Universidade Federal de Pernambuco

Departamento de Engenharia Qumica

Laboratrio de Microbiologia Industrial

Bioqumica Industrial

Professor: Jenyffer Medeiros Campos

Rodrigo Oliveira Simes

Recife, 2015

SUMRIO

Prtica 1: Ponto isoeltrico da casena.

Prtica 2: Anlise de protenas: Caractersticas e pesquisa de aminocidos em
ovoalbumina.
Prtica 3: Metabolismo
Prtica 4: Caracterizao de lipdeos.
Prtica 5: ndice de saponificao.

PRTICA 1: DETERMINAO DO PONTO ISOELTRICO DA

CASENA
Introduo
A carga eltrica total de uma protena o somatrio das cargas dos aminocidos
que compem a molcula, e depende do valor de pKa dos resduos de aminocidos e do
pH do meio. O ponto isoeltrico (pI) da protena o pH onde o nmero de cargas
positivas equivale ao nmero de cargas negativas. Nesse pH a molcula da protena
eletricamente neutra e ela no migra para nenhum dos plos, quando submetida a um
campo eltrico. O pI das protenas no pode ser calculado a partir dos valores de pKa
dos aminocidos componentes isolados, pois os valores variam de acordo com a
localizao dos aminocidos na protena.
Os valores do pI das protenas so caractersticos e refletem a proporo de
aminocidos carregados positiva e negativamente na sua molcula. A pepsina uma das
enzimas da digesto, apresenta um valor de pI igual a 1 e a relao entre os aminocidos
cidos e bsicos de 15:1, refletido no seu valor de pI.
Em valores do pI abaixo do pI, a protena apresenta carga lquida positiva,
devido protonao dos grupos bsicos e cidos e acima do pI apresenta carga lquida
negativa.
A variao da carga lquida da protena interfere com sua solubilidade. No pI a
solubilidade menor do que em outros valores de pH, onde as molculas tem a mesma
carga e se repelem eletrostaticamente, impedindo a precipitao.
Objetivo
Determinar experimentalmente o valor do ponto isoeltrico da casena do leite.
Procedimento
A 50 mL de leite desnatado adicione cido actico 1,0 mol/L at a precipitao.
A seguir adicione mais 5,0 mL do cido actico 1,0 mol/L. centrifugue a 3000 rpm por
5 minutos. Despreze o sobrenadante. Ressuspenda o precipitado com gua destilada e
centrifuga novamente. Despreze o sobrenadante.
Em um Bquer, adicione 25 mL de gua destilada com 5 mL de NaOH 1 mol/L
e aquea em banho-maria a 40oC. Adicione ento o precipitado de casena at a
dissoluo completa. Transfira para um balo volumtrico (ou proveta) de 50 mL,
adicione 5 mL de cido actico 1 mol/L e complete com gua destilada. Se houver
turvao filtre.
Prepare nove tubos de ensaio e numere de 1 a 9. Ao tubo 1 adicione 3,2 mL de
cido actico 1 mol/L e 6,8 mL de gua destilada. Misture bem. A seguir adicione
exatamente 8 mL de gua destilada nos outros 8 tubos de ensaio. Do tubo 1 retire 2,0
mL e transfira para o tubo 2. Agite e retire 2,0 mL do tubo 2 e transfira para o tubo 3 e
assim sucessivamente at o ltimo tubo. Do tubo 9 retire 2 mL e despreze.
A cada um dos tubos adicione 1,0 mL de casena agite e observe o resultado e
imediatamente aps 15 minutos. Faa a leitura dos valores de pH usando um
potencimetro. Determine o ponto isoeltrico da casena.

Tubos
pH

PRTICA 2: ANLISE DE PROTENAS: CARACTERSTICAS E

PESQUISA DE AMINOCIDOS EM OVOALBUMINA
Introduo
Protenas so macromolculas naturais com uma ou mais cadeias
polipepetdicas, isto , so polmeros de -aminocidos de configurao L. Constituem
50% ou mais de matria seca celular, sendo fundamentais tanto ao aspecto estrutural
como funcional. As protenas podem ser separadas uma das outras e de outros tipos de
molculas atravs de mtodos, que se baseiam em certas propriedades caractersticas,
tais como solubilidade, massa molar, carga eltrica e afinidade por certos compostos. As
protenas podem ser tambm caracterizadas por reaes de precipitao e colorao. Em
condies fisiolgicas, todas as molculas de uma mesma protena apresentam a mesma
conformao, que denominada nativa.
Ao preceder-se o isolamento e purificao de uma protena, so introduzidas
alteraes fsicas e qumicas no seu meio ambiente que podem afetar sua estrutura
espacial e ocasionar a perda da funo biolgica. A protena dita ento desnaturada.
Vrios fatores podem conduzir, desnaturao, entre eles, o aquecimento, valores de
pH muitos baixos ou altos, solventes orgnicos polares e compostos com grande
capacidade para formar pontes de hidrognio.
Objetivo
Evidenciar as diversas reaes, que permitem identificar alguns grupos R dos
resduos dos aminocidos componentes das protenas, assim como reaes de
identificao de protenas com reativo especfico para caracterizao das mesmas.
Destacar a desnaturao protica por diversos tipos de situaes desnaturantes.
Procedimento
1. Desnaturao da protena
Amostra da clara de ovo: separe a clara de um ovo a adicione gua destilada na
proporo de 3/1.
- Ao do calor: Adicionar 3,0 mL da soluo da clara de ovo em quatro tubos de
ensaio. Aquecer direto no bico de Bunsen por alguns minutos. Tente solubilizar o
precipitado em solventes comuns: gua, lcool etlico, acetona (em torno de 2,0mL
cada). Conclua.
- Ao de cido orgnico: Adicionar 3,0 mL da soluo da clara de ovo em tubo de
ensaio e adicionar, gota a gota, cido clordrico 10% ou cido actico 10%.
- Ao de solventes orgnicos: Prepare 2 tubos de ensaio com 1,0 mL da soluo da
clara de ovo, a cada tubo e adicione os seguintes solventes:
Tubo 1: 1,0 mL de lcool etlico
Tubo 2: 1,0 mL de acetona
Agite os tubos vigorosamente. Observe e conclua.

2. Solubilidade a diferentes pHs

Colocar 2 mL da soluo da clara de ovo em cada tubo de ensaio, adicionar 2
mL da soluo a pH 2,0 para o tubo 1; 2 mL da soluo a pH 4,0 para o tubo 2; 2 mL
da soluo a pH 7,0 para o tubo 3; 2 mL da soluo a pH 10,0 para o tubo 4.
3. Reao Xantoproteica: Pesquisa de tirosina e triptfano
Adicionar 3 mL da soluo de clara de ovo em um tubo de ensaio, adicionar 1
mL da soluo de cido ntrico (HNO3) 20% ou concentrado. Aquecer em bico de
Bunsen por alguns segundos. Observe a formao de um precipitado amarelo.
Acrescente 0,5 mL de hidrxido de amnio (NH4OH) 2M ou hidrxido de sdio
(NaOH) 2M e observe a formao de colorao laranja.
4. Pesquisa do triptfano
Em um tubo de ensaio, coloque 2,0 mL de cido actico glacial e 2 mL de
soluo de clara de ovo. Agite, adicione 5,0 mL de cido sulfrico (H2SO4) concentrado
(CUIDADO), escorrendo pelas paredes e agite levemente ao adicionar o cido. O
aparecimento de cor violeta na interface dos lquidos indica a presena de triptfano.
5. Reao do biureto das protenas
Colocar 3,0 mL da soluo de clara de ovo em um tubo de ensaio e adicione 5
gotas da soluo de sulfato cprico 5%, surge um precipitado. Adicione uma soluo de
NaOH 10%, gota a gota, at dissoluo deste precipitado. O aparecimento da colorao
violeta indica a formao do complexo biureto-cobre.
Pesquisar, para os aminocidos, as reaes envolvidas nas anlises acima.

PRTICA 3: METABOLISMO
Objetivo:
- Fatores que influenciam o metabolismo celular.
- Observar o crescimento celular da levedura Saccharomyces cervisiae em diferentes
condies ambientais tais como: fontes de carbono, sais, temperatura e pH.
Material:
- Micro-organismo: Saccharomyces cervisiae.
- Meio de cultura bsico (g/l):
Glicose -----------------------100
Extrato de levedura ---------2
Uria-----------------------------1
KH2PO4 -------------------------1
MgSO4.7H2O ------------------0,5
H2O ----------------------------- 1L
Observao: todos os inculos devem ser feitos assepticamente, utilizando pipetas e
tubos de ensaio estreis, um tubo para cada anlise.
Procedimento:
1-Efeito da temperatura
Inocular 0,1ml da suspenso de levedura em 04 tubos de ensaio contendo o meio bsico
e encubar nas temperaturas a seguir: 5C, 30C, 45C e 60C por 48h.
Tubo
1
2
4

Temperatura
C
4
30
60

Houve
crescimento?

Concluso

2-Efeito do pH
Inocular 0,1ml do microrganismo em tubos de ensaio contendo meio adequado a
diferentes pHs (2,0; 4,0; 8,0; 10,0) e encubar a 30C por 48h
Tubo

pH

1
2
3
4

2,0
4,0
7,0
10,0

Houve
crescimento?

Concluso

3-Efeito da fonte de carbono

Inocular 0,1ml do microrganismo em tubos de ensaio contendo meios adequados (**),
todos os nutrientes so iguais com exceo a fonte de carbono. Encubar a 30C por 48h
de acordo com a tabela a seguir:
Tubo

Fonte de carbono

1
2
3
4
5
6

Glicose
Celulose 1%(P/P)
Sacarose
Amido
Etanol (20%V/V)
Glicerol

Houve
crescimento?

Concluso

3-Efeito da concentrao de sais

Inocular 0,1ml do microrganismo em tubos de ensaio contendo meios adequados (**),
todos os nutrientes so iguais com exceo concentrao de sal (NaCl). Encubar a
30C por 48h de acordo com a tabela a seguir:
Tubo
Fonte de
Houve
Concluso
carbono
crescimento?
1
0,0% NaCl
2
1% NaCl
3
5% NaCl
4
8% NaCl
5
10% NaCl
Pergunta-se:
1. Voc espera que a levedura cresa em anaerobiose, aerobiose ou facultativa?
2. Quais as funes dos nutrientes de um meio de cultura?
3. Escolha um meio para autotrficos e outro para heterotrficos. Explique-os
4. Qual a funo especifica dos sais no crescimento celular?
5. Descreva etapa por etapa a via metablica envolvida
6. Quais os caminhos para o piruvato em aerobiose e anaerobiose? (use aqueles
dados em sala)
7. D 05 exemplos do uso industrial da via glicoltica
Descreva a lanadeira de eltrons em todas as suas etapas e onde ocorre na clula?

PRTICA 4: CARACTERIZAO DE LIPDIOS

Introduo
Lipdios podem ser caracterizados atravs de suas propriedades fsico-qumicas.
Em geral so solveis em gua e solveis em solventes apolares ou de baixa polaridade.
Os triacilgliceris, que constituem o principal grupo de lipdios, podem ser analisados
por hidrlise seguida de separao e caracterizao dos constituintes. Os triacilgliceris
podem ser hidrolisados por cidos minerais concentrados e por enzimas especficas
(lipases), liberando glicerol e cidos graxos. Na presena de bases sofrem hidrlise
alcalina (reao de saponificao), liberando glicerol e sais de cidos graxos (sabes),
como mostrado na Figura 2.

Figura 2 Hidrlise alcalina de um triacilglicerol.

Objetivos
Caracterizar as propriedades fsico-qumicas de triacilgliceris (estres de cidos
graxos); as reaes de hidrlise cida e alcalina (saponificao); o poder de sabes
solveis.
Procedimento
1. Solubilidade
Numere cinco tubos de ensaio e coloque 2,0 mL dos seguintes solventes: gua,
etanol, ter etlico, clorofrmio e acetona. Em seguida adicione 1,0 mL de leo vegetal a
cada tubo, agite-os. Verifique a solubilidades em cada tubo, agite-os. Verifique a
solubilidade em cada tubo e explique-as em termos fsico-qumicos.
2. Reao de saponificao (preparo de sabo)
Prepare a soluo alcolica de hidrxido de potssio a 20%, misturando 10,0 mL
da soluo aquosa de KOH a 40% e 10,0 mL de lcool etlico (soluo de potassa
alcolica) em um Erlenmeyer de 125 mL. Em seguida acrescente 5,0 mL de leo
vegetal e aquea o sistema em banho-maria fervente. Quando iniciar a fervura, faa
sucessivas retiradas de uma ou duas gotas do sistema, que devero ser acrescentadas a

tubos de ensaio contendo 2,0 mL de gua destilada, agite. Observe se h ou no a

formao de espuma. Explique e conclua.
Obs.: Reserve o contedo do Erlenmeyer para testes posteriores.
3. Separao de cidos graxos
Transfira 4,0 mL do contedo do Erlenmeyer (contendo sabo) para um tubo de
ensaio, acrescente um indicador de pH (2 gotas de fenolftalena). Em seguida coloque
gota a gota, sempre com agitao, HCl concentrado at a viragem do indicador (rseo
para incolor). Verifique a separao da mistura em duas fases.
Obs.: Reserve a soluo para o teste posterior (item 5).
4. Separao de sabo por salificao
Em um tubo de ensaio coloque 2,0 mL da soluo de sabo (item 2), adicione
10,0 mL de soluo saturada de cloreto de sdio (NaCl). Observe a separao do sabo.
Mostre atravs de reao o que ocorreu.
5. Ressaponificao
Transfira 4 gotas da soluo formada no experimento do item 3 para um tubo de
ensaio contendo 5,0 mL de gua destilada quente. Adicione gota a gota da soluo de
NaOH 1,0 mol/L at a solubilizao da parte oleosa. Agite o tubo e verifique a
formao da espuma. Explique a reao qumica ocorrida, o produto que se forma e o
mecanismo da reao.
Obs.: Reserve a soluo para o teste posterior (item 6).
6. Formao de sabo insolveis
Na presena de ons divalentes, como Ca2+ ou Mg2+, os sabes tendem a
precipitar formando sabes insolveis sem poder detergente (Figura 3).

Figura 3 Formao de um sabo insolvel.

Transfira 1,0 mL do contedo do tubo de ensaio da experincia anterior (item 5)

para outro tubo de ensaio. Adicione 1,0 mL de gua destilada e 4 gotas de CaCl 2 a 1%.
Observe e justifique os resultados.

PRTICA 5: NDICE DE SAPONIFICAO

Introduo
O ndice de saponificao o nmero de mg de hidrxido de potssio (KOH)
necessrio para saponificar 1 grama de gordura ou leo. A sua determinao tem
importncia devido relao entre o ndice de saponificao e o comprimento da cadeia
dos resduos de cidos graxos. Trs molculas de KOH so necessrias para neutralizar
3 cidos graxos liberados pela hidrlise dos triacilgliceris, no importando o tamanho
da cadeia dos cidos graxos. O ndice de saponificao correspondente a uma dada
massa de lipdios varia inversamente com a massa molar dos resduos de cidos graxos.
Os lipdios possuem duas fraes a saponificvel e a insaponificvel. A frao
insaponificvel constituda pelas vitaminas lipossolveis, pr-vitaminas, esteroides e
outros compostos.
Objetivos
Determinao do ndice de saponificao de leos vegetais comerciais.
Procedimento
O ndice de saponificao expresso em mg de KOH necessrio para neutralizar
os cidos graxos de 1g de gordura ou leo.
Em um Erlenmeyer de 250 mL rigorosamente limpo e seco pesar cerca de 1
grama de lipdio. Em seguida adicionar 25 mL de KOH alcolica. Levar o sistema ao
banho-maria fervente por 30 minutos. Retirar do banho e titular ainda quente com HCl
1,5 mol.L-1 usando 2 gotas de fenolftalena como indicador.
Realizar um prova em branco usando 25 mL de KOH alcolica aquecido (cerca
de 5 minutos) e titular com HCl 0,5 mol.L-1, usando a fenolftalena como indicador.
Clculo
IS = (VB VA) x 28,05 / m
VB = volume do HCl gasto na titulao do branco em mL
VA = volume do HCl gasto na titulao da amostra em mL
m = massa da amostra em grama
Obs.: Como o ndice de saponificao expresso em mg de KOH, a frmula j contm
as transformaes do volume e da massa.
Produto
leo de soja
leo de milho
leo de girassol
leo de amendoim
leo de arroz
leo de algodo
Azeite de oliva
Azeite de dend
Gordura de coco
Gordura de leite

ndice de saponificao
189-195
187-193
188-194
188-195
181-189
189-198
186-196
195-205
250-264
219-234