PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE FARMCIA

RICARDO VIEIRA REICHELT

ESTUDOS DE DEGRADAO FORADA: CONSIDERAES ANALTICAS DA

VALIDAO DE METODOLOGIA NA ANLISE DE MEDICAMENTOS

Porto Alegre
2014

RICARDO VIEIRA REICHELT

ESTUDOS DE DEGRADAO FORADA: CONSIDERAES ANALTICAS DA

VALIDAO DE METODOLOGIA NA ANLISE DE MEDICAMENTOS

Trabalho de concluso de curso apresentado

como requisito para obteno do grau de
Bacharel em Farmcia, pela Pontifcia
Universidade Catlica do Rio Grande do Sul.

Orientador: Prof. Dr. Pablo Machado

Porto Alegre
2014

De um certo ponto adiante no h mais retorno. Esse o ponto que deve ser
alcanado.
Franz Kafka

AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer, primeiramente, aos meus pais Maria Eugnia e
Marco ntonio por terem me dado o direito vida. A nica forma que eu tenho de
demonstrar minha gratido sempre dando meu melhor em tudo que fao. A Anal
Oliveira dos Santos, me do meu filho, Tho, os quais amo incondicionalmente. S
posso agradecer por teres me tirado do fundo de um poo escuro e trazido de volta,
quando nada mais parecia fazer sentido. A minha v Lourdes por me dar conforto e
acolhimento quando eu sa de casa sem rumo. Ao Sr. Andr Palcio por me ensinar
o significado de responsabilidade e liberdade.
A todos os meus amigos que hoje, mesmo longe, me incentivaram a
continuar em frente. Aos meus irmos de sempre, Victria, Guilherme e Gustavo.
Aos professores e funcionrios do LAIF que me acolheram de uma forma paternal
dando-me uma oportunidade nica de conhecimento.
E a Deus, a quem me refugiei nos momentos mais difceis.

RESUMO
Estudos de degradao forada so mtodos complementares delineados para
produzir um mtodo indicador de estabilidade. Os insumos farmacuticos ativos e os
produtos acabados so forados em condies mais extremas que os testes de
estabilidade de longa durao. Em dezembro de 2013, a ANVISA regulamentou a
RDC 58/2013 que ir tornar obrigatrio os estudos de degradao forada. No
entanto a legislao no especifica as condies a serem empregadas. Os guias
disponveis para a montagem das estratgias dos estudos so vagos, e no
oferecem um padro de condies analticas. Este guia tem como objetivo auxiliar
na escolha das condies de degradao desde os estudos preliminares at a
interpretao dos resultados encontrados.

Palavras-chave: degradao forada, ANVISA, HPLC

ABSTRACT

Keywords:.forced degradation, ANVISA, HPLC

Forced degradation studies are complementary methods designed to produce a
stability indicator method. The active pharmaceutical ingredients and drug products
are forced into the most extreme conditions than the long term stability test. In
December 2013, with the publication of RDC 58/2013, in two years, ANVISA will
becomes mandatory forced degradation studies. However the legislation does not
specify the conditions to be employed. The guides available for conducting the
strategies of the studies are vague and do not provide a standard of analytical
conditions. This guide aims to assist since choosing the conditions of degradation
studies until the interpretation of results.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Publicaes sobre degradao forada entre 2008 e 2012......................13
Figura 2 Modelo sugerido para estudos de degradao forada por
hidrlisecida/bsica..................................................................................................15
Figura 3 Sequncia da reao em cadeia mediada por radicais livres..................16
Figura 4 - Mecanismo de formao de radicais perxidos atravs do AIBN.............18
Figura 5 Formao de radicais hidroxila a partir do perxido de hidrognio..........18
Figura 6 Modelo sugerido para degradao forada por oxidao........................19
Figura 7 Oxidao de transferncia de eltrons mediada por metais....................20
Figura 8 - Degradao do fenoprofeno sob radiao UV..........................................22

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Compostos nitrogenados comumente utilizados para produo de radicais
livres nos testes de degradao forada......................................................17
Tabela 2 - Critrios de notificao, identificao e qualificao dos produtos de
degradao em medicamentos..................................................................................23

SUMRIO
1. INTRODUO.......................................................................................................12
2. ESTUDOS PRELIMINARES DE DEGRADAO FORADA..............................13
3. ESCOLHA DAS CONDIES DE DEGRADAO.............................................14
3.1 Condies de hidrlise cida/bsica................................................................14
3.2 Condies de oxidao.....................................................................................15
3.2.1 Reaes induzidas por radicais (oxidao).......................................................16
3.2.2 Reaes mediadas por perxidos.....................................................................18
3.2.3 Reaes de transferncia de eltrons...............................................................19
4. CONDIES DE FOTOESTABILIDADE..............................................................20
4.1 Fontes de luz.......................................................................................................21
5. CONSIDERAES ANALTICAS NA VALIDAO DE METODOLOGIA..........22
6. CONCLUSO........................................................................................................24
REFERNCIAS.........................................................................................................25

1 INTRODUO:
O estudo de estabilidade de insumos um dos itens mais importantes para
garantir a eficcia e a segurana das molculas. Esta segurana determinada pelo
perfil farmacolgico-toxicolgico da substncia, assim como os efeitos adversos
causados por impurezas nos produtos acabados (BAERTSCHI, 2005). Guias
internacionais como o ICH foram criados com a inteno de direcionar o trabalho
das empresas que desenvolvem novas drogas e produtos, uma vez que o
conhecimento da estabilidade da molcula essencial para o desenvolvimento da
formulao a ser usada bem como as condies de estocagem (ALSANTE et al.,
2007)
O estudo de degradao forada uma ferramenta complementar utilizada
para prevenir problemas de estabilidade, desenvolver mtodos analticos e
identificar rotas de degradao. Alm disso, permite diferenciar produtos de
degradao do ativo daqueles que so gerados na formulao do produto acabado.
As anlises desenvolvidas e validadas devem promover degradao em extenso
suficiente a fim de permitir a avaliao da formao de produtos de degradao.
importante salientar que, os produtos de degradao sob condies de estresse
podem ser classificados como potencial, pois podem ou no ser formados sob
condies de estocagem. (BAERTSCHI, 2011).
Jain et al. publicaram uma reviso que descreve os avanos recentes nos
estudos de impurezas em medicamentos entre 2008 e 2012 sob uma perspectiva
analtica. O estudo mostra o crescente interesse nas anlises de degradao
forada, as quais tendem a aumentar nos prximos anos devido ao maior rigor dos
rgos reguladores. A figura 1 mostra o nmero de publicaes de estudos de
degradao forada e perfil de impurezas.
No final de 2013, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA)
publicou a RDC 58/2013, que estabelece parmetros de notificao, identificao e
qualificao de produtos de degradao em medicamentos. (BRASIL , 2013). No
entanto, assim como nos guias internacionais, a poltica adotada nos testes de
degradao forada da ANVISA no especifica como conduzir os ensaios em
relao preparao das amostras bem como as condies necessrias para as
degradaes.
Deve ser considerada, tambm, a anlise crtica dos perfis de degradao
das molculas, as quais incluem a verificao da pureza cromatogrfica do pico do

13

insumo, balano de massas e fatores que podem interferir na estabilidade do

medicamento.
Figura 1 Publicaes sobre degradao forada entre 2008 e 2012.

FONTE: JAIN et al., 2013

Este artigo tem como objetivo criar um guia cientfico para auxiliar no
desenvolvimento, execuo e interpretao dos estudos de degradao forada.
2 ESTUDOS PRELIMINARES DE DEGRADAO FORADA
Os estudos de degradao forada so delineados para produzir testes
indicadores de estabilidade em condies extremas e para simular possveis
produtos de degradao durante a produo e estocagem do produto. Segundo a
RDC n 58/2013 as amostras a serem testadas devem ser submetidas s condies
de hidrlise cida e bsica, oxidao, fotlise e ons metlicos (BRASIL , 2013).
O objetivo atingir, no mnimo, 10% do insumo degradado devendo-se,
porm, estabelecer um limite de degradao, uma vez que, ao estressar em excesso
uma molcula, pode haver a perda dos produtos primrios. Os problemas
relacionados estabilidade encontrados durante o estudo iro formar a base do
desenvolvimento na otimizao do estudo indicador de estabilidade (BRASIL, 2013).
A estratgia inicial semelhante para o insumo ativo e o produto acabado. A
estrutura molecular do insumo ativo se torna pea chave no delineamento do estudo,
pois a partir dela podemos deduzir se o composto ir absorver radiao UV para ser
detectada. A presena de grupos funcionais ionizveis fornece uma informao
valiosa na predio do comportamento da molcula (BAERTSCHI, 2005).

14

O mtodo mais utilizado na literatura o de cromatografia lquida de alta

eficincia de fase reversa (RP-HPLC) com detector de arranjo de fotodiodos (PDA)
(CARTENSEN et al., 2000). O mtodo cromatogrfico ideal deve mostrar junto com
o insumo ativo principal todos os produtos de degradao, baseando-se na lei da
conservao de massas, isto , qualquer perda do insumo ativo, em rea
cromatogrfica, ser convertida em produtos de degradao em propores iguais.
De fato, torna-se praticamente impossvel um mtodo cromatogrfico que possa
cumprir fielmente tais requisitos. (BAERTSCHI, 2005)
3 ESCOLHA DAS CONDIES DE DEGRADAO
A escolha da concentrao inicial do ativo a ser degradada deve ser de 1.0
mg/mL. (BAERTSCHI, 2005, ALSANTE et al. 2003) Se a solubilidade for uma
limitao, inerente prpria molcula pode-se utilizar metanol em quantidades
variadas. Testes devem ser realizados nas concentraes em que o insumo ativo vai
estar presente na formulao final. Outro aspecto prtico que amostras que
necessitam de grandes concentraes de cido, lcali e agentes oxidantes para os
testes de estresse, so recomendadas a serem reduzidas a nveis tolerveis pela
coluna para serem injetados. Recomenda-se diluio com a fase mvel utilizada
(BAERTSCHI, 2011).
3.1 Condies de hidrlise cida/bsica
Condies cidas, bsicas e neutras devem ser empregadas para produzir
reaes hidrolticas. Isso especialmente importante quando o composto a ser
testado possui grupos funcionais ionizveis. As reaes de degradao dependem
de uma variedade de fatores como a constante dieltrica, a polaridade do solvente e
a energia de superfcie (BAERTSCHI, 2005). A figura 2 mostra um exemplo de
delineamento do estudo hidroltico sob condio cida e bsica.
Muitos

insumos

ativos

apresentam

problemas

de

solubilidade

em

concentraes analticas. Logo, para analisar as caractersticas de hidrlise, pode

ser necessria a adio de um co-solvente para facilitar a dissoluo. Os solventes
mais comuns utilizados nas anlises so o metanol e acetonitrila. (ALSANTE et
al.,2003)
Um cuidado necessrio a ser considerado de que o metanol possui
potencial de participao na qumica de degradao da molcula atuando como

15

agente nucleoflico, portanto deve ser utilizado com ressalvas. A acetonitrila, por ser
considerada inerte, recomendada. A neutralizao da soluo antes da injeo do
HPLC no recomendada devido possibilidade de precipitao ou de reaes
secundrias.
Figura 2 - Modelo sugerido para estudos de degradao forada por
hidrlise cida/bsica.
* em rea cromatogrfica degradada do insumo ativo.

FONTE: Adapatado de SINGH et al., 2000

3.2 Condies de oxidao

Reaes de oxidao so um dos mais comuns mecanismos de degradao
de medicamentos e insumos. Existem trs rotas de degradaes principais a
considerar para testes de estresse: oxidao induzida por radicais, oxidao
mediada por perxidos e oxidao por transferncia de eltrons. (BOCCARDI et. al,
2005). As impurezas presentes sejam no insumo ativo, sejam no produto acabado,
so as principais causas de oxidao nas condies normais de estocagem.

16

O objetivo principal dos ensaios forados acelerar o processo natural de

oxidao e identificar impurezas que podem ser formadas durante testes acelerados
e de longa durao.
3.2.1 Reaes induzidas por radicais (autoxidao)
As reaes de autoxidao possuem um mecanismo complexo que consiste
em uma reao em cadeia mediada por radicais livres, divididas em trs etapas. A
figura 3 mostra, em termos gerais, o processo de oxidao a partir de um iniciador.
Figura 3 Sequncia da reao em cadeia mediada por radicais livres

FONTE: BOCCARDI et al. 2005

Para formao de radicais livres na simulao de autoxidao so utilizados

compostos nitrogenados (Tabela 1). Originalmente, esta prtica foi sugerida por
Boccardi et al. A molcula mais utilizada e popularmente conhecida a
azobisisobutironitrila (AIBN). (BOCCARDI et al. , 2005) Os autores demonstraram
que estes iniciadores de radicais baseados em compostos nitrogenados so
capazes de produzir produtos de degradao primrios observados nos estudos de
estabilidade de longa durao.
A Figura 4 mostra o mecanismo de formao de radicais livres atravs do
AIBN. Ao aquecer a amostra a 40C o AIBN expele o nitrognio da sua estrutura
gerando carbonos reativos que rapidamente so oxidados por oxignio molecular,
formando um radical perxi que mimetiza o processo de autoxidao em condies
de estocagem (BOCCARDI et al., 2005).

17

quantidade

de

iniciadores

nitrogenados

adicionados

deve

ser

aproximadamente 10 vezes a concentrao de amostra.

Tabela 1 Compostos nitrogenados comumente utilizados para produo de
radicais livres nos testes de degradao forada.
Nome qumico

Estrutura qumica

Solubilidade

em gua

em gua

em gua

em gua

em metanol

em metanol

FONTE: Adaptado de BOCCARDI et al., 2005

18

Figura 4 - Mecanismo de formao de radicais perxidos atravs do AIBN.

FONTE: BOCCARDI et al., 2005

3.2.2 Reaes mediadas por perxidos
As anlises de degradao forada envolvendo perxidos, juntamente com
os estudos com iniciadores de radicais iro formar uma base mais completa da
susceptibilidade da molcula oxidao. O perxido de hidrognio o composto
mais empregado nos testes (PORTER et al., 1995)
As reaes de oxidao com a utilizao de perxido de hidrognio so
relativamente rpidas temperatura ambiente, logo no necessrio aquecer as
amostras testadas. Ao elevar a temperatura de reao pode ocorrer a formao de
radicais hidroxilas, que so indesejados, pois so mais fortes e no seletivos, que
reagem muito rapidamente em soluo levando a resultados diferentes em relao
ao perxido de hidrognio (BOCCARDI et al., 2005). A figura 5 mostra a formao de
radicais hidroxilas atravs do calor.
Figura 5 Formao de radicais hidroxila a partir do perxido de hidrognio.

FONTE: BOCCARDI et al., 2005

As concentraes de perxido utilizadas nos ensaios podem variar de 0,1 a

30%. Temperaturas de, no mximo, 40C so utilizadas para acelerar a reao. Um
perodo de 24h suficiente para demonstrar a degradao com perxido de
hidrognio. A figura 6 mostra uma sugesto de delineamento de estudo de oxidao.
Quando necessrio estressar uma molcula com perxidos em uma ampla
faixa de pH, deve-se levar em considerao o solvente utilizado. O metanol o
solvente de escolha. A acetonitrila, em solues de pH elevado, reage com o

19

perxido de hidrognio, formando um radical instvel que no ocorre no processo

natural de oxidao.
Figura 6 Modelo sugerido para degradao forada por oxidao * em rea cromatogrfica
degradada do insumo ativo.

FONTE: Adapatado de SINGH, 2000

3.2.3 Reaes de transferncia de eltrons

O mecanismo de oxidao por transferncia de eltrons ocorre na presena
de metais. A exposio de insumos a metais de transio tais como cobre e/ou ferro
podem levar oxidao. A concentrao de metal adicionada deve ser de 1 ppm de
Cu(II)Cl2 ou Fe(III)Cl3 (ALSANTE et al., 2007).
A figura 7 mostra o mecanismo de oxidao do arzoxifeno na presena do
on cobre. O on se complexa com a amina da acetonitrila, utilizada como diluente.
Na segunda reao ocorre a transferncia de eltrons do oxignio da molcula,
gerando um radical que ataca a estrutura interna, formando dmeros.
Figura 7 Oxidao de transferncia de eltrons mediada por metais.

20

FONTE: BAERTSCHI et al., 2011

Estes metais podem ser encontrados em vidrarias ou estar presentes em

impurezas dos solventes utilizados nas anlises por HPLC. importante haver um
procedimento padro de limpeza das vidrarias que evitem quaisquer contaminaes
que possam comprometer a qualidade dos ensaios. (DOTTERER et al., 2010)
4 CONDIES DE FOTOESTABILIDADE
A fotoestabilidade de insumos e produtos acabados pode ter impacto sobre o
prazo de validade, manuseio, estocagem e at a segurana do produto devido
fototoxicidade e fotogenotoxicidade. Em 1998, com a implementao do ICH Q1B,
que define os parmetros para conduo dos estudos de degradao forada, houve
um avano significativo na padronizao dos procedimentos em relao s outras
condies. (ICH, 1996)
No Brasil, a ANVISA publicou a RDC n 45/2012, que segue os mesmos
padres do ICH para a conduo dos estudos de fotoestabilidade. A molcula deve
ser exposta a uma mistura de UV-B (280-320 nm), UV-A (320-400 nm) e luz visvel
(400-800nm) em propores variadas. (BRASIL, 2012) No entanto, a absoro de
luz pela molcula no leva, necessariamente, a fotodegradao. Em alguns casos, o
excipiente absorve radiao e transfere a energia para o insumo ativo, podendo
gerar degradao indireta. Os testes devem ser realizados na embalagem primria e
secundria e, quando em soluo, utilizar uma amostra controle, protegida da fonte
de luz. A acetonitrila o solvente indicado, pois o metanol pode produzir artefatos de
degradao a partir de radicais metxi formados devido exposio luz
(BAERTSCHI, 2005). A figura 8 mostra um exemplo de fotodegradao e o

21

mecanismo proposto do medicamento fenoprofeno, a partir da radiao UV. O tempo

de exposio deve ser suficiente para haver uma degradao entre 10 e 20%, no
qual, dependendo da susceptibilidade da molcula a decomposio, pode variar
significativamente. (BAERTSCHI, 2011)
Quando os testes so feitos no produto acabado, tanto o insumo ativo como
os excipientes podem levar degradao. recomendado expor o placebo nas
mesmas condies e tempo para verificar uma possvel interferncia no mtodo de
identificao (ALSANTE et al.. 2007).
4.1 Fontes de luz
Como citado anteriormente, a molcula deve ser estressada numa faixa de
luz de 400 a 800 nm, as quais compreendem o espectro de luz UV e vsivel.
Entretanto, dificil predizer qual parte do espectro mais destrutivo para uma
molcula especfica. Logo, fontes de luz com diferentes distribuies de intensidade
no espectro podem levar a fotodegradaes com perfis diferentes. (BAERTSCHI,
2011).
A RDC n 45/2012 da ANVISA especifica que a exposio mnima de 1,2
milhes de lux/h integrados a uma energia UV de aproxidamente 200 watt h/m para
testes confirmatrios (BRASIL, 2012), que so os mesmos parmetros sugeridos
pelo ICH Q1B. O guia fornece duas opes de fontes de luz, as quais devem possuir
o certificado da ISO 10977 (1993) (ICH, 1996). necessrio manter um controle de
temperatura para garantir que no haja degradao trmica. Pode-se utilizar papel
alumnio para proteger as amostras-controle deste efeito, colocando-as junto
amostra testada, sob o mesmo tempo e intensidade de exposio, garantindo assim
que, caso haja, a degradao existente seja resultado da exposio luz.

22

Figura 8 Degradao do fenoprofeno sob radiao UV. Abaixo mostrado

o mecanismo proposto que leva a instabilidade da molcula.

FONTE: BAERTSCHI et al., 2011.

5 CONSIDERAES ANALTICAS NA VALIDAO DE METODOLOGIA

Como descrito anteriormente, a cromatografia lquida de alta eficincia com
detector

de

arrranjo

de

fotodiodos

preferencialmente

utilizada

para

desenvolvimento de um mtodo indicador de estabilidade. A vantagem deste tipo de

detector dar o poder ao analista de fazer uma varredura em uma ampla faixa do
espectro UV em uma nica anlise.
De acordo com o FDA, o mtodo indicador de estabilidade um
procedimento analtico capaz de discriminar o insumo ativo de quaisquer produtos
de degradao. Alm disso, deve ter uma sensibilidade suficiente para detectar e
quantificar estes produtos (FDA, 1987). A necessidade de notificao, identificao e
qualificao do(s) produto(s) de degradao no decorrer do estudo de estabilidade
do medicamento dever ser avaliada com base nas informaes descritas na RDC
58/2013, conforme mostra a tabela 2.

23

Tabela 2: Critrios de notificao, identificao e qualificao dos produtos

de degradao em medicamentos.

Fonte: BRASIL, 2013

Para a avaliao dos produtos de degradao pode-se utilizar o clculo do
balano de massa, que nada mais que quantificar os picos de degradao e ento
comparar com a perda da quantidade de amostra do composto original. O balano
de massa aceito quando totalizar aproximadamente 100%, ou seja, a diminuio
da potncia do composto original convertida em produto de degradao
quantificvel (ITO, 2012).
O conhecimento das propriedades fsico-qumicas do insumo ativo o ponto
de partida do processo de desenvolvimento do mtodo. O objetivo principal obter
uma condio de separao capaz de determinar o maior nmero de picos possveis
em uma anlise. As variveis mais comuns de separao incluem o tipo de solvente,
o pH da fase mvel, o tipo de coluna utilizada e a temperatura do forno. Deve-se
variar drasticamente estas condies para forar mudanas no perfil de separao
dos picos (DOLAN, 2002).
Para obter um pH baixo ou intermedirio na soluo, pode-se usar tampo
fosfato na faixa de pH entre 2.5 6.5. Se o mtodo for analisar a amostra acoplado
um detector de espectrometro de massas importante selecionar tampes que
sejam compatveis com o equipamento, como, por exemplo, 0,1% de cido
trifluoroactico (pH ~ 1,9) e acetato de amnia para pH elevado. A temperatura da
coluna uma tima ferramenta para a seletividade do mtodo, principalmente
quando utilizada uma eluio gradiente (DOLAN, 2002).
A validao de metodologia deve seguir os parmetros da RE n 899/2003
(BRASIL, 2003).

24

6 CONCLUSO
Os estudos de degradao forada so parte importante no delineamento do
estudo indicador de estabilidade. Entretanto, importante ressaltar que os produtos
de degradao forada so potenciais podendo, ou no, formar-se nas condies
normais de estocagem. Tanto os guias internacionais como a RDC 58/2013,
recentemente publicada pela ANVISA, no especificam como conduzir os ensaios, a
exceo dos testes de fotoestabilidade. O objetivo de qualquer estratgia usada
para degradao forada produzir uma degradao de 10-20% da concentrao
inicial, para poder observar-se todos os produtos primrios. Com o maior rigor dos
rgos regulatrios, fica provada a necessidade de um maior entendimento da
conduo de ensaios forados, bem como o desenvolvimento de estudos
indicadores de estabilidade.

25

REFERNCIAS
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