UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA AMBIENTAL

DEA 07785 LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

Profa. Regina de Pinho Keller

Prof. Srvio Tlio Alves Cassini
Prof. Celson Rodrigues
Prof. Paulo Wagnner
Professores de Microbiologia

Larissa Lopes Roldi

Auxiliar Tcnica

Sumrio
NORMAS DE SEGURANA PARA AS AULAS PRTICAS: ............................................................... 3
CONCEITOS BSICOS DE DESINFECO E ESTERILIZAO: ..................................................... 4
COMO TRABALHAR COM MICROSCPIO ....................................................................................... 5
COMO PREPARAR O RELATRIO DE AULAS PRTICAS ............................................................... 7
AULA PRTICA I ................................................................................................................................. 8
MEIOS DE CULTURA, TCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
AMBIENTAIS ....................................................................................................................................... 8
PARTE 01 ISOLAMENTO DE BACTRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS DIVERSAS10
PARTE 02 ISOLAMENTO DE BACTRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS E
CULTURAS PURAS PELA TCNICA DE ESTRIAMENTO ............................................................... 10
AULA PRTICA II .............................................................................................................................. 12
ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS ........................................... 12
AULA PRTICA III ............................................................................................................................. 16
DETECO DE INDICADORES DE POLUIO FECAL EM GUAS

(MTODO

CROMOFLUOROGNICO) ............................................................................................................... 16
.......................................................................................................................................................... 19
AULA PRTICA V ............................................................................................................................. 20
IDENTIFICAO DE BACTRIAS (MTODO DA COLORAO DE GRAM)................................... 20
AULA PRTICA VI ............................................................................................................................ 23
IDENTIFICAO DE BACTRIAS POR TESTES BIOQUMICOS .................................................... 23
AULA PRTICA VII ........................................................................................................................... 25
DESINFECO MICROBIANA COM AGENTES FSICOS E QUMICOS ......................................... 25
PARTE 01 DESINFECO COM AGENTES FSICOS .................................................................. 25
PARTE 02 DESINFECO COM AGENTES QUMICOS .............................................................. 26
AULA PRTICA VIII .......................................................................................................................... 28
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS TSA (Antibiograma) ................................ 28
AULA PRTICA IX ............................................................................................................................ 30
ENSAIOS ECOTOXICOLGICOS COM BACTRIAS Vibrio fischeri ................................................ 30

DEA 07785 - LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA E ECOTOXICIDADE

As aulas prticas de Microbiologia e Ecotoxicologia tm como objetivo ensinar os princpios gerais e mtodos
utilizados nessa rea de estudo. Nestas aulas teremos contato com uma variedade de bactrias, sendo algumas
delas, patognicas para o homem, portanto essencial que as normas sejam seguidas a fim de se evitar
contaminaes acidentais.

NORMAS DE SEGURANA PARA AS AULAS PRTICAS:

Cuidados Pessoais:
indispensvel o uso de JALECO no laboratrio, que deve ser de mangas compridas e estar abotoado;
No comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratrio;
Cabelos longos devem ser amarrados de forma a no interferir com reagentes e equipamentos;
Todo o material pessoal (bolsas, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho;
Utilizar na bancada somente o material necessrio ao trabalho prtico: roteiro de aula e caneta para anotaes;
Evitar a desordem do ambiente e prestar ateno s atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes e/ou
a contaminao indevida dos materiais esterilizados;
Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspirao de culturas,
etc), comunicar imediatamente o professor ou o tcnico responsvel pela aula.

Descarte de material:
Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes prprios, existentes nos laboratrios. NUNCA
deix-los dispostos diretamente sobre bancadas ou pias;
Placas de petri, contaminadas ou no, devero permanecer tampadas sobre a bancada;
Lminas fornecidas para visualizao devero ser colocadas em recipiente prprio para posterior
descontaminao;
Tubos com culturas devero ser devolvidos para as estantes.

Terminados os trabalhos prticos:

Esterilizar alas e fios de platina;
Aps as aulas, as culturas de microorganismos devero ser descontaminadas antes de serem descartadas;
Verificar se as torneiras de gua e gs esto fechadas;
Limpar microscpios e cobri-los com a capa;
Desligar lmpadas e microscpios;
Retirar as luvas e descartar em lixo prprio;
Tirar o jaleco e guardar;
Lavar cuidadosamente as mos com gua e sabo ou antissptico.

CONCEITOS BSICOS DE DESINFECO E ESTERILIZAO:

A condio sanitria de uma dada populao humana determinada, em larga escala, por sua capacidade de
controlar eficazmente as populaes microbianas. Os processos podem ser especficos, como o uso de
medicao capaz de eliminar os microrganismos infectantes, ou podem ser mais gerais, como as prticas
sanitrias de assepsia. As principais razes para desenvolver o controle de microrganismos so, em resumo:
1) prevenir a transmisso de doenas e infeces;
2) prevenir a contaminao ou crescimento de microrganismos nocivos
3) prevenir a deteriorao e dano de materiais por microrganismos.
Os microrganismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes fsicos ou qumicos. Uma grande
variedade de tcnicas e de agentes pode ser utilizada, agindo de modos diferentes e tendo seu prprio limite de
aplicao prtica. Os termos a seguir so usados para descrever os processos fsicos e os agentes qumicos
destinados ao controle dos microrganismos:
ESTERILIZAO: Processo de destruio total ou remoo de todas as formas de vida de um material ou
ambiente, atravs de mtodos fsicos ou qumicos. Do ponto de vista microbiolgico, um material estril est
completamente livre de todos os microrganismos.
DESINFECO: Consiste na destruio, remoo ou reduo dos microrganismos presentes num material
inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfcie ou local.
ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminao a um objeto, superfcie ou local.
ANTI-SEPSSIA: Previne o crescimento ou ao dos microrganismos. Em geral, a desinfeco ocorre em tecidos
vivos, como pele e mucosas.
BACTERICIDA: um agente que mata as bactrias. De modo similar, os termos: fungicida, viricida e
esporocida se referem aos agentes que matam os fungos, vrus e esporos, respectivamente. As formas
esporuladas no so necessariamente eliminadas por estes agentes.
LIMPEZA: Remoo de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfeco ou
esterilizao.

COMO TRABALHAR COM MICROSCPIO

Em primeiro lugar essencial que voc conhea as partes pticas e mecnicas dos microscpios:

- Mantenha o microscpio livre de poeira, vapores cidos e do contato com reagentes. Para mant-lo seco, cubra
com capa de flanela, pois evita o p e a multiplicao de fungos Obs: as capas devem ser lavadas
periodicamente;
- Fazer a assepsia das luvas ou das mos para manusear o microscpio;
- No manusear o equipamento com as mos sujas ou molhadas;
- Na remoo do equipamento, segure-o firmemente com uma das mos no brao e outra na base, ou com as
duas no brao, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfcie plana,
evitando qualquer movimentao brusca. Nunca desloque o aparelho com a lmpada acesa ou logo aps ter
sido apagada;
- Muita ateno necessria quando se observa a preparao em meio lquido, pois h sempre o risco de molhar
a lente frontal da objetiva; portanto o conselho retirar o excesso de lquido com papel de filtro, antes de colocar
a lmina sobre a platina; em caso de acidente, enxugar imediatamente com papel absorvente macio;

UTILIZAO DAS LENTES

Na observao de uma preparao, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para focalizar
com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma:
- Escolha uma estrutura na preparao, movendo a lmina atravs do charriot at que o objeto fique exatamente
no centro do campo, mesmo que embaado;
- Olhe pela ocular e eleve a mesa de platina com o ajuste macromtrico lentamente. Assim que a imagem
aparecer, mesmo confusa, pare e complete a focalizao com o ajuste micromtrico.
A LENTE OBJETIVA DE IMERSO
- a lente de maior aumento (100x) e seu uso mais delicado, pois a distncia focal entre a face da objetiva e a
parte superior da lamnula diminui quando a ampliao aumentada.
- Em primeiro lugar, assegure-se da existncia de algo no campo, posicionando a objetiva de menor aumento.
- Certifique-se que a iluminao e o objeto esto bem centrados, posicione o revlver entre uma lente e outra e
coloque uma gota de leo no centro da operao. O leo deve ter o mesmo ndice de refrao da lente objetiva;
- Coloque a lente objetiva de imerso em contato com a gota de leo ainda convexa, at a mudana de forma da
mesma. Posicione os olhos nas oculares e complete a focalizao com o micromtrico.

COMO PREPARAR O RELATRIO DE AULAS PRTICAS

PGINA 01:

PGINAS SEGUINTES:
Introduo Pequeno pargrafo introduzindo o leitor para o assunto que vai ser apresentado no relatrio.
Objetivos Descrever os objetivos da aula prtica.
Resultados e Discusso Apresentar os resultados na forma de esquemas, fotos, desenhos, figuras, tabelas,
grficos e etc. Discutir os resultados obtidos utilizando informaes obtidas em livros-texto e artigos cientficos.
Evitar o uso de referncias obtidas em sites no cientficos da internet.
Concluso Concluir o trabalho apresentado com base no que foi proposto nos objetivos da prtica.

AULA PRTICA I
MEIOS DE CULTURA, TCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE
MICRORGANISMOS AMBIENTAIS
I.INTRODUO
O estudo de microrganismos exige o prvio isolamento e identificao e, para isso, so utilizados diversos meios
de cultura. Estes meios so misturas de nutrientes que possibilitam o crescimento e multiplicao in vitro dos
microrganismos. Em geral, os meios devem dispor de fontes de carbono (carboidratos) e fontes de nitrognio
(protenas) como requisitos mnimos para que os microrganismos possam sintetizar a sua prpria energia. So
tambm necessrios alguns sais inorgnicos e vitaminas.
Os meios de cultura podem ser classificados, basicamente, quanto consistncia (Lquidos, Semisslidos e
Slidos) e quanto funo (Simples, Enriquecimento, Seletivo, Diferencial, Manuteno). E quanto ao seu
preparo, os meios de cultivo devem ser preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade.
Toda a manipulao realizada em laboratrio (com meios, cultura e material utilizado) requer certos cuidados
para evitar a contaminao. Esses procedimentos formam um conjunto de tcnicas asspticas.
A inoculao a contaminao proposital de um meio de cultura, ou seja, a transferncia de microrganismos
para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam possibilitando sua identificao. A inoculao em
diferentes meios envolve diferentes tcnicas de semeadura. Tcnica de semeadura o mtodo pelo qual so
transferidos inculos microbianos de um meio de cultura, ou do material a ser analisado (ex: secrees, alimentos
e etc.), para outro meio de cultura. A escolha da tcnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o
tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo.
Os meios de cultura, em geral, depois de preparados, so distribudos em tubos de ensaio ou placas de Petri.
Para o preparo de um meio de cultura mnimo em tubos de ensaios, basta pesar os componentes do meio de
cultura (Tabela 01) e hidrata-los com H2O destilada, at volume final desejado. Em seguida, realiza-se a completa
dissoluo dos componentes, por agitao ou aquecimento, e esterilizao.

Tabela 01. Funes e massas dos componentes a serem pesados para o preparo de 1L de gar nutriente.
COMPONENTES

FUNCES

Extrato de Carne

Carboidratos, compostos nitrogenados, vitaminas, sais.

3,0

Peptona

Nitrognio orgnico, algumas vitaminas

5,0

NaCl

ons e requerimento osmtico

8,0

Agar

Solidificar

15,0

Aps a completa dissoluo dos componentes, o meio distribudo nos tubos de ensaio, que em seguida so
tampados com algodo e colocados na posio vertical dentro de um recipiente, que ento fechado e
autoclavado para a esterilizao do material. Em seguida os tubos so distribudos sobre a bancada na posio
inclinada, para a solidificao do meio. importante observar a posio do agar, este deve ocupar o tero inferior
do tubo.

 semelhana do preparo dos tubos, para o preparo do meio mnimo em placas de Petri, os componentes da
tabela acima so pesados e hidratados com H2O destilada, at a completa dissoluo em um erlenmayer,
conforme o item anterior. Em seguida o erlenmayer fechado com papel e autoclavado. Aps a esterilizao do
meio realizada a distribuio do meio pronto em placas previamente esterilizadas, ou em placas descartveis
estreis.

ISOLAMENTO DE BACTRIAS
O isolamento de bactrias consiste na obteno de culturas chamadas puras, que contm apenas os
microrganismos de interesse. Trata-se de um importante passo na determinao correta do microrganismo, pois
somente em colnias isoladas que se consegue aplicar testes de identificao relacionados com a morfologia
da colnia ou com a produo de um produto especfico.
Apesar da possibilidade de se utilizar microrganismos geneticamente modificados, ainda possvel encontrar
uma grande variedade de novos microrganismos no meio ambiente, sendo que muitos podem ser de alto interesse
comercial. A primeira etapa para a utilizao destes microrganismos a etapa de isolamento de uma colnia, j
que todo o seu estudo dependente da possibilidade de cultivar e manter estes microrganismos viveis em
laboratrios, atravs das culturas puras.
O metabolismo e as necessidades nutricionais especficas dos microrganismos variam de espcie para espcie,
sendo possvel distinguir vrios grupos de microrganismos, de acordo com o conhecimento, por exemplo, dos
nutrientes necessrios para o seu crescimento ou pelos produtos especficos liberados ou consumidos durante o
metabolismo. Com o conhecimento destas particularidades possvel formular meios de cultura que promovam
o crescimento de um determinado microrganismo ou grupo de microrganismo no laboratrio.
O isolamento se inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o microrganismo desejado como solo,
gua, ar, lodo, alimentos, partes do corpo, dentre outras fontes. Em seguida, as caractersticas especficas que
um organismo possui para se desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores seletivos no processo de
isolamento. A presso seletiva utilizada no isolamento de microrganismos que se desenvolvem
preferencialmente em determinados substratos, na presena de certos compostos ou no cultivo sob condies
que so adversas a outros microrganismos que no so de interesse.

Ao final da prtica, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas ao procedimento de semeadura dos
microrganismos em o meio de cultura, bem como, a aplicao de tcnicas de isolamento por estrias.

II.MATERIAIS
- Tubos de ensaio esterilizados

- Erlenmeyer esterilizado

- Swab estril

- Placas de Petri esterilizadas

- Alas de semeadura

- Lamparinas

- gua destilada esterilizada

- Culturas de bactrias

- Tubos com meio de cultura

estril

- Salina esterilizada

- Placas com meio de cultura

estril

III.METODOLOGIA

PARTE 01 ISOLAMENTO DE BACTRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS DIVERSAS

- Identifique as placas contendo meio de cultura estril de acordo com o grupo, data e tipo de amostra;
- Com uma caneta prpria, faa uma diviso da placa em quadrantes desenhando no vidro da placa que contm
o gar;
- Com o auxlio de um swab umedecido em salina, colete amostras de superfcies diversas, ex: couro cabeludo,
celular, mochila, torneiras, maanetas, etc;
- Remova a tampa da placa e, gentilmente, passe o swab pela superfcie do gar no quadrante determinado para
cada amostra coletada;
Amostra 1: ___________________
Amostra 2: ___________________
Amostra 3: ___________________
Amostra 4: ___________________
- Cubra a placa com filme plstico e incube a 37C por 48 horas ou em temperatura ambiente por 7 dias.
- Uma placa aberta ser disposta sobre a bancada durante a prtica por 15 min para que seja coletada amostra
do ar ambiente;
OBS: As placas devero ser incubadas invertidas para evitar que o meio se desidrate e que a gua de
condensao caia sobre o meio.
- Aps a incubao, retire as placas da estufa e observe o crescimento bacteriano nas diferentes reas da placa.

PARTE 02 ISOLAMENTO DE BACTRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS E CULTURAS

PURAS PELA TCNICA DE ESTRIAMENTO
O isolamento de bactrias em meios de cultura slidos realizado por meio de tcnicas de estriamento, que
consistem no espalhamento de inculos bacterianos na superfcie do meio de cultura em diferentes direes e
de maneira organizada, de acordo com a disposio do meio. Nesta parte da aula devero ser realizados
estriamentos, em tubos de ensaio e placas de Petri, de acordo com o representado nas figuras abaixo.

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2.1 AMOSTRAS AMBIENTAIS

- Identificar dois tubos contendo meio de cultura estril de acordo com o grupo, data e tipo de amostra;
- Para o isolamento de bactrias provenientes de amostras ambientais sero utilizadas duas amostras, sendo
uma lquida e uma slida;
- Em cada tubo de ensaio contendo meio de cultura inclinado, remova a tampa de algodo, prximo do bico de
Bunsen e realize estrias com auxlio da ala de repicagem;
AMOSTRA LQUIDA: ______________: Mergulhe a ala no lquido e, com cuidado, realize o estriamento como
mostra a figura anterior;
AMOSTRA SLIDA: _______________: Misture a amostra slida em gua esterilizada e retire uma alquota com
a ponta da ala de repicagem e realize o estriamento de acordo com o indicado na figura anterior;
- Incube os tubos a 37C por 48 horas ou a temperatura ambiente por 7 dias;
- Aps a incubao, retire os tubos da estufa e observe o crescimento bacteriano nas diferentes reas do tubo.

2.2 CULTURAS PURAS

ESTRIAMENTO EM PLACAS DE PETRI
- Identifique duas placas de Petri contendo meio de cultura estril de acordo com o grupo, a data e tipo de amostra;
- Todo o procedimento deve ser feito prximo lamparina;
- Com uma ala previamente esterilizada, toque numa das colnias escolhidas com a ponta do ala e semeie em
placa de Agar nutriente seguindo os movimentos de estriamento, conforme se observa na figura abaixo;
- Aps a primeira estria, flambe a ala e gire a placa cerca de 90 para puxar a nova estria. Repita esse passo
pelo menos mais 1 vez;
- Lembre-se de que a quantidade de material a ser inoculada deve ser mnima, caso contrrio, pode haver a
justaposio das colnias impossibilitando seu isolamento;
- Aps a semeadura, inverter as placas e incub-las a 30-37C, por 48 horas, ou temperatura ambiente por at
7 dias.

ESTRIAMENTO EM TUBOS DE ENSAIO

- Identifique dois tubos de ensaio contendo meio de cultura estril de acordo com o grupo, a data e o tipo de
amostra;
- Todo o procedimento deve ser feito prximo lamparina;
- Com uma ala previamente esterilizada, toque numa das colnias escolhidas da cultura com a ponta do ala e
semeie no tubo de Agar nutriente fazendo movimento de estria do fundo do tubo para sua superfcie, de acordo
com o mostrado anteriormente;
- Aps a semeadura, incubar os tubos a 30-37C, por 48 horas, ou temperatura ambiente por at 7 dias.

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AULA PRTICA II
ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS
I.INTRODUO
Os fungos so microrganismos unicelulares (leveduras) ou multicelulares (filamentosos), formados por clulas
eucariticas, podendo apresentar reproduo sexuada (forma teleomrfica), reproduo assexuada (forma
anamrfica), ou ambas. So aclorofilados, heterotrficos (quimiorganotrficos), portanto incapazes de realizar
fotossntese ou sintetizar a matria a partir de elementos simples. A nutrio dos fungos ocorre por absoro,
atravs da liberao de exoenzimas sobre o substrato, cujas molculas so quebradas em formas mais simples,
ocorrendo a absoro por qualquer parte do sistema vegetativo ou por estruturas especiais. Os fungos necessitam
de C, N, P, K, Ca e Mg, alm dos micronutrientes. De modo geral so aerbios (filamentosos), entretanto alguns
esto envolvidos nos processos fermentativos (leveduras). A temperatura de crescimento varia entre 0 a 35oC,
sendo a maioria mesfilos. O pH varia entre 3-8, mas normalmente toleram pH cido. Sob o ponto de vista
morfolgico, as formas filamentosas apresentam as clulas tubulares, denominadas de hifas, sendo o conjunto
de hifas denominadas de miclio. As hifas podem ser contnuas, simples ou ramificadas, sendo tambm no
septadas (cenocticas) ou septadas (apocticas) e constituem a estrutura somtica ou vegetativa dos fungos. A
estrutura reprodutiva normalmente corresponde aos esporos, com morfologia extremamente variada, de acordo
com a espcie. Quando isolados em meio de cultura apropriado os fungos formam colnias cujo crescimento
concntrico (crescimento em dimetro e indeterminado).
Os fungos exercem uma funo crtica importante e contnua no ambiente: reciclam a matria orgnica que muitas
vezes se constitui num poluente e/ou contendo nutrientes em formas no aproveitveis pelos outros organismos.
O fungo atua na matria viva (parasita, em humanos, animais ou plantas), na matria morta (saprfitos) ou na
matria viva inicialmente (biotrficos) e continua a decompor depois de morta (necrotrfico) ou ainda quando
parasita outros fungos (hiperparasita). Quando causa a morte do hospedeiro denomina-se de parasitide. Fungos
podem ser parasitas obrigatrios (no cultivado in vitro) ou facultativos (saprbios/ parasitas). Alguns fungos
podem formar associaes com plantas (micorrizas) ou com algas (lquenes) ou so utilizados como alimentos
(cogumelos) ou em processos biotecnolgicos e ou em biorremediao ambiental.
O isolamento de fungos em meio de cultura permite a obteno de culturas pura, pr-requisito para sua
caracterizao, identificao e utilizao em inmeras atividades cientficas e tecnolgicas, dependendo da
finalidade. Deve assim, nos seus aspectos mais simples e bsicos, ser de conhecimento dos estudantes de
graduao em Engenharia Ambiental e, portanto, ao final da prtica, os alunos devem ter adquirido habilidades
relacionadas ao procedimento de isolamento de fungos a partir de amostras ambientais: slidas e lquidas, pelo
mtodo de diluio em placas e em tecido vegetal necrosado, pelos mtodos de isolamento direto e indireto.

II.MATERIAIS
- Amostras ambientais (terrio e tecidos vegetais necrosados por fungos);
- Placas de Petri com o meio de cultura Sabouraud Dextrose gar + Antibiticos (SDA+A) (80 placas);
- A = Sulfato de estreptomicina e Cloranfenicol (250 mg de cada/litro de meio de cultura);
- Soluo de Hipoclorito de Sdio 1% (500 mL);
- Peneiras (duas); canetas vitrogrficas (duas); filme plstico transparente;

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- Tubos de ensaio, contendo o meio de cultura (SDA+A) (80 tubos); erlenmyers de 250 mL esterilizados (40);
pipetas de vidro esterilizadas, de 10 mL e de 5 mL (20 de cada); micropipeta para 100 L (ponteiras estreis).
- Pinas, estiletes metlicos de ponta fina, alas microbiolgicas descartveis, alas de Drigalski (rodinho),
lminas, lamnulas para microscopia e lactofenol (dois frascos com 50 mL);

III.METODOLOGIA
III.1.ISOLAMENTO A PARTIR DE TERRIO (MTODO DE DILUIO EM PLACAS)
01. Coletar cinco (5) subamostras de solo (terrio), fazer uma amostra composta, misturando rigorosamente,
peneirar e secar temperatura ambiente por 7 dias.
02. Retirar 5 g do solo seco ao ar, colocar em um erlenmyer de 250 mL, acrescentar 50 mL de gua destilada
esterilizada (diluio 1:10) e agitar em shaker durante 10 minutos, a 150 rpm (agitao mecnica).
03. Transferir, utilizando pipeta esterilizada, 10 mL da suspenso para 90 mL de gua esterilizada (diluio 1:100),
em erlenmyer de 250 mL, e agitar brevemente (agitao manual).
04. A partir da suspenso anterior (diluio 1:100), transferir 1 mL, utilizando pipeta esterilizada, para 100 mL de
gua destilada esterilizada (diluio 1:10.000 = 10-4) em um terceiro erlenmyer de 250 mL.
05. Transferir 0,1 mL da suspenso anterior (diluio 1:10.000 = 10-4), utilizando micropipeta com ponteira estril,
para o centro de uma placa de Petri contendo o meio de cultura SDA+A e espalhar com uma ala de vidro (ala
de Drigalski). Esta etapa deve ser realizada trabalhando prximo chama de um bico de Bunsen.
06. Proceder identificao da placa preparada (amostra, responsvel e data).
07. Aplicar uma fita de PVC, parafilme ou equivalente sobre toda a lateral da placa ou sobre toda a placa (para
evitar a desidratao rpida do meio). Incubar em BOD a 28C ou em condies ambientais de laboratrio
(bancada), em local reservado para tal, durante 7 dias.
08. Aps a incubao, para quantificao, contar as colnias fngicas desenvolvidas na placa e multiplicar o
nmero mdio de colnias pelo fator de diluio, obtendo-se o nmero por grama da amostra original.

III.2.ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE TECIDOS VEGETAIS NECROSADOS

III.2.1. ISOLAMENTO DIRETO
01. Selecionar tecido vegetal que apresente esporulao fngica sobre as leses (necroses), visveis olho nu
ou sob microscpio estereoscpico.
02. Pegar uma placa de Petri contendo o meio de cultura SDA+A e com caneta vitrogrfica marcar cinco pequenos
crculos equidistantes seu fundo.
03. Deslizar uma ala microbiolgica descartvel (esterilizada) sobre o local esporulado no tecido vegetal
necrosado e, em seguida, abrindo o mnimo possvel a placa de Petri, transferir o contedo (esporos fngicos)
para um dos crculos marcados. Repetir o procedimento para os demais crculos. Nesta etapa, todo o trabalho
deve ser conduzido prximo chama de um bico de Bunsen.
04. Proceder identificao da placa preparada (amostra, responsvel e data).
05. Aplicar uma fita de PVC, parafilme ou equivalente sobre toda a lateral da placa ou sobre toda a placa (para
evitar a desidratao rpida do meio).

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06. Incubar em BOD a 28C ou em condies ambientais de laboratrio (bancada), em local reservado para tal,
durante 7 dias.

III.2.1. ISOLAMENTO INDIRETO

01. Lavar, com gua de torneira, o tecido vegetal necrosado.
02. Cortar com bisturi, lmina de barbear inoxidvel ou tesoura, fragmentos vegetais correspondentes aos bordos
das leses necrticas do vegetal.
03. Colocar os fragmentos dentro de placa com hipoclorito de sdio a 1%, por 2 minutos.
04. Transferir, utilizando uma pina previamente flambada e resfriada, os fragmentos para uma placa de Petri
contendo gua destilada esterilizada (remoo do excesso de hipoclorito).
05. Transferir cinco fragmentos da placa com gua, para outra placa de Petri contendo o meio de cultura SDA+A,
distribuindo-os de forma pentagonal e distanciados de aproximadamente 2 cm dos bordos da placa. Esta etapa
deve ser trabalhada prximo chama de um bico de Bunsen.
06. Proceder identificao da placa preparada (amostra, responsvel e data).
07. Aplicar uma fita de PVC, parafilme ou equivalente sobre toda a lateral da placa ou sobre toda a placa (para
evitar a desidratao rpida do meio) incubando-a, em seguida, em BOD a 28C ou em condies ambientais de
laboratrio (bancada), em local reservado para tal, durante 7 dias.

IV.RESULTADOS
Expresse os resultados destas aulas prticas desenhando (nos crculos correspondentes) e nomeando (apontar
com setas) as estruturas fngicas observadas no microscpio. Abaixo do desenho de cada fungo, no caso do
Mtodo 1, coloque o nmero de colnias, expressando em unidades formadoras de colnia (UFC) por grama de
solo (UFC/g de solo). No caso dos Mtodos 2, abaixo de cada desenho, nomeie o fungo observado, no mnimo
ao nvel de gnero.

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Complemente respondendo as seguintes questes:

01. Qual a finalidade e como se classificam os meios de cultura utilizados para o cultivo de fungos em laboratrio?
02. O que uma cultura pura de um fungo e qual a sua importncia?
03. O que so condies asspticas de trabalho na manipulao de fungos em laboratrio? Cite exemplos de
como proceder neste sentido e a importncia destes procedimentos.
04. Qual o papel dos fungos no saneamento ambiental, com nfase em processos de biorremediao ao nvel do
solo? Cite exemplos.
05. Qual o papel dos fungos na produo e no armazenamento de produtos agrcolas e qual as conseqncias
ambientais decorrentes? Cite exemplos.

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AULA PRTICA III

DETECO DE INDICADORES DE POLUIO FECAL EM GUAS
(MTODO CROMOFLUOROGNICO)
I.INTRODUO
A gua, por possuir mltiplos usos, como abastecimento pblico, recreao, produo de energia, paisagismo e
etc, de fundamental importncia para a vida. A gua merece uma ateno especial, pois pode conter diferentes
contaminantes qumicos e ainda veicular diversos microorganismos, como vrus, bactrias, fungos e protozorios.
A deteco e quantificao de contaminantes e microrganismos em guas uma das formas de se avaliar a sua
qualidade, permitindo a sua caracterizao como apropriada ou no para os diferentes usos.
Podemos quantificar os microrganismos, em especial bactrias, de forma direta ou indireta. A forma direta de
quantificao a contagem em placa, e a indireta mais utilizada a tcnica do NMP (Nmero Mais Provvel). A
contagem de colnias em placas uma tcnica quantitativa direta aonde cada colnia crescida numa placa de
Agar corresponde a uma unidade formadora de colnia (UFC) proveniente do material. A tcnica do nmero mais
provvel um mtodo indireto de contagem em meio lquido, onde a partir de uma evidncia da presena de uma
bactria ou grupo de bactrias possvel se estimar o nmero mais provvel desta no material analisado. Dentre
os muitos microrganismos que podem ser quantificados incluem-se: contagem total de bactrias, coliformes,
Staphylococcus Bacillus, etc.
Como seria muito caro e trabalhoso avaliar diretamente todos os patgenos nas amostras de guas, uma
alternativa para a avaliao da qualidade sanitria da gua a pesquisa de bioindicadores, ou seja, organismos
no patognicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que quando
encontrados indicam a ocorrncia de contaminao fecal, evidenciando o risco da presena de patgenos. Fezes
humanas contm de 20-30% de resduos alimentares no digeridos, sendo o restante constitudo de gua e
bactrias. No indivduo saudvel essas bactrias constituem os habitantes normais do intestino, onde a
Escherichia coli a representante caracterstica. Assim, a presena de Escherichia coli em gua caracteriza a
contaminao fecal e indicativa da presena de patgenos entricos.
Ao final da prtica, os alunos devem ser capazes de realizar o mtodo cromofluorognico, identificar e quantificar
os indicadores de poluio fecal (E.coli e Coliformes totais) presentes em amostras de guas.

II.MATERIAIS

- Frascos para coleta de

amostras (higienizados)
- Frascos para diluio do meio
de cultura
- Mquina seladora de cartelas

- Meio de cultura para coliformes

- Incubadora

- gua destilada estril

- Lmpada UV

- Pipetas estreis

- Cartelas para colimetria

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III.METODOLOGIA
- Coletar amostras (gua, esgoto, etc.) utilizando frascos estreis;
- Com o auxlio de uma pipeta graduada, diluir serialmente as amostras coletadas para frascos de diluio
previamente preparados (10-1, 10-2, 10-3, etc.);
- Para amostras de esgotos pr tratados, diluir at 10-4. No caso de esgotos brutos (EB) fazer a diluio at 106.

Para gua mineral e gua de torneira, diluir s at 10-1;

- Adicionar 2,35 g do meio de cultivo MUG s trs ltimas diluies da srie e agitar at a solubilizao total do
meio;
- Identificar no verso de cada cartela a amostra, a diluio, a data e o nome da dupla. Em seguida, verter o
contedo de cada frasco para a cartela correspondente;
- Selar a cartela na seladora e incubar a 37 C, por 16-20 horas;
- Avaliar a colorao de cada poo nas cartelas. A cor amarela indica a presena de coliformes totais. Cartelas
com poos amarelos devem ser expostos radiao UV (lmpada UV porttil) para observar os poos com
fluorescncia indicando a presena de E.coli;
- Anotar o nmero de poos grandes e pequenos positivos para coliformes totais e E.coli;
- Utilizar a tabela, em anexo, para leitura do Nmero Mais Provvel (NMP) referente aos poos grandes x
pequenos. Este nmero deve ser multiplicado pelo fator de diluio utilizado;
- LEITURA FINAL: nmero de microrganismos (CT ou E.coli)/100 mL de amostra. Comentar este resultado frente
legislao pertinente.

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18

19

AULA PRTICA V
IDENTIFICAO DE BACTRIAS (MTODO DA COLORAO DE GRAM)
I.INTRODUO
A morfologia individual e as reaes colorimtricas constituem, em geral, os critrios preliminares para
identificao e posterior classificao das bactrias. O exame microscpico de um microrganismo , em geral,
suplementado com o uso de corantes, que alm de facilitar sua observao, permite a visualizao de
importantes estruturas. Porm, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado lmina, atravs de
secagem por simples exposio ao ar ou secagem na chama.
Os corantes so sais compostos por radicais inicos cromforos. Podem ser bsicos quando tem a cor do seu
on positivo ou cido, quando tem a cor do seu on negativo. A clula bacteriana negativamente carregada,
portanto, atrai corantes bsicos. Os corantes bsicos mais comuns so: cristal violeta, azul de metileno e a
safranina.
Existem inmeros mtodos para colorao, porm o mtodo de Gram o mtodo de colorao de bactrias mais
utilizado. Consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes:
cristal violeta, iodo, etanol-acetona e fucsina bsica. Est tcnica permite a separao de amostras bacterianas
em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia e do tamanho das bactrias observadas.
A colorao de Gram uma colorao diferencial, pois no cora todos os tipos de clulas igualmente. Aquelas
bactrias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta com o iodo coram-se em violeta (Gram
positivas), enquanto as que no retm o complexo coram-se em vermelho (Gram negativas) com a fucsina.
Ao final da prtica, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas aplicao da colorao de Gram,
identificao e diferenciao de bactrias gram-positivas e gram-negativas.

II.MATERIAIS
- Cristal Violeta

- Fucsina diluda 1:10

- Lminas

- Lugol (iodo ou iodeto de potssio)

- Cultura de bactrias

- Microscpio

- Mistura lcool-acetona

- Pipetas de Pasteur

20

- Alas de
semeadura

III.METODOLOGIA
III.1.PREPARO DE ESFREGAO A PARTIR DE MEIO SLIDO
- Colocar 1 gota de gua ou soluo fisiolgica sobre a lmina limpa.
- Atentando para as precaues de assepsia, tomar uma pequena poro da cultura com a ala estril.
- Espalhar a cultura na gota suficientemente para obter um esfregao fino.
- Secar a preparao ao ar ou na chama da lamparina.
- Deixar a lmina esfriar completamente para poder cor-la.

III.2.COLORAO
- Cobrir o esfregao seco e fixado com soluo de cristal violeta;
- Aps 1 minuto, lavar a lmina com gua destilada, em jato suave, deixando escorrer o cristal violeta;
- Cobrir a lmina com soluo de lugol e aguardar 1 minuto;
- Desprezar a soluo de lugol e lavar a lmina com gua destilada corrente;
- Inclinar a lmina e gotejar lcool-acetona 95% (agente descolorante) at que no haja desprendimento de
corante;
- Lavar a lmina rapidamente em gua corrente;
- Cobrir o esfregao com a soluo de fucsina e aguardar 30 segundos;
- Lavar a lmina rapidamente com gua, secar a temperatura ambiente;
- Examinar a preparao ao microscpio.

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22

AULA PRTICA VI
IDENTIFICAO DE BACTRIAS POR TESTES BIOQUMICOS
I.INTRODUO
Para identificar grupos ou espcies de bactrias ou leveduras, os microbiologistas investigam, por exemplo, as
atividades metablicas destes microrganismos in vitro. Os Testes, ou Provas, Bioqumicas servem para auxiliar
a identificao do microrganismo atravs da verificao das transformaes qumicas, que ocorrem na clula,
pela ao de suas enzimas. Como, muitas vezes, um microrganismo possui um sistema enzimtico especfico,
promovendo transformao bioqumica especfica, os testes bioqumicos podem ser utilizados na prtica para a
sua caracterizao.
Para a realizao dos testes bioqumicos necessrio utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a
ser analisado e fornecer ao microrganismo as condies nutritivas e ambientais necessrias ao seu
desenvolvimento. Sendo assim, aps a prtica, os alunos devem ter desenvolvido habilidades relacionadas
identificao de microrganismos por diferentes testes bioqumicos, alm de ter adquirido conhecimento sobre
alguns meios de cultivos especiais utilizados nestes testes.

II.MATERIAIS
- Ala de semeadura flambvel

- Tubos com meio para produo de H2S

- Lamparina

- Tira de papel com acetato de chumbo 10%

- Cultura da bactria a ser identificada

- Tubos com meio para reduo do nitrato

- Lminas de vidro

- Reagentes A e B de Griess-slova

- gua oxigenada

- Meio para formao de Indol

- Tubos com meio gelatina

- Reagente de kovacs

- Meio para Voges-Proskauer (VP)

- Meio para Vermelho de Metila (VM)

- Solues A e B para VP

- Indicador vermelho de metila

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III.METODOLOGIA
- Realizar os testes bioqumicos, de acordo com a tabela abaixo;
Testes bioqumicas

Reagente

Procedimento
Transferir algumas colnias da

Catalase

cultura para uma lmina de vidro e

gua oxigenada

pingar at 3 gotas da gua

oxigenada sobre a colnia;
Transferir uma colnia da cultura

Hidrolise da gelatina

Gelatina

para o meio mergulhando a ala

at o fundo do tubo;
Tranferir uma colnia para o meio
mergulhando a ala neste;

Produo de H2S

Tira de papel com acetato de chumbo 10%

Posicionar a tira de papel na

beirada do tubo, entre o algodo e
o vidro;

Reduo do nitrato

Reagentes de Griess-Slova

Indol (triptofanase)

Kovacs

Vermelho metila (VM)

Vermelho de metila em lcool etlico

Voges-Proskauer (VP)

Alfa naftol 5% em lcool absoluto

Transferir uma colnia para o meio

mergulhando a ala neste;
Transferir uma colnia para o meio
mergulhando a ala neste;
Transferir uma colnia para o meio
mergulhando a ala neste;
Transferir uma colnia para o meio
mergulhando a ala neste;
Transferir uma colnia para o meio

Citrato

Citrato

pela tcnica de estriamento em

tubo;

Lactose
Glicose
- Inocular as bactrias nos diferentes meios de cultura e incubar por 24 horas. Observar o crescimento das
bactrias e discutir os resultados utilizando a tabela de identificao em anexo.

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AULA PRTICA VII

DESINFECO MICROBIANA COM AGENTES FSICOS E QUMICOS
PARTE 01 DESINFECO COM AGENTES FSICOS
I.INTRODUO
A condio sanitria da populao humana determinada, em larga escala, por sua capacidade de controlar
populaes microbianas de forma eficiente. Toda a forma de preveno de transmisso de doenas,
contaminao por microrganismos nocivos ou deteriorao e danos de materiais por microrganismos esto
diretamente associados aos processos especficos ou gerais de prticas sanitrias de assepsia.
Os microrganismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes fsicos ou qumicos. Uma grande
variedade de tcnicas e de agentes pode ser utilizada, agindo de modos diferentes e tendo seu prprio limite de
aplicao prtica. As tcnicas de esterilizao, por exemplo, promovem a eliminao ou destruio completa das
formas de vida de todos os microrganismos presentes em determinado material ou ambiente. Mesmo aqueles
que apresentam formas de resistncia denominadas esporos, podem ser totalmente destrudos tornando os
materiais ou ambientes estreis. Porm na maioria das atividades, o que se exige a aplicao de prticas
sanitrias de desinfeco. Os diferentes processos de desinfeco no tm o objetivo de tornar os ambientes ou
os materiais estreis, mas sim, eliminar a sua potencialidade infecciosa.
Os processos de desinfeco que utilizam agentes fsicos so os mais comuns, devido ao baixo custo e no
formao de produtos txicos. O calor e a radiao ultravioleta so os principais exemplos. O calor, em geral,
acima da temperatura ideal de crescimento, promove a desnaturao de protenas estruturais e enzimas, levando
perda da integridade celular e, consequentemente, morte. J a radiao ultravioleta capaz de provocar os
mesmos efeitos finais, porm sua ao se d em nvel do material gentico celular, provocando a destruio das
molculas de DNA.
Ao final da prtica, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas aplicao de mtodos de
esterilizao e desinfeco fsica e avaliao do crescimento microbiano sobre a ao do calor e da luz
ultravioleta.

II.MATERIAIS
- Tubos esterilizados

- Banho-maria

- Ponteiras esterilizadas

- Pipetas esterilizadas

- Placas com gar

- Pipetador automtico

- Tubos contendo meio A1 + E. coli

- Ala de Drigalski

III.METODOLOGIA
III.1.TESTE DE AO DO CALOR SOBRE BACTRIAS
- Identificar 2 tubos esterilizados e 3 placas contendo meio A1+gar com o nome do grupo, data e condio de
teste;
- Adicionar 2,0 mL de cultura de bactrias (Escherichia coli) a cada tubo e submet-los aos seguintes tratamentos:

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TUBO 1: colocar durante 10 minutos em banho maria a 600C, retirar uma alquota de 0,1mL, aplicar na superfcie
de uma placa contendo meio A1 + Agar, espalhar a suspenso bacteriana por toda a superfcie da placa com
uma ala de Drigalski e incubar a placa invertida por 24 h a 370C;
TUBO 2: colocar durante 10 minutos em banho maria a 1000C, retirar uma alquota de 0,1mL, aplicar na superfcie
de uma placa contendo meio A1 + Agar, espalhar a suspenso bacteriana por toda a superfcie da placa com
uma ala de Drigalski e incubar a placa por 24 h a 370C;
TUBO 3 (CONTROLE POSITIVO): Retirar uma alquota de 0,1mL da cultura inicial, aplicar na superfcie de uma
placa contendo meio A1 + Agar e espalhar por toda a superfcie da placa com uma ala de Drigalski. Incubar a
placa por 24 h a 370C.

III.2.TESTE DE AO DA LUZ UV SOBRE BACTRIAS

- Identificar 3 placas contendo meio A1+gar com o nome do grupo, data e condies de teste;
- Retirar alquotas de 0,1mL de tubos de cultura de bactrias (Escherichia coli), aplicar na superfcie das placas
e espalhar com uma ala de vidro.
- Expor as placas sob a luz UV da seguinte forma:
- Colocar as trs placas dentro do fluxo laminar, ascender a lmpada UV.
- Retirar uma placa aps 5, 15 e 30 minutos de exposio.
- Incubar todas as placas por 24 horas a 37C.

PARTE 02 DESINFECO COM AGENTES QUMICOS

I.INTRODUO
Os agentes qumicos so utilizados para controlar o crescimento de microrganismos tanto em tecidos vivos com
em objetos inanimados. Em caso de materiais sensveis ao calor, como, por exemplo, bolsas de sangue para
transfuso, seringas plsticas descartveis, entre outros, alguns agentes qumicos especiais so utilizados e
denominados de esterilizantes qumicos. Porm a maioria dos agentes qumicos somente reduz a populao
bacteriana, sendo mais utilizados em processos sanitrios de desinfeco e anti-sepsia.
Os principais grupos de agentes qumicos desinfetantes e anti-spticos aplicados no controle de microrganismos
so os lcoois, halognios (iodo e cloro) e detergentes. Os lcoois (etlicos, isoproplicos, combinados com iodo)
so utilizados, em geral, na concentrao de 70% por 10 minutos, para a anti-sepsia da pele e desinfeco de
superfcies. Quando combinados com o iodo (0,5 a 20%), os lcoois tm seu poder de penetrao na parede
celular elevado, potencializando as suas aes anti-spticas. Os halognios so representados principalmente
pelos compostos clorados (ex: hipocloritos 0,5 a 20 g/L de cloro livre) e agem a nvel celular, desnaturando
protenas e enzimas e inativando os cidos nuclicos. So utilizados na desinfeco de gua, superfcies em
geral, equipamentos de laticnios, restaurantes e domsticos. J os detergentes com suas aes tensoativas,
umectante e emulsionante, causam transformaes em protenas e lipdeos, desestabilizando a membrana e
desnaturando as protenas microbianas.

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Ao final da prtica, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas aplicao de mtodos de
esterilizao e desinfeco qumica e avaliao do crescimento microbiano sob a ao de solues de lcool
70%, hipoclorito de sdio e detergente.

II.MATERIAIS
- Tubos esterilizados

- Ponteiras esterilizadas

- Ala de Drigalski

- lcool 70%

- Pipetas esterilizadas

- Pipetador automtico

- Detergente

- lcool 92%

- Placas com gar + meio

- Tubos contendo A1 +

- Hipoclorito

- Hipoclorito 1:100

A1

Escherichia coli

III. METODOLOGIA
- Teste da eficcia antissptica dos agentes qumicos sobre as bactrias.

III.1. LCOOL 70% e 92%

- Identificar uma placa contendo meio A1 + gar com o nome do grupo, data e condies de teste;
- Adicionar 5,0 mL de lcool na concentrao escolhida em um tubo de ensaio e adicionar 0,5 mL da cultura;
- Aps 10 minutos, retirar 0,1 mL do tubo, adicionar placa contendo meio A1+Agar, espalhar as clulas com
uma ala de Drigalski e incubar as placas a 37o C por 24h;

III.2. HIPLOCLORITO DE SDIO (GUA SANITRIA) CONCENTRADA E DILUDA 1:100

- Identificar 2 placas contendo meio A1 + gar com o nome do grupo, data e condies de teste;
- Adicionar 5,0 mL da concentrao escolhida de hipoclorito em um tubos de ensaio esterilizado e adicionar uma
alquota de 0,5 mL da cultura. Aps 2 minutos, retirar 0,1 mL do tubo e adicionar placa contendo meio A1+Agar.
Espalhar as clulas com uma ala de Drigalski e incubar as placas a 37o C por 24h;
- Repetir todo o procedimento aps 10 minutos.

III.3. DETERGENTE
- Adicionar 5,0 mL de detergente em um tubo de ensaio, adicionar uma alquota de 0,5 mL da cultura. Aps 2
minutos, retirar 0,1 mL de cada tubo, adicionar em uma placa contendo meio A1+Agar. Espalhar a suspenso
bacteriana com uma ala de vidro e incubar as placas a 37o C por 24h;
- Repetir todo o procedimento aps 15 minutos.

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AULA PRTICA VIII

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS TSA (Antibiograma)
I.INTRODUO
O teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) ou antibiograma determina o perfil de sensibilidade do
microrganismo a uma determinada droga. Normalmente indicados para organismos patognicos, o TSA
utilizado para selecionar a droga mais eficiente no tratamento, uma vez que o sucesso na teraputica
antimicrobiana de uma infeco bacteriana depende da sensibilidade do agente droga utilizada.
A seleo dos antimicrobianos para a realizao dos antibiogramas de rotina deve seguir alguns princpios. Um
deles baseia-se no reconhecimento de que alguns agentes antimicrobianos podem ser agrupados em classes,
devido ao seu espectro de atividade. Assim, um s representante de classe necessita ser testado, a no ser
quando dentro de uma mesma classe de antimicrobianos no exista a possibilidade de equivalncia.
Uma bactria considerada sensvel a um antimicrobiano quando o seu crescimento inibido, in vitro, por uma
determinada concentrao. Esta concentrao inibitria do antimicrobiano pode ser determinada direta ou
indiretamente. A determinao direta feita pelos chamados mtodos da diluio, e, a indireta, pelo mtodo de
difuso em placa com discos impregnados com as drogas.
No mtodo de diluio, meios com concentraes variadas do antibitico, obtidas por diluio, so inoculados
com o microrganismo. A menor concentrao que evita o crescimento aps a incubao de 12 a 24 horas a
concentrao inibitria mnima. No mtodo de difuso, discos de papel impregnados com o antibitico so
colocados uniformemente na superfcie do meio slido semeado com o microrganismo. Aps a aplicao formase um gradiente de concentrao pela difuso do antibitico a partir do disco, com consequente inibio do
crescimento do microrganismo sensvel ao antibitico. Devido sua simplicidade e por poderem ser realizados
rapidamente, os mtodos de difuso com disco tm preferncia sobre os de diluio para os testes de rotina.
A prtica pretende desenvolver nos alunos a habilidade em avaliar o perfil de susceptibilidade de microrganismos
Gram-positivos e Gram-negativos s drogas antimicrobianas. A presena ou ausncia de crescimento da amostra
bacteriana em torno dos discos interpretada como resistncia ou sensibilidade do microrganismo ao
antimicrobiano. Os halos so medidos e comparados com valores padronizados pelo CLSI Chemical Laboratory
and Standards Institute.

II.MATERIAIS
- Swab estril

- Pina de ao

- Discos impregnados com antimicrobianos

- Tubos com suspenso de bactrias em salina
- Placas contendo gar Muller Hinton estreis

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III.METODOLOGIA
III.1. PREPARO DO INCULO (MTODO DA SUSPENSO DIRETA)
- Em um tubo de ensaio contendo 3 mL da soluo salina esterilizada, foram suspensas 3 colnias de mesma
morfologia, retiradas da cultura de bactrias, com ala estril;
- A turbidez da suspenso foi ajustada gotejando-se salina at o ponto 0,5 da escala de MacFarland.

III.3. INOCULAO NAS PLACAS

- Identificar as placas de petri, contendo meio slido, com a data e o nome ou iniciais dos alunos;
- Proceder a semeadura introduzindo um swab estril na suspenso bacteriana e eliminar o excesso de lquido
por compresso na parede do tubo, em at 15 min aps o preparo do inculo. Espalhar o inculo uniformemente
(trs direes diferentes), de modo a cobrir toda a superfcie do gar;
- Aguardar de 5 a 15 minutos, temperatura ambiente, para que o inculo seja completamente absorvido pelo
gar antes de aplicar os discos.

III.4. APLICAO DOS DISCOS

- Com uma pina flambada e resfriada, retirar um disco de antimicrobiano do frasco, abrir a placa prximo
lamparina, colocar o disco e comprimi-lo gentilmente contra o gar para que fique aderido superfcie;
- Tomar nota dos antibiticos tambm pelo cdigo impresso na superfcie dos discos.

III.5. INCUBAO DAS PLACAS

- Aguardar por at 15 minutos aps aplicao dos discos e incubar as placas invertidas por 16 a 18 horas a 35C.

III.6. LEITURA E INTERPRETAO DAS PLACAS

- Aps o tempo de incubao, verificar a presena de halos ao redor dos discos de antimicrobianos. Medir o
dimetro dos halos de inibio do crescimento bacteriano e anotar os resultados. Comparar os resultados obtidos
com a tabela de sensibilidade.

AULA PRTICA IX
ENSAIOS ECOTOXICOLGICOS COM BACTRIAS Vibrio fischeri
I.INTRODUO
O monitoramento da poluio especialmente em ambientes aquticos pode ser realizado pelos parmetros
tradicionais, Turbidez, DBO, DQO, Nitrognio, Fsforo, alm dos parmetros microbiolgicos como, por exemplo,
a avaliao de coliformes totais (mtodo cromofluorognico). Em alguns casos, alm da poluio, pretende-se
avaliar a presena de contaminantes que, em geral, apresentam toxicidade ao meio ambiente. A avaliao da
toxicidade realizada por ensaios ou testes toxicolgicos. H, essencialmente, dois tipos de testes ecotox: testes
agudos e testes crnicos. Para testes agudos mais frequentemente utiliza-se microcrustceos (Daphnia) ou
bactrias luminescentes (Vibrio fischeri) com o analisador Microtox 500.
Os ensaios no Microtox 500 consistem em testes de toxicidade aguda de simples execuo baseados na anlise
da luminescncia emitida pelas bactrias (Vibrio fischeri) em amostras com diferentes diluies. O analisador de
toxicidade Microtox 500 um fotmetro controlador de temperatura que mantm as condies adequadas de
ensaios para os reagentes e as amostras (aproximadamente 15C). O sistema calibrado para registrar a
luminescncia emitida por bactrias, sendo um teste rpido (15 min.). A partir da diferena entre as intensidades
de luminescncia de cada amostra diluda atribuda a toxicidade amostra.
Ao final da prtica, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas aplicao do mtodo de anlise
toxicolgica aguda, utilizando bactrias Vibrio fischeri, alm de ser capaz de avaliar os efeitos toxicolgicos a
partir dos resultados obtidos na anlise no Microtox 500.

II.MATERIAIS
- Reagentes para Microtox 500: Soluo Diluente, Soluo de Ajuste osmtico (OAS), Reagente de reconstituio
para bactria e Bactria Vibrio fischeri liofilizada.
- Tubos, micropipetas e ponteiras estreis.

III.METODOLOGIA
- Ligar o equipamento cerca de 20 minutos antes de iniciar o teste para estabilizar a temperatura.

III.1.PREPARO DA AMOSTRA
- Medir os seguintes parmetros da amostra: pH, turbidez, salinidade e oxignio dissolvido (OD).
Teste de pH: entre 6,0 e 8,5 (se o pH estiver fora ajustar para 70,2 com HCl 1N ou NaOH 1N, porm a sol.
adicionada no pode exceder 5% do volume total da amostra)
Turbidez: limite 100 NTUs
Salinidade: mnima de 20g/L de NaCl
OD: maior que 0,5 mg/L

III.2.ENSAIO TOXICOLGICO
- Escolher a opo Basic test no software Microtox OMNI (duas amostras com quatro diluies cada).
- Posicionar as cubetas no termobloco;

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- Adicionar 1,0 mL do reagente de reconstituio na posio reagent well;

- Adicionar 500 L de soluo diluente nas cubetas B1 - B5 e D1 D5;
- Adicionar 1,0 mL de soluo diluente nas cubetas A1 - A4 e C1 C4;
- Adicionar 250 L de soluo OAS + 2.500 L da amostra 01 em A5 e da amostra 02 em C5;
- Misturar e depois descartar 750 L das cubetas;
- Fazer uma diluio seriada (1:2) transferindo 1,0 mL:
- A5 para A4; A4 para A3; A3 para A2
- C5 para C4; C4 para C3, C3 para C2
- Descartar 1,0 mL de A2 e 1,0 mL de C2;
- Esperar 5 minutos

III.2.1.REATIVAO DA BACTRIA
- Retirar a ampola com a bactria liofilizada do congelador;
- Abrir a ampola com o mnimo de manuseio para no alterar a temperatura;
- Transferir o reagente de reconstituio pr-resfriado da posio reagent well para a ampola;
- Misturar utilizando a micro pipeta, retornar a soluo para a cubeta e posicion-la no reagent well.
- Transferir 10 L da cubeta para B1 a B5; e D1 a D5;
- Esperar 15 minutos
- Colocar a cubeta B1 na posio de leitura e pressionar o boto SET e verificar a fluorescncia;
- Pressionar START no programa Microtox OMNI para iniciar a sequncia de leituras do teste e seguir as
instrues indicadas na tela;
- Colocar a cubeta em destaque na tela na cavidade de leitura e pressionar o boto READ;
- Fazer a leitura das cubetas B1 a B5 e D1 a D5;
- Aps as leituras transferir imediatamente as amostras de:
- A1 para B1; A2 para B2; ........ A5 para B5;
- C1 para D1; C2 para D2; ........ C5 para D5
- Pressionar START para iniciar a contagem do tempo

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- Quando chegar a 5 minutos realizar a leitura das cubetas B1 a B5 e D1 a D5 novamente;

- Repetir esse passo depois, quando a contagem atingir 15 minutos.

III.2.2.LEITURA E INTERPRETAO DAS LEITURAS

- Tabela de leitura da luminescncia em cada diluio nos tempos 0, 5 e 15 minutos. Preencher com os valores
obtidos no teste.

AMOSTRA

1=

2=

Amostra 01

Amostra 02

Diluies

Diluies

3=

4=

1=

2=

3=

4=

T0
T5
T15
EC50

- O que significam os valores de EC50 em relao ao efeito txico das amostras? Qual das amostras apresenta
maior toxicidade?

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