquoso de

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erva-mate na melhora da memria de roedores j foi demonstrada (COLPO et al.,

2007).
A administrao aguda do extrato hidroalcoolico de erva-mate foi capaz de
produzir um efeito anti-Parkinsoniano em diferentes modelos animais (MILIOLI et
al., 2007), alm de reverter a catalepsia induzida pela injeo subcutnea de
reserpina em camundongos e melhorar o aprendizado e a memria (PREDIGER et
al., 2008).

5 METODOLOGIA

5.1 MATERIAIS
5.1.1. Reagentes

MK-801 ((+) - 5 metil 10, 11 dihidro - 5H - dibenzo[a,d] ciclohepten - 5, 10

-imine maleato); Ketamina; Fluoxetina, 7-nitroindazol; fosfato de sdio
dibsico (NaH2PO4); cloreto de potssio (KCl), cido tricloroactico;
bicarbonato de potssio; Reagente de Griess e nitrato de sdio (NaNO 2).

5.1.2. Equipamentos

Balana analtica (Bel Engineerring );

Leitora de Elisa ( Labsystems Multiskan MS );

Centrfuga de tubos do tipo eppendorff;

Espectrofotmetro (Digimed DME 21)

5.2 OBTENO E PREPARO DO EXTRATO DE ERVA MATE (Ilex paraguariensis)

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A erva-mate (Ilex paraguariensis) sero compradas,e o preparo de um extrato

aquoso de erva-mate (mate). O extrato ser obtido no Laboratrio de farmacognosia
da Universidade do Oeste Paulista Unoeste, seguindo protocolo de extrao
previamente proposto por Andrade e colaboradores (2012).
5.3 ANIMAIS
Sero utilizados 30 camundongos Swiss machos adultos (60 a 90 dias) por
experimento, provenientes do Biotrio da Unoeste, em ciclo claro/escuro de 12
horas, em temperatura entre 22 e 25C, com gua e rao ad libitum. Os
procedimentos adotados com os animais seguiro os Princpios ticos, de acordo
com resoluo numero 1.000 de 11 maio de 2012 do Conselho Federal de Medicina
Veterinria. Os nossos protocolos para experimentos com animais sero projetados
de maneira que o animal tenha o mnimo de sofrimento possvel (decapitao por
guilhotina) por motivo que a eutansia vem alterar o resultado da pesquisa, pois
para avaliao dos nveis hipocampais e corticais de NO os animais.
5.3.1 Administrao do extrato de erva mate aos animais
Os animais recebero por via oral, utilizando a metodologia de gavagem, uma
nica administrao de salina (animais controles) ou extrato de erva mate (animais
tratados) em diferentes concentraes (0,1 100 mg/mL) e aps um perodo de 60
minutos sero submetidos a avaliao comportamental ou bioqumica. Um grupo de
animais ser tratado com fluoxetina (antidepressivo clssico usado na clnica como
inibidor seletivo da recaptao de serotonina) na dose ativa (10mg/kg) a fim de
avaliar a validade dos testes preditivos (controle positivo). O tratamento ser
realizado pela administrao de 10L/g de peso do animal, tanto para as solues
de atorvastatina como para a soluo de salina (LUDKA et al., 2012).
5.4 AVALIAO COMPORTAMENTAL
O efeito da administrao do extrato de erva mate em camundongos ser
avaliado atravs de dois testes comportamentais: Teste do Nado Forado (TNF) e

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Teste de Suspenso pela Cauda (TSC). Estes testes apresentam validade preditiva
e so utilizados no screening de drogas com potencial efeito antidepressivo. Ambos
os testes baseiam-se na diminuio do tempo de imobilidade de um animal que
colocado em uma situao inescapvel. Os antidepressivos clssicos diminuem o
tempo de imobilidade nestes dois testes.
5.4.1 Teste de suspenso da cauda (TSC)
O tempo total de durao da imobilidade ser medida de acordo com o
mtodo Steru et al. (1985). Os camundongos, acstica e visualmente isolados sero
suspensos 50 cm acima do cho por fita adesiva e a imobilidade ser registrada
durante 6 minutos, conforme descrito anteriormente (MANTOVANI et al., 2003). Os
antidepressivos reduzem o tempo de imobilidade neste teste (STERU et al., 1985).
5.4.2 Teste do nado forado (TNF)
O teste ser realizado durante um perodo de 6 minutos em um cilindro
plstico (altura 24 cm, dimetro 10 cm) contendo 19 cm de gua a 25C. O tempo de
imobilidade ser cronometrado, conforme descrito anteriormente (MANTOVANI et
al., 2003; ZOMKOWSKI et al., 2004). Os antidepressivos reduzem o tempo de
imobilidade neste teste (PORSOLT et al., 1977).
5.4.3 Avaliao da atividade locomotora pelo teste do campo aberto (TCA)
A fim de excluir a possibilidade de que um eventual efeito semelhante a
antidepressivo, ou seja, uma reduo da imobilidade nos TNF e TSC seja devido a
um aumento na atividade locomotora causada pela administrao do extrato de
erva-mate, os camundongos sero submetidos a uma sesso no TCA, como descrito
por Rodrigues et al. (1996) 60 minutos aps a administrao do extrato. O teste ser
realizado em uma caixa de madeira medindo 40 x 60 x 50 cm altura, com o cho
dividido em 12 quadrados iguais. O nmero de quadrados cruzados com as quatro
patas (cruzamentos) ser registrado em uma sesso de 6 minutos.

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5.5 AVALIAO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA GLUTAMATRGICO NO

EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DO EXTRATO DE ERVA-MATE IN VIVO
Para avaliao do envolvimento do sistema glutamatrgico no efeito tipoantidepressivo do extrato de erva-mate, ser utilizado o teste preditivo, que
apresenta maior sensibilidade aos efeitos desencadeados pelo extrato de erva-mate
em camundongos. Desta forma, a anlise da participao deste sistema ser
realizada utilizando o TSC ou o TNF, seguido do TCA.
5.5.1 Avaliao da participao do receptor NMDA
Para avaliar a participao do receptor NMDA no efeito tipo-antidepressivo da
atorvastatina em camundongos, os animais sero tratados com uma dose sub
efetiva do extrato de erva-mate com uma dose sub efetiva de MK-801 (0,001 mg/kg,
i.p, um antagonista NMDA) (ZOMKOWSKI et al., 2010; ZENI et al., 2011, LUDKA,
2012). O extrato de erva-mate ou salina sero administradas 30 minutos antes do
MK-801. Passados 30 minutos ps-administrao do MK-801 os animais sero
submetidos ao TSC ou TNF, seguidos do TCA.
Para complementar este resultado, os animais sero tratados com uma dose
sub efetiva do extrato de erva-mate, em combinao com uma dose sub efetiva de
ketamina (0,1 mg/kg, intraperitoneal, um antagonista de receptor NMDA, que
apresenta efeito antidepressivo) (30 minutos aps a administrao do extrato)
(LUDKA et al., 2012). Aps um perodo total de 60 minutos os animais sero
submetidos ao TSC ou ao TNF seguido do TCA.
5.5.2 Avaliao da participao da NOS
O efeito da administrao combinada de doses subativas de 7-nitroindazol (50
mg/kg, i.p., inibidor da NOS) ou azul de metileno (20 mg/kg, i.p., um inibidor da NOS
e da GCs) (ZOMKOWSKI et al., 2010; ZENI et al., 2011; LUDKA., 2012) com uma
dose sub efetiva do extrato de erva mate ser avaliado. Extrato de erva-mate ou
salina sero administradas 30 minutos antes do 7-nitroindazol e do azul de metileno.

17

Aps 30 minutos da administrao de 7- nitroindazol ou azul de metileno os animais

sero submetidos ao TSC ou ao TNF seguidos do TCA.
5.6 AVALIAO BIOQUMICA DOS NVEIS CORTICAIS E HIPOCAMPAIS DE NO
Para avaliao dos nveis hipocampais e corticais de NO os animais sero
tratados com salina ou com a dose ativa do extrato de erva-mate (a dose que
apresentar melhor efeito antidepressivo no TSC ou TNF) e decorridos 60 minutos
sero mortos por decapitao, tero seu hipocampo e crtex retirados e submetidos
a anlise da quantidade de NO a ser mensurada pelo mtodo de Griess. Um pool de
3 hipocampos ou 2 crtex sero misturados com cido tricloroactico a 25% e
centrifugados a 1800G por 10 minutos. O sobrenadante ser imediatamente
neutralizado com bicarbonato de potssio 2M. O nitrato ser reduzido a nitrito pela
nitrato redutase. O total de nitrito ser mensurado por mtodo colorimtrico a
540nm, baseado na reao de Griess. Uma curva padro ser construda utilizando
nitrato de sdio a fim de comparao.

5.7 ANLISE ESTATSTICA

A anlise estatstica ser realizada atravs da anlise de varincia de uma ou
duas vias (ANOVA), seguida do teste de Tukey. Os dados sero expressos como a
mdia e desvio padro. Para os experimentos comportamentais um nmero de 8 a
10 animais por grupo ser utilizado. J para as anlises bioqumicas, os
experimentos sero realizados em triplicata com nmero mnimo de 5 experimentos.
Sero considerados significativos valores com p < 0,05.

18

6 . RECURSOS

6.1 RECURSOS FSICOS

O preparo do extrato aquoso de Ilex paraguariensis ser realizado no
Laboratrio de Farmacognosia da Universidade do Oeste Paulista Unoeste,
Presidente Prudente. Todos os experimentos comportamentais e bioqumicos sero
realizados no laboratrio de pesquisa da mesma instituio.
6.2 RECURSOS HUMANOS
Este trabalho ser realizado por:

Um grupo de pesquisa do curso de Farmcia:

19

Um professor orientador:

6.3 RECURSOS MATERIAIS

Pipetas volumtricas de vidro e pipetas automticas;

Tubos de ensaio;

Estante para tubos de ensaio;

Placas de Petri;

Basto de vidro;

Balo volumtrico;

Becker;

Balana analtica (Bel Engineerring);

Leitora de Elisa Labsystems Multiskan MS

Material cirrgico;

Reagentes : MK-801 ((+) - 5 metil 10, 11 dihidro - 5H - dibenzo[a,d]

ciclohepten - 5, 10 -imine maleato); Ketamina; Fluoxetina, 7-nitroindazol;
fosfato de sdio dibsico (NaH2PO4); cloreto de potssio (KCl), cido
tricloroactico; bicarbonato de potssio; Reagente de Griess e nitrato de
sdio (NaNO2).

6.4 RECURSOS FINANCEIROS

Considerando que todos os equipamentos e reagentes que sero utilizados j
fazem parte dos recursos permanentes da Unoeste, e encontram-se disponveis
para utilizao, estima-se que no ser necessrio investimento financeiro para
execuo deste projeto.

20

7 CRONOGRAMA

Atividades
Obteno e
preparo do
extrato de
erva-mate
Determinao
de dose ativa
e subativa no
TSC e TNF

2015
Jul/ago

Set/out

X
X

2016
Nov/dez

Jan/fev

Mar/abr/mai

Jun/jul

Anlise
Estatstica

Elaborao de
relatrios
mensais

Anlise
Avaliao do mecanismo de ao Avaliao do efeito antidepressivo do extrato de erva-mate
Bioqumica

21

Avaliao da
participao
do NMDAR
Avaliao da
participao
da NOS

X
X
X

X
X

Anlise dos
nveis de NO/
hipocampo e
crtex

X
X
X

Preparao de
artigo cientfico
com resultados

22

X
X

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