ISSN: 1677-3118

N. 01/2012
Artigo A

PROTOCOLO ACESSVEL PARA AULA PRTICA SOBRE FATORES FSICOS E

QUMICOS QUE AFETAM A INTEGRIDADE DAS BIOMEMBRANAS
Thiago Barros Galvo; Diana Aline Nga Morais Ferreira; Leonardo Emmanuel Fernandes de Carvalho;
Natnia Carol Cavalcante Rezende; Eduardo Luiz Voigt*
Departamento de Biologia Celular e Gentica, Centro de Biocincias, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Caixa Postal 1501, CEP 59072-970, Natal Rio Grande do Norte. Telefone: 84 3211-9209
Fax: 84 3215-3424. elvoigt@cb.ufrn.br
*Autor para correspondncia

Resumo:
O presente trabalho tem como objetivo a reformulao de um protocolo usado em aula prtica
para demonstrar os fatores que afetam a integridade das biomembranas. Cubos de beterraba
foram usados como modelo experimental, pois os danos causados nas membranas podem ser
visualizados pelo extravasamento de betacianinas, pigmentos hidrossolveis presentes nos
vacolos. Os testes foram realizados em baterias experimentais analisando-se o efeito de fatores
fsicos e produtos qumicos presentes no cotidiano do aluno. Para testar a temperatura, os cubos
foram colocados em tubos de ensaio submetidos condio de calor, frio e do efeito combinado
de ambos, em diferentes tempos de exposio. Quando produtos qumicos foram testados, os
cubos foram tratados com solventes orgnicos (lcool e acetona comercial) ou substncias
polares e anfipticas (desinfetante base de detergente, detergente comercial, gua oxigenada e
gua sanitria). Os resultados obtidos foram discutidos quanto capacidade dos fatores fsicos e
qumicos causarem danos s membranas. A reformulao deste protocolo com o uso de
reagentes simples, baratos e encontrados na vida cotidiana do aluno, foi capaz de representar
com clareza o efeito produzido pelos fatores testados, viabilizando a realizao desta aula prtica
em espaos didticos com condies limitadas.
Palavras-chave: Prtica de laboratrio Membranas biolgicas Permeabilidade.
Abstract:
The aim of the current work is to review a protocol used in practical classes to demonstrate some
factors that affect biomembrane integrity. Sugar-beet fragments were utilized as the experimental
model as membrane damage could be visualized by leakage of betacyanins, hydrophilic pigments
accumulated in the cell vacuoles. The tests were carried out as discrete experiments utilizing
physical agents and chemical products present in the student daily routine. To test the effect of
temperature, sugar-beet fragments were submitted to heat, cold or both at different times of
exposition. When chemical products were tested, sugar-beet fragments were exposed to organic
solvents (common alcohol and acetone) or polar and amphipathic substances (disinfectant,
detergent, hydrogen peroxide, and sodium hypochlorite). The obtained results were discussed in
terms of the capacity of the physical and chemical factors to cause membrane damage. The review
of this protocol using reagents that are present in the student daily routine were able to
demonstrate clearly the effect of the different tested factors, allowing the utilization of this practical
class under limited conditions.
Keywords: Practical classes Biological membranes Permeability.

Galvo, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.

I.

A2

INTRODUO

O ensino de Biologia Celular e Molecular uma tarefa desafiadora, pois essa

disciplina trata de estruturas e processos microscpicos, sendo assim fundamentada em
conceitos abstratos. Alm disso, esta rea do conhecimento tem apresentado muitos
avanos recentes, estando sujeita a mudanas decorrentes do surgimento de novos
conceitos [1]. Para alcanar a apreenso destes conceitos de maneira clara e eficiente, o
professor necessita atualizar continuamente seus conhecimentos terico-prticos, bem
como fazer uso de instrumentos didticos adequados [2].
Algumas estratgias so largamente empregadas em sala de aula por demonstrar
rendimento e praticidade. Figuras esquemticas, grficos, vdeos explicativos e modelos
tridimensionais, so alguns dos recursos utilizados para demonstrar estruturas e
processos da maneira como eles ocorrem in vivo. No entanto, as aulas prticas se
destacam como instrumentos didticos promissores, porque tornam o contedo mais
atrativo, envolvente e concreto [3].
As aulas prticas propiciam uma oportunidade para a vivncia de todas as etapas
do mtodo cientfico, nas quais a observao e a compreenso de fenmenos levam o
aluno ao registro sistematizado de dados e formulao de hipteses [4, 5, 6]. A
manipulao de tcnicas utilizadas em laboratrio permite que o docente exercite
habilidades e competncias, como a cooperao com os colegas, a organizao na
bancada e a manipulao de equipamentos, imprescindveis na formao acadmica [7].
Alm de permitirem a interao do aluno com os conceitos vistos em teoria, as
aulas prticas realizam papel importante no aprendizado, ao fazer com que o professor
estimule no aluno o carter investigativo e a busca pelo conhecimento cientfico como
uma conquista pessoal [8]. Apesar disso, a maioria das escolas apresenta escassez de
material biolgico, reagentes e equipamentos, devido ao custo elevado ou acesso restrito
[5]. Como consequncia, esta atividade acaba sendo banida da maioria das instituies
pblicas de ensino como escolas de nvel fundamental e mdio, assim como de
faculdades e centros universitrios [1].
Neste trabalho, um protocolo utilizado em aula prtica para demonstrar os fatores
que afetam a integridade das biomembranas foi reformulado com o intuito de tornar esta
atividade mais acessvel e demonstrar como produtos utilizados no cotidiano podem ser
amplamente aplicados [6]. A escolha deste protocolo est relacionada natureza abstrata
do contedo, alm das metodologias utilizadas para o estudo das membranas geralmente
requererem equipamentos sofisticados e custos elevados, sendo necessrias iniciativas
para viabilizar realizao destas demonstraes. Como modelo experimental, foram
utilizados cubos de beterraba. Alm de ser acessvel e adequado aos propsitos da aula
prtica, este material possibilita ao aluno a observao de agentes que causam leses
nas membranas pelo extravasamento do pigmento hidrossolvel betacianina, armazenado
nos vacolos.
Neste sentido, o objetivo deste trabalho reformular um protocolo de aula prtica
com o intuito de demonstrar a ao de agentes fsicos e qumicos sobre as membranas
biolgicas, utilizando produtos presentes na vida cotidiana do aluno. A reformulao deste
protocolo no apenas viabiliza a realizao de aulas prticas em condies mais
limitadas, mas pode servir de modelo para a readequao de outros protocolos.
II.

MATERIAIS E MTODOS

A aula prtica foi proposta em baterias experimentais, avaliando a ao de fatores

fsicos e qumicos sobre a permeabilidade das biomembranas. No primeiro momento, foi
avaliado o efeito da temperatura, submetendo os cubos de beterraba ao calor e ao frio de
forma isolada ou combinada. Posteriormente, foram utilizados produtos qumicos

Galvo, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.

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rotineiramente usados como produtos de limpeza. Estas substncias foram separadas

pela sua natureza qumica em solventes orgnicos, substncias polares e anfipticas.
II.I EFEITO DA TEMPERATURA
Materiais

Para determinar o efeito da temperatura foram utilizados os seguintes materiais:

Beterraba
Estilete
Pina
Fogareiro
Placa de Petri
Tubos de ensaio
Pipetas graduadas
gua destilada
Mtodos

Organize uma bateria de tubos de ensaio numerados de acordo com a tabela 1 e

transfira os volumes com o auxlio de pipetas.
Tabela 1. Preparao da prtica para avaliao do efeito da temperatura.

Tubo

Volume (5 mL)

Tratamento

gua destilada

25 C (controle)

gua destilada

100 C - 20 s (calor)

gua destilada

-18 C - 15 min (frio)

gua destilada

-18 C -15 min + 100 C - 20 s (calor + frio)

Corte quatro cubos de beterraba e os lave em gua corrente at a gua ficar

incolor;
Coloque um cubo no tubo 1 e outro no tubo 2, mantendo em repouso por 15 min;
Coloque dois cubos sobre uma placa de Petri levando ao congelador (-18 C) por
15 min. Logo depois, transfira os cubos para os tubos 3 e 4;
Exponha ao calor em banho fervente (100 C) os tubos 2 e 4, durante 20 s e resfrie
temperatura ambiente;
Observe e compare o extravasamento do pigmento.
II.II EFEITO DE SOLVENTES ORGNICOS

Materiais
Para testar o efeito dos solventes orgnicos, foram utilizados os seguintes
materiais e reagentes:
Beterraba
Estilete
Pina
Tubos de ensaio
Pipetas graduadas
Filme de PVC
gua destilada

Galvo, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.

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Acetona comercial (removedor de esmalte)

lcool comercial a 96 GL
Mtodos

Organize uma bateria de tubos de ensaio numerados de acordo com a tabela 2 e

transfira os volumes com o auxlio de pipetas.
Tabela 2. Preparao da prtica para avaliao do efeito dos solventes.
Tubo

Volume (5 gotas)

Tubo

Volume (5 mL)

1A

gua destilada

1B

gua destilada

2A

Acetona comercial

2B

gua destilada

3A

lcool comercial

3B

gua destilada

Corte trs cubos de beterraba e os lave em gua corrente at a gua ficar incolor;
Coloque um cubo em cada um dos tubos 1A, 2A, 3A, vede com filme PVC e incube
temperatura ambiente por 5 min;
Em seguida, transfira os cubos para os tubos 1B, 2B e 3B;
Observe e compare o extravasamento do pigmento.
II.III EFEITO DE SUBSTNCIAS POLARES E ANFIPTICAS
Materiais

Para verificar o efeito de substncias polares e anfipticas, foram utilizados os

seguintes materiais e reagentes:
Beterraba
Estilete
Pina
Tubos de ensaio
Pipetas graduadas
gua destilada
Desinfetante comercial 20% (v/v)
Detergente comercial 10% (v/v)
gua oxigenada comercial 10 volumes
gua sanitria comercial 1:4 (v/v)
Mtodos
Organize uma bateria de tubos de ensaio numerados de acordo com a tabela 3 e
transfira os volumes com o auxlio de pipetas.
Tabela 3. Preparao da prtica para avaliao do efeito de substncias polares e anfipticas.
Tubo

Volume (5 mL)

Tubo

Volume (5 mL)

1C

gua destilada

1D

gua destilada

2C

Desinfetante comercial 20%

2D

3C

Detergente comercial 10%

3D

gua destilada

4C

gua oxigenada comercial

4D

gua destilada

5C

gua sanitria comercial

5D

gua destilada

Galvo, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.

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Corte cinco cubos de beterraba e os lave em gua corrente at a gua ficar incolor;
Coloque um cubo em cada um dos tubos 1C, 2C, 3C, 4C e 5C, incubando
temperatura ambiente por 5 min;
Em seguida, transfira os cubos para os tubos 1D, 2D, 3D, 4D e 5D;
Observe e compare o extravasamento do pigmento.
III.

RESULTADOS E DISCUSSO

No presente trabalho, pretende-se demonstrar que protocolos de aulas prticas

relativamente elaborados podem ser reformulados de modo a viabilizar a sua utilizao
em condies limitadas de reagentes e equipamentos. Neste sentido, so propostos
mtodos acessveis para ilustrar os efeitos de fatores fsicos e qumicos sobre as
biomembranas. O protocolo original sobre fatores que afetam a permeabilidade das
membranas tem sido empregado em aulas prticas de Fisiologia Vegetal. Com a
reformulao, este protocolo pode ser empregado na ilustrao de fenmenos
relacionados a outras disciplinas, como a Biologia Celular e a Bioqumica. Alm disso, a
execuo desta prtica permite o ensino do mtodo cientfico e o desenvolvimento de
diversas habilidades de manipulao e interpretao.
O efeito dos diferentes agentes qumicos e fsicos sobre as membranas estimado
a partir do extravasamento de betacianinas, que so pigmentos hidrossolveis contidos
nos vacolos das clulas de beterraba [13]. Para que haja o extravasamento das
betacianinas, necessrio romper a membrana plasmtica e a vacuolar das clulas de
beterraba, caracterizando danos de membranas [14].
III.II EFEITO DA TEMPERATURA
O efeito da temperatura sobre as membranas biolgicas pode ser testado de forma
simples, utilizando equipamentos comuns e facilmente disponveis, como lamparina e
geladeira. A exposio dos fragmentos de beterraba ao calor (100 C) causou danos de
membrana progressivos, medida que aumentava o tempo de exposio (10, 15 e 20 s).
Os danos causados pelo calor so consequncias da desorganizao das biomolculas
que as compem [14]. Desta forma, o calor promove o aumento na mobilidade dos
lipdeos de membrana, assim como a desnaturao das protenas associadas, permitindo
assim, o extravasamento das betacianinas para o meio externo [9,11,12].
O aumento do tempo de exposio ao frio (10, 15 e 20 min) tambm ocasionou
danos progressivos nas membranas, indicados pelo aumento do extravasamento das
betacianinas. O frio capaz de promover a formao de cristais de gelo no meio
intracelular, os quais podem causar rupturas nas membranas durante o descongelamento
[10,13].
O efeito combinado de baixa e alta temperatura acarreta o aumento dos danos de
membrana e intensifica o extravasamento de betacianinas (Figura 1). A combinao de
frio (-18 C) e calor (100 C) por tempos de 20 min e 20 s, respectivamente, foi suficiente
para causar mais danos do que os tratamentos aplicados isoladamente. Alm disso,
notvel que um menor tempo de exposio ao calor causa mais danos s membranas
que um maior tempo de tratamento com frio, pois os efeitos do calor so mais drsticos
[14].

Galvo, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.

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Figura 1: Efeito de fatores fsicos sobre a integridade de biomembranas em tecidos de beterraba. (a)
Controle (temperatura ambiente); (b) Calor (100 C); (c) Frio (-18 C); (d) Calor e frio.

III.II EFEITO DE SOLVENTES ORGNICOS

Assim como os fatores fsicos, solventes orgnicos causam o
extravasamento das betacianinas para o meio externo, por meio de danos na membrana
plasmtica e na membrana vacuolar [13-14]. Para avaliar o efeito destes solventes, foram
selecionadas duas substncias, lcool e acetona comerciais, ambas facilmente
encontradas em drogarias. Dentre os agentes qumicos, estes foram os que mais
afetaram a integridade das membranas, provocando maiores danos (Figura 2).
A acetona e o lcool so solventes que apresentam carter hidrofbico e agem
solubilizando as caudas de cidos graxos dos lipdeos e desnaturando as protenas
associadas, pois so capazes de interferir nas interaes hidrofbicas que do
estabilidade a estes componentes nas membranas [11-12]. Por apresentar carter mais
hidrofbico do que o lcool, a acetona teve maior efeito sobre as membranas,
aumentando assim os danos observados (Figura 2).

Figura 2: Efeito de solventes orgnicos apolares sobre a integridade de biomembranas em tecidos de

beterraba. (a) Controle (gua destilada); (b) Acetona comercial; (c) lcool comercial 70% (v/v).

Galvo, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.

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III.III EFEITO DE SUBSTNCIAS ANFIPTICAS E POLARES

O efeito de substncias anfipticas e polares pode ser facilmente demonstrado
utilizando substncias encontradas em supermercados e farmcias, como desinfetante
comercial base de detergente, detergente comum, gua oxigenada e gua sanitria
comercial.
So denominadas anfipticas as substncias que possuem uma poro hidroflica
(com afinidade pela gua) e uma poro hidrofbica (sem afinidade pela gua) [12]. A
poro hidrofbica do detergente se intercala entre os lipdeos de membrana e causa a
formao de micelas, o que destri a integridade da membrana. Alm disso, a poro
hidrofbica dos detergentes capaz de se ligar com as regies hidrofbicas das protenas
de membrana, formando complexos detergente-protena [9]. J a poro hidroflica, que
no caso do detergente e do desinfetante inica, causa desnaturao de diversas
protenas de membrana, o que tambm afeta a integridade das membranas [9]. Como o
efeito do detergente e do desinfetante similar (Figura 3), pode-se atribuir o maior
extravasamento de betacianinas provocado pelo desinfetante ao fato de esse possuir em
sua composio tensoativos no inicos, alm do princpio ativo (compostos quaternrios
de amnio), que tambm atua na desorganizao das membranas.
Em comparao com os demais tratamentos, as substncias exclusivamente
polares, como o perxido de hidrognio e o hipoclorito de sdio, aparentemente causaram
os menores danos s membranas (Figura 3). Tendo em vista que estes compostos so
agentes oxidantes capazes de danificar tanto as protenas quanto os lipdios de
membrana [12], seria esperado que provocassem elevado extravasamento. No entanto, a
colorao menos intensa do meio de reao no necessariamente indica menor extenso
de danos s membranas. Considerando que as betacianinas podem ser degradadas na
presena de agentes oxidantes [15], a interpretao do dano causado s membranas com
base na colorao do meio de reao deve ser cautelosa.

Figura 3: Efeito de substncias anfipticas e polares sobre a integridade de biomembranas em tecidos de

beterraba. (a) Controle (gua destilada); (b) Desinfetante comercial base de detergente 20% (v/v); (c)
Detergente comercial 10% (v/v); (d) gua oxigenada comercial (10 volumes); (e) gua sanitria comercial
1:4 (v/v).

Galvo, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.

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III.IV APLICAES DIDTICO-PEDAGGICAS.

O desenvolvimento desta atividade prtica permite que o aluno desenvolva
habilidades, como o manuseio de equipamentos e utenslios, e competncias, como
capacidade de organizao, trabalho em grupo e capacidade de desenvolver o
pensamento lgico, observando um fenmeno e formulando algumas hipteses. Alm
disso, por ser uma atividade em laboratrio, proporciona o exerccio de uma postura
profissional, a qual exigida pelo ambiente de trabalho.
Durante a aula prtica necessrio direcionar a atividade dos alunos, afim de
aumentar a fixao de conceitos importantes, por meio de questes pertinentes que
incitem a curiosidade. Desta forma, sugerimos questes que podem ser utilizadas pelo
professor ao final ou durante a aula prtica. Neste sentido, interessante que as questes
abranjam desde os conceitos mais bsicos at possveis aplicaes do conhecimento
apreendido. So elas:
1.
Por que a exposio a temperaturas elevadas (100 C) causa danos s
membranas mais rapidamente do que a exposio a temperaturas mais baixas (-18 C)?
2.
Que relao pode ser observada entre a hidrofobicidade do composto e sua
capacidade de causar danos s membranas?
3.
O que so substncias anfipticas e de que forma elas podem atuar sobre
as membranas?
4.
Como os diferentes desinfetantes (lcool, desinfetante comercial, gua
sanitria e gua oxigenada) demonstrados atuam para eliminar microorganismos?
5.
De que forma os agentes oxidantes podem lesar os tecidos? Considerando
que muitas clulas eucariticas produzem alguns destes agentes durante o metabolismo,
por que no sofrem leses constantes?
As questes iniciais (1 a 3) visam fixar alguns conceitos e mecanismos importantes
contemplados na atividade, como a capacidade do calor de desorganizar membranas; a
relao entre hidrofobicidade do composto e sua capacidade de solubilizar os lipdeos de
membrana; e o conceito de substncias anfipticas. J as questes seguintes (4 e 5)
visam levar o aluno a estabelecer relaes, como a capacidade das substncias
causarem danos membrana com sua propriedade antimicrobiana.
IV.

CONCLUSO

Conclumos que a reformulao do protocolo sobre fatores que afetam a

integridade das biomembranas com o uso de reagentes simples, baratos e encontrados
na vida cotidiana do aluno, foi capaz de representar com clareza o efeito produzido
fatores qumicos e fsicos testados. Alm disso, a reformulao deste protocolo ampliou
os tipos de materiais que podem ser utilizados e as reas do conhecimento nas quais
pode ser aplicado, viabilizando a realizao desta prtica em espaos didticos com
condies limitadas.
V.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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