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1.

INTRODUO
No estudo de microrganismos so imprescindveis as seguintes operaes: execuo de
preparaes microscpicas, esterilizao de vidrarias, preparo de meios de cultura e
materiais diversos, tcnicas de cultivo, isolamento e outros ensaios microbiolgicos.
O acondicionamento correto de materiais e de vidrarias de vital importncia para a
esterilizao eficiente em autoclave. O sucesso de anlises depende da obteno de
materiais livres de contaminaes iniciais, a fim de que se possa determinar apenas o
microrganismo presente em determinada amostra. Assim, pipetas, placas de Petri, tubos
de cultura e demais instrumentos usados em microbiologia devem estar corretamente
embalados, para que, depois de esterilizados, possam ser guardados sem que sofram
nenhum tipo de contaminao subsequente.
O calor mido um agente fsico amplamente usado. A gua fervente destri clulas
vegetativas da maioria das bactrias e dos fungos e inativa alguns vrus. Entretanto, no
eficiente na destruio de todos tipos de esporos. O processo de autoclavagem utiliza
gua aquecida sob presso. Seu ponto de ebulio elevado e, assim, temperaturas
acima de 100C podem ser alcanadas. Isso normalmente obtido por meio de uma
autoclave com presso de 15lb/pl (aproximadamente 1atm) mantida por 15 a 20
minutos, dependendo do volume da carga. A essa presso, maior do que a atmosfrica, a
temperatura alcana 121C, que alta o suficiente para matar os esporos, como tambm
organismos vegetativos, e para romper a estrutura dos cidos nuclicos nos vrus.

2. OBJETIVOS
Familiarizar o aluno com o preparo e esterilizao de meios, utenslios e vidrarias
necessrios a conduo de prticas microbiolgicas; observando o funcionamento da
autoclave, como embalar os materiais para esterilizao e como armazen-los, bem
como conhecer e discutir a aplicao dos diversos tipos de meios de cultura.

3. MATERIAIS E MTODOS
a) Materiais
gar MacConkey (composto de 17 g/L de peptona de casena)

Esptulas e Bastes de Vidro


Becker, Tubos de Ensaio, Placas de Petri, Proveta e Erlenmeyers
Balana, Microondas e Autoclave
Papel Alumnio, Papel Kraft, Barbante, algodo, gaze e Caneta

marcador de texto

b) Mtodos
Preparo de meios de cultivo (volume total de cada meio = 100 mL)
1. Pesar as substncias e coloc-las em um bquer (a exceo do gar);
2.Acrescentar a metade dos 100 mL de gua destilada, medida com uma proveta;
3. Dissolver os ingredientes em gua agitando continuamente com um basto de vidro
ou com um agitador eltrico (uso de barra magntica), evitando a formao de
espuma.Quando necessrio, dissolver os ingredientes do meio de cultura em banhomaria, vapor fluente em autoclave, utilizando a chama do bico de Bunsen protegida
com tela de amianto, chapa aquecedora eltrica ou, ainda, em forno de microondas,
at a ebulio, agitando sempre. Evitar o aquecimento desnecessrio;
4. Tampar os tubos com algodo ou tampo de algodo e gaze, proteg-los com papel
de alumnio e papel kraft e amarr-los com barbante
5. Esterilizar em autoclave a 121C (1 atmosfera de presso) por 15 minutos.
Para a esterilizao de placas de Petri, a embalagem feita com papel Kraft e barbante e
deve conter, no mximo, 3 placas sobrepostas.
Para o uso correto da autoclave, devem-se seguir as seguintes etapas:
1.

Verificar o nvel de gua da autoclave. O nvel deve estar acima da resistncia para
que o aparelho no sofra danos;

2.

Ligar a chave geral e colocar o termostato do aparelho no nvel mximo;

3.

Fechar a tampa da autoclave, girando as maanetas paralelamente para no haver


desequilbrio e/ou desgaste da tampa e abrir a vlvula de escape de vapor. A cmara
da autoclave primeiramente lavada com vapor fluente, para remover e evitar a
formao de bolses de ar residual, que pode comprometer a esterilizao;

4.

Depois da sada constante de vapor (aproximadamente 5 minutos) fechar a vlvula


de escape e deixar chegar 121C ou 1atm;

5.

Colocar o termostato do aparelho no nvel mdio e marcar o tempo de


autoclavao;

6.

Finalizado o tempo, desligar o termostato e esperar que a mesma resfrie;

7.

Quando o ponteiro do termostato chegar na posio inicial, abrir a vlvula de


escape de vapor. Quando no houver mais liberao de vapor, abrir as maanetas e
a tampa da autoclave.

Obs: Nunca abandonar o local de esterilizao, conferindo sempre a temperatura da


autoclave, evitando a quebra de materiais e o RISCO DE EXPLOSO.

4. DESENVOLVIMENTO
No se deve abrir o registro antes que o manmetro atinja a posio zero, para evitar
que o material esterilizado fique muito molhado e que os papis que o envolvem se
rasguem. E tambm quando a presso da autoclave aliviada rapidamente, os lquidos
dentro dos tubos e frascos fervem violentamente, fazendo com que os tampes sejam
arremessados para fora dos mesmos.
Antes de iniciar o uso da autoclave deve-se verificar se a gua da autoclave foi trocada,
e observar o nvel da gua que deve estar at 1 cm abaixo da cruzeta. Posterior a essas
verificaes deve-se colocar o cesto da autoclave, e todo o material a ser esterilizado
deve ser colocado na parte superior do cesto isso de acordo com a capacidade da
autoclave. Fecha-se a tampa, apertando os manpulos em cruz. A chave de energia da
autoclave aberta liberando a corrente e ele deve ser ligado na potncia mxima e o
registro aberto (vlvula de escape). Aguarda-se a sada de vapor por 3 a 5 minutos,
fechando-se o registro aps esse tempo. Quando a temperatura de trabalho for alcanada
coloca-se a chave na posio mdia. O tempo que deve ser entre 15-20 minutos
marcado (esse tempo variar de acordo com o material). Terminado o tempo de
esterilizao a autoclave deve ser desligada e deixa-se o ponteiro do manmetro atingir
a posio zero. Como j mencionado anteriormente, o registro deve ser aberto aos
poucos e aguarda-se a sada do vapor da autoclave, de maneira que ele seja escoado
completamente. Em seguida, os manpulos em cruz so abertos e os materiais so
retirados levando-os a estufa de secagem.
Meios de cultura consistem da associao qualitativa e quantitativa de substncias que
fornecem os nutrientes necessrios ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos
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fora do seu meio natural. Tendo em vista a ampla diversidade metablica dos
microrganismos, existem vrios tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas
exigncias nutricionais. Alm dos nutrientes preciso fornecer condies ambientais
favorveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, presso osmtica,
umidade, temperatura, atmosfera (aerbia, microaerbia ou anaerbia), dentre outras.
Na prtica realizada foi prepardo o meio de cultura com Agar MacConkey com 0,15%
de sais biliares, cristal violeta e NaCl, tomando a devida ateno durante o preparo ao
uso do microondas colocando intervalos pequenos de tempo de aquecimento para que
no houvesse perda de material caso houvesse borbulhamento.
O meio nutritivo est composto por elementos essenciais e por componentes opcionais.
Os nutrientes essenciais so: sais inorgnicos, os carboidratos, as vitaminas e pelas fitohormonas ou reguladores de crescimento. Outros componentes, incluindo as fontes de
azoto orgnico, cidos orgnicos e substncias complexas, podem ser importantes em
determinadas culturas, mas so opcionais.
1. Sais inorgnicos: os nutrientes inorgnicos das culturas de tecidos so os
normalmente requeridos pelas plantas. O azoto (N), Potssio (K); Fsforo (P), Clcio
(Ca), Enxofre (S) e Magnsio (Mg) so requeridos em quantidades milimolares
(macronutrientes). A concentrao tima de cada nutriente para alcanar taxas de
crescimento mximas, variam consideravelmente dependendo da espcie, do tipo de
cultura, etc., no entanto para a maioria das culturas o meio nutritivo dever conter entre
25 a 60 mM de azoto inorgnico.
2. Carboidratos: a fonte standard de carbono a sacarose. A glucose e a frutose podem
igualmente ser usadas. A glucose pode substituir com xito a sacarose em meios
especfico. Outros carboidratos que tem sido igualmente testados incluem a lactose,
maltose, galactose, e amido, no entanto, estes compostos so geralmente muito
inferiores a sacarose ou a glucose como fonte de energia
3. Vitaminas: as plantas no seu ambiente natural sintetizam as vitaminas que so
necessrias para o crescimento e desenvolvimento. No entanto, quando as clulas ou
tecidos de plantas so colocados em cultura, algumas vitaminas tornam-se limitativas.
Existe um requerimento absoluto de tiamina. As bases biolgicas para este
requerimento no tm sido ainda estabelecidas. O crescimento das culturas de tecidos
vegetais incrementado quando se adiciona ao meio de cultura cido nicotnico e
priridoxina.
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A esterilizao o processo que promove completa eliminao ou destruio de


todas as formas de microorganismos vivos que se encontrem superfcie ou no
interior de um material, podendo ser alcanado pela exposio do material a agentes
letais fsicos ou qumicos, ou ainda no caso de substncias lquidas, a separao
mecnica dos organismos atravs de filtraes
Esterilizao por calor mido: a esterilizao pelo calor pode ser alcanada
utilizando equipamentos que trabalham balanceando tempo, temperatura e presso
atmosfrica, como por exemplo, a autoclave que utiliza os mesmos procedimentos
de uma panela de presso.
Esterilizao por calor seco: o calor seco utilizado para esterilizar, principalmente
material de vidro, materiais slidos termoestveis e alguns outros materiais
utilizados no laboratrio de biotecnologia. um dos mtodos de esterilizao mais
utilizados e de muito fcil aplicao. O material utilizado apenas uma estufa de
alta temperatura (160 - 200C). O problema desse tipo de esterilizao que a
penetrao do calor que vem da parte inferior da estufa lenta, no uniforme e a
alta temperatura pode danificar o material, o que implica em dificuldades na
validao do processo de esterilizao.
Em resumo pode-se afirmar que o calor seco empregado na esterilizao de
instrumental e vidraria e o calor mido, presso atmosfrica ou saturado sob
presso, aplicado esterilizao de equipamentos e, principalmente, de meios de
cultivo.
Outros mtodos de esterilizao incluem a irradiao e a filtrao. A filtrao
especialmente utilizada para esterilizao de meios e solues. Unidades de filtrao
(acetato) que podem ser posteriormente autoclavadas.

5. CONCLUSO
A partir desse experimento foi possvel aprender a realizar de forma adequada a
esterilizao atravs do calor mido utilizando o mtodo da autoclavagem. Tambm
foi realizado o preparo de forma satisfatria do meio de cultura utilizando gar
MacConkey.

6. REFERNCIAS

[1] LUQUETA, Gerson Roberto. Esterilizao de instrumentos metlicos e vidraria.


Disponvel em < http://gerson.luqueta.com.br/index_arquivos/Procedimentos.pdf>.

[2] LORDLO, Fernanda Silva; SOUSA JUNIOR, Manuel Alves de; M.S.PAULILLO,
Luis Cesar. Esterilizao de equipamentos e materiais em laboratrios de biotecnologia
&

processos

fermentativos.

Disponvel

em

<

http://www.redemebox.com.br/index.php?option=com_content&view=article&id=2419
2:esterilizacao-de-equipamentos-e-materiais-em-laboratorios-de-biotecnologia-aprocessos-fermentativos&catid=240:248&Itemid=21>.

[3] Penn, C (1991). Chapter 1. Equipment and materials; Chapter 5. Sterility and aseptic
technique. In Handling Laboratory Microorganisms, Open University Press,
Philadelphia: 5-25 e 41-48 pp.

[4] DIFCO Manual, Section 1: 12-16.

[5]Agencia Nacional de Vigilancia Sanitria. Descrio dos Meios de Cultura


Empregados

nos

Exames

Microbiolgicos.

Disponvel

em

<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_4_2004.pdf>.