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BIOLOGIA CELULAR
E MOLECULAR
MTODOS EXPERIMENTAIS
NO ESTUDO DE PROTENAS
Editores
Helene Santos Barbosa
Milton Ozorio Moraes
Rubem Figueiredo Sadok Menna Barreto
Coordenadores
Fernando Ariel Genta
Richard Hemmi Valente
Autores
Caroline da Silva Moraes
Francisco Odencio Rodrigues de Oliveira Junior
Gustavo Masson
Karina Mastropasqua Rebello
Lvia de Oliveira Santos
Narayana Fazolini P. Bastos
Rozana Crte-Real Faria
Revisores
Andr Teixeira da Silva Ferreira
Claudia Masini dAvila-Levy
Daniela Gois Beghini
Luciana Pizzatti Barboza
Magno Rodrigues Junqueira
Projeto Grfico e Capa
Simone Oliveira
CDD: 571.6
Caroline S. Moraes
Francisco O. R. Oliveira Junior
Gustavo Masson
Karina M. Rebello
Lvia O. Santos
Narayana F. P. Bastos
Rozana C. R. Faria
SRIE EM
BIOLOGIA CELULAR
E MOLECULAR
MTODOS EXPERIMENTAIS
NO ESTUDO DE PROTENAS
1 edio
Rio de Janeiro
IOC - Instituto Oswaldo Cruz
Apresentao coleo
Os cursos de frias no Instituto Oswaldo Cruz surgiram com o objetivo de oferecer aos
estudantes de graduao a oportunidade de estudar em uma Instituio de Pesquisa de excelncia, abordando em profundidade temas incomuns grade curricular da universidade.
Agregado a este objetivo principal, a formatao desse curso permitiria o trnsito e vivncia dos estudantes no ambiente cientfico dos diferentes laboratrios do IOC. Alm disso, a
possibilidade de estimular os estudantes de ps-graduao do IOC a desenvolvem atividades didticas terico-prticas, preencheria tambm uma lacuna importante na formao
dos mestres e doutores da nossa instituio que no possui cursos de graduao.
A ideia surgiu em 2007, e desde sua primeira edio, os cursos de frias do IOC versam
sobre temas relevantes da rea de pesquisa em sade no Brasil. De 2007 a 2012, foram realizadas 11 edies dos Cursos de Frias, nas verses vero e inverno, tendo sido oferecidas
as mais variadas disciplinas, coordenadas por mais de 50 pesquisadores do IOC, envolvendo centenas de mestrandos e doutorandos e mais de 1.000 alunos oriundos de dezenas de
universidades de todo o pas.
Desde o incio, um estmulo adicional aos professores do curso foi o desenvolvimento
de material didtico original para servir de apoio s aulas tericas e prticas. O resultado
desse esforo coletivo se traduz nesta coleo. Os textos foram desenvolvidos em linguagem simples e objetiva e contedo inovador, abordando temas transversais em biocincias.
Assim, desenvolvemos fascculos para a formao de jovens cientistas na vanguarda do conhecimento em reas que apresentam hibridismo e multidisciplinaridades absolutamente
cruciais para o desenvolvimento cientfico e tecnolgico do pas.
Estamos convencidos de que este material permitir aos leitores acesso rpido e fcil a
contedos no abordados durante a graduao, alm de possibilitar a integrao de atividades didticas e o estmulo redao cientfica entre ps-graduandos do IOC. Boa leitura.
Helene S. Barbosa
Milton O. Moraes
Rubem F. S. Menna-Barreto
Sumrio
INTRODUO BIOQUMICA DE PROTENAS....................................................................................... 8
1.1. Introduo.....................................................................................................................................................................................9
1.2. Aminocidos ..............................................................................................................................................................................9
1.2.1. Classificao................................................................................................................................................................... 11
1.2.1.1. Essenciais e no essenciais........................................................................................................................ 11
1.2.1.2. Cadeia lateral.................................................................................................................................................... 11
1.2.1.2.1. Aminocidos com cadeias laterais apolares e alifticas.............................................. 11
1.2.1.2.2. Aminocidos com cadeias laterais aromticas............................................................... 12
1.2.1.2.3. Aminocidos com cadeias laterais polares no carregadas..................................... 12
1.2.1.2.4. Aminocidos com cadeias laterais carregadas negativamente (cidos)........... 12
1.2.1.2.5. Aminocidos com cadeias laterais carregadas positivamente (bsicos).......... 12
1.3. Protenas....................................................................................................................................................................................14
1.3.1. Funes.............................................................................................................................................................................14
1.3.1.1. Protenas Estruturais....................................................................................................................................14
1.3.1.2. Enzimas...............................................................................................................................................................14
1.3.1.3. Protenas Transportadoras....................................................................................................................... 15
1.3.1.4. Protenas reguladoras................................................................................................................................. 15
1.3.2. Classificao................................................................................................................................................................. 15
1.3.2.1. Composio...................................................................................................................................................... 15
1.3.2.2. Forma...................................................................................................................................................................16
1.3.3. Nveis de organizao estrutural das protenas..........................................................................................16
1.3.4. Foras envolvidas no enovelamento de protenas....................................................................................18
1.4. Mtodos de quantificao de protenas....................................................................................................................19
1.4.1. Mtodo do biureto (Sensibilidade 0,5 a 10 mg por mL)........................................................................20
1.4.2. Mtodo de Folin-Lowry (Sensibilidade 0,1 a 0,3 mg por mL)............................................................. 21
1.4.3. Mtodo de BCA (Sensibilidade 0,1 a 0,5 mg por mL)............................................................................. 21
1.4.4. Mtodo de Bradford (Sensibilidade 0,06 a 0,3 mg por mL).............................................................. 21
ENZIMOLOGIA: ENSAIOS ENZIMTICOS..............................................................................................24
2.1. Introduo................................................................................................................................................................................. 25
2.2. Enzimas..................................................................................................................................................................................... 25
2.3. Nomenclatura enzimtica................................................................................................................................................28
2.4. Cofatores.................................................................................................................................................................................29
2.5. Reao enzimtica...............................................................................................................................................................30
2.6. Ensaios enzimticos........................................................................................................................................................... 32
2.7. Inibio enzimtica..............................................................................................................................................................39
2.8. Concluso.................................................................................................................................................................................40
INTRODUO
BIOQUMICA
DE PROTENAS
Francisco Odencio Rodrigues de Oliveira Junior
Cap. 1
1.2. Aminocidos
Dentre os inmeros aminocidos presentes na natureza, apenas 22 so considerados
proteinognicos. Os aminocidos proteinognicos so aqueles que podem ser encontra-
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dos como constituintes de protenas e que tenham sido incorporados molcula protica pelo maquinrio celular em funo da existncia de cdon especificado no RNA mensageiro. Logo, aminocidos gerados pela modificao ps-traducional da molcula protica no so considerados proteinognicos. Dentre os 22 aminocidos proteinognicos,
selenocistena e pirrolisina ocorrem apenas em procariotos, apresentam mecanismo de
incorporao molcula protica especficos e so pouco abundantes. Por isso, no sero abordados neste texto. Aminocidos proteinognicos so molculas orgnicas tambm conhecidas como aminocidos do tipo alfa. Neste tipo de molcula, o carbono alfa
est ligado a um grupamento amino (-NH2), um grupamento de cido carboxlico (-COOH),
uma cadeia lateral variada e um hidrognio. As cadeias laterais variam de acordo com
suas estruturas, tamanho e carga eltrica, fatores que iro influenciar na solubilidade
dos aminocidos em gua.
Em todos os aminocidos, exceto glicina, o carbono alfa assimtrico (quiral ou oticamente ativo), ou seja, apresenta um arranjo tetradrico com quatro grupos substituintes diferentes que podem ocupar disposies espaciais distintas, as quais so entre si
imagens especulares no superponveis (estereoismeros). Esta caracterstica faz com
que molculas que contenham centros quirais tenham atividade tica, ou seja, a propriedade de desviar a luz plano-polarizada, sendo a direo desta rotao diferente para as
duas formas. A classificao e nomenclatura dos estereoismeros foram baseadas em
um composto de referncia, o gliceraldedo, atravs de anlises por difrao de raios-X.
Desta forma, as configuraes relacionadas quelas do L-gliceraldedo e do D-gliceraldedo so designadas pela letra L e D, respectivamente (do latim laevus que significa
esquerda e dexter que significa direita). Assim, os dois estereoismeros dos aminocidos so designados por L e D aminocidos (Figura 1.1) em funo da sua semelhana
com o padro gliceraldedo. Os aminocidos que compem as protenas so sempre
L-estereoismeros.
Figura 1.1.
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Cap. 1
1.2.1. Classificao
1.2.1.1. Essenciais e no essenciais
Essenciais, ou indispensveis, so os aminocidos que o organismo humano no tem a capacidade de sintetizar. Assim, estes devem ser obrigatoriamente ingeridos atravs de alimentos. Logo, a alimentao deve ser a mais
variada possvel para que o organismo obtenha uma diversidade maior destes
aminocidos. A carne, o leite e o ovo so as principais fontes destes aminocidos. Por outro lado, aminocidos no-essenciais, ou dispensveis, so os que
nosso organismo pode sintetizar.
Aminocidos
Essenciais
Arginina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Treonina
Triptofano
Valina
No-Essenciais
Alanina
Aspargina
cido Asprtico
Cistena
cido Glutmico
Glutamina
Glicina
Prolina
Serina
Tirosina
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Cap. 1
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1.3. Protenas
Protenas so as macromolculas mais abundantes presentes em todos os sistemas vivos. Elas representam cerca de 50 a 80% do peso seco das clulas. As protenas
so compostas por uma combinao de at 22 aminocidos e apresentam uma grande
variedade estrutural devido ao nmero expressivo de possibilidades de sequncias de
aminocidos. Em teoria, um decapeptdeo (peptdeo composto por 10 aminocidos)
poderia apresentar 2,2x1011 (220 trilhes) de sequncias (arranjos) diferentes com o
mesmo nmero de resduos de aminocidos na molcula.
Mas como os aminocidos so capazes de formar protenas? Os aminocidos apresentam a capacidade de formar ligaes covalentes entre os grupos amino (NH2) de um
aminocido e carboxlico (COOH) de outro, reao que catalisada por um conjunto de
enzimas, formando as chamadas ligaes peptdicas. Assim, eles originam cadeias polipeptdicas que ao atingirem uma certa extenso (cerca de 50 resduos) recebem o nome
de protena.
1.3.1. Funes
Por apresentarem uma grande variedade estrutural, as protenas desempenham uma srie de funes biolgicas e podem ser agrupadas de acordo
com essas funes.
1.3.1.2. Enzimas
um grupo altamente variado e especializado de protenas que exibe
atividade cataltica. Dentre as protenas com funes enzimticas podemos citar, entre outras, quinases, amilases, lipases e isomerases.
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Cap. 1
1.3.2. Classificao
1.3.2.1. Composio
Muitas protenas so constitudas apenas por uma cadeia de aminocidos, no apresentando nenhum outro grupo qumico. Estas so consideradas protenas simples. Entretanto, existem outras protenas que alm
dos aminocidos apresentam outros componentes qumicos e so chamadas de protenas conjugadas. A parte no aminoacdica de uma protena conjugada chamada de grupo prosttico. As protenas conjugadas
so classificadas de acordo com a natureza de seus grupos prostticos,
onde lipoprotenas contm lipdeos, glicoprotenas contm molculas
de acar e metaloprotenas contm um metal especfico. Normalmente
este grupo prosttico ir desempenhar um papel importante na funo
da protena.
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1.3.2.2. Forma
Protenas globulares
A cadeia polipeptdica enovela-se de maneira compacta, resultando
em uma molcula esfrica e globular; so geralmente solveis em gua
e desempenham diversas funes. Ex: enzimas, albumina, globulinas, hemoglobina.
Protenas fibrosas
A cadeia polipeptdica arranjada em forma de longos cordes ou em
forma de folhas; so geralmente insolveis em gua. Ex: actina, tubulina,
colgeno e -queratina.
Figura 1.3. Representao dos quatro nveis de organizao estrutural das protenas.
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Cap. 1
Estrutura primria A sequncia linear dos aminocidos unidos por ligaes peptdicas determina a estrutura primria das protenas. Esta estrutura resulta em uma longa
cadeia de aminocidos, com uma extremidade amino terminal (NH2) e uma extremidade
carboxi terminal (COOH). Sua estrutura primria pode ser desfeita atravs de hidrlise
qumica ou enzimtica das ligaes peptdicas, gerando peptdeos ou aminocidos livres. Esta sequncia primria contm toda a informao necessria para que a protena
se enovele alcanando sua conformao nativa.
Estrutura secundria - Refere-se ao dobramento regular de regies da cadeia polipeptdica. Os dois tipos mais comuns de estrutura secundria so: alfa-hlice e folha
beta-pregueada (Figura 1.4). As estruturas em alfa-hlice apresentam-se em aspecto
cilndrico com arranjo helicoidal dos aminocidos, que mantido pelas ligaes de hidrognio paralelas ao eixo da hlice. Nas estruturas em folha beta-pregueada, as ligaes de
hidrognio formam-se entre as regies adjacentes do polipeptdeo que esto na mesma
direo (paralelas) ou em direes opostas (antiparalelas).
Figura 1.4. Representao esquemtica de estruturas secundrias. (A) alfa-hlice e (B) folha
beta-pregueada.
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Cap. 1
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A anlise quantitativa feita tendo como base a lei de Lambert-Beer. A lei de Lambert
estabelece que a diminuio da intensidade de um feixe de luz monocromtica, em funo da espessura do meio absorvente atravessado, proporcional intensidade do feixe
incidente, ou seja: a quantidade de luz diminui em progresso geomtrica (exponencial) e
no aritmtica. Adicionalmente, a lei de Beer estabelece que a energia deste feixe luminoso decresce de maneira exponencial quando aumenta a concentrao do soluto presente no meio absorvente.
A seguir abordaremos alguns dos mtodos colorimtricos mais comumente utilizados para quantificao de protenas.
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Cap. 1
Referncias
Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D. (2004) Biologia Molecular da Clula. Porto Alegre. Editor Artes Mdicas Sul Ltda, 4a ed.
Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry. 72:248-254.
Gornall, A.G., Bardawill, C.J., David, M.M. (1949) Determination of serum proteins by
means of the biuret reaction. Journal of Biological Chemistry. 177: 751-766.
Lehninger, A.L., Nelson, D.L., Cox, M.M. (2003) Princpios de Bioqumica. Ed. Sarvier
4 ed.
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951) Protein measurement with
the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193(1):265-275.
Sapan, C.V., Lundblad, R.L., Price, N.C. (1999) Colorimetric protein assay techniques.
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Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., et
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Stryer, L. (1998). Bioqumica. Guanabara Koogan, 4 ed.
Zaia, D.A.M., Zaia, C.T.B.V., Lichtig, J. (1998) Determinao de protenas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Quimica Nova.
; 21(6):787-793.
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ENZIMOLOGIA:
ENSAIOS
ENZIMTICOS
Caroline da silva Moraes
Lvia de oliveira Santos
Cap. 2
2.2. Enzimas
As enzimas foram descobertas no sculo XIX por uma srie de pesquisadores, incluindo Pasteur. Este, ao observar a fermentao do acar em lcool pelas leveduras,
concluiu que tal fenmeno era catalisado por fermentos (as enzimas), que seriam inseparveis da estrutura das clulas vivas do levedo ( en = dentro; zima= levedura, logo,
enzima= dentro da levedura).
As enzimas esto presentes nos tecidos e rgos dos mais variados seres vivos, desde vrus at eucariotos superiores como o homem, onde participam de diversos mecanismos biolgicos. So consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular, pois
so especializadas na catlise de reaes biolgicas. Praticamente todas as reaes que
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Cap. 2
O primeiro modelo prope a alta similaridade entre enzima e substrato, onde o substrato possui a forma complementar ao stio cataltico da enzima (Figura 2.1), como uma
chave na fechadura ou uma pea de quebra-cabea. Atualmente, este modelo de ligao
vem sendo substitudo pelo segundo modelo j que a hiptese chave-fechadura no leva
em considerao a flexibilidade da estrutura tridimensional da protena.
Por sua vez, o modelo do encaixe induzido assume que o stio de ligao da enzima possui sua estrutura tridimensional no complementar ao substrato (Figura 2.2). Somente no
momento de ligao do substrato ocorre a induo de uma mudana conformacional na
enzima permitindo o direcionamento do substrato aos grupos catalticos da mesma.
Aps a formao do complexo enzima-substrato, ocorre a quebra de ligaes ou a
formao de novas ligaes qumicas que culminaro na transformao do substrato em
produto. Aps a catlise, o produto liberado pela enzima e essa, que pode dar incio a
outro ciclo de catlise.
Figura 2.2. Modelo do encaixe induzido mostrando os stios de ligao (1) e a mudana
conformacional no stio cataltico da enzima (2) antes da ligao com o substrato
(esquerda) e aps a ligao (direita).
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Vol. 1
Reao Catalisada
Exemplo
Transferncia de eltrons
(oxidao ou reduo)
Lactato desidrogenase
Monofosfato quinase
Hidrlise
Amilase
Liases
Fumarase
Isomerases
Triose fosfato
isomerase
Aminoacil-tRNA
sintetase
Oxidorredutases
Transferases
Hidrolases
Ligases
Ainda como estipulado no sistema universal de nomenclatura enzimtica, cada enzima deve ter um nmero classificatrio contendo quatro dgitos e um nome sistemtico
formal da enzima que catalisa a reao. Por exemplo, a protease do HIV-1 identificada
segundo seu nmero na Comisso de Enzimas como E.C 3.4.23.16, onde o primeiro dgito
refere-se ao nome da classe (tipo de reao catalisada); o segundo dgito subclasse (ligao ou grupo qumica sobre o qual atua); o terceiro dgito sub-subclasse (mecanismo
utilizado) e o quarto dgito significa o nmero serial (designado sequencialmente conforme as enzimas so identificadas e descritas). Assim sendo, a classificao da protease
do HIV-1 por etapas seria feita assim:
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Cap. 2
EC 3 Hidrolase;
EC 3.4 Hidrolase, protease;
EC 3.4.23 - Hidrolase, protease, endopeptidase do tipo asprtico;
EC 3.4.23.16 - Hidrolase, protease, endopeptidase do tipo asprtico, dcima sexta enzima
deste tipo a ser identificada e descrita.
2.4. Cofatores
A atividade cataltica de inmeras enzimas depende de molculas menores, no proticas, denominadas cofatores. Assim sendo, estas pequenas molculas ligam-se enzima durante a atividade cataltica e so liberadas para serem utilizadas em reaes futuras. Algumas molculas podem ainda ligar-se muito fortemente enzima fazendo parte
da sua estrutura. Neste caso, denominamos tais molculas como grupos prostticos.
De acordo com os cofatores conhecidos, podemos agrupar essas molculas em duas
classes: a dos ons metlicos e a das coenzimas (compostos orgnicos, sendo geralmente vitaminas) (Tabela 2.2).
Tipos de Cofatores
ons Metlicos
Zn
Mg
Ni
Mo
Mn
K
Coenzimas
Biotina
Coenzima A
Coenzima de flavinas
cido lipico
Pirofosfato Tiamina
Coenzima de nicotinamida adenina
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Vol. 1
E+S
ES
EP
E+P
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Cap. 2
Figura 2.3. Diagrama das coordenadas. O perfil da energia de ativao, onde G* mostra a
energia de ativao da reao, G indica a variao da energia livre. O nmero 1 diz
respeito ao estado fundamental do substrato e 2 ao estado fundamental do produto.
Uma caracterstica importante nas reaes enzimticas a diminuio da energia de
ativao quando comparada a uma reao no enzimtica.
v = k[s]
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Vol. 1
v = k[s1] [s2]
2.6. Ensaios enzimticos
Estudos enzimticos in vitro so constantemente desenvolvidos em laboratrio para
o estudo do mecanismo cataltico de enzimas. Para isso, adiciona-se ao ensaio pequenas
concentraes da enzima de interesse, cerca de 10-12 a 10-7M e concentraes maiores de
substrato, geralmente 10-6 a 10-2M.
Em muitas reaes enzimticas, a velocidade da reao diretamente proporcional
concentrao de enzima e do substrato. Assim sendo, a velocidade de uma dada reao
pode ocorrer de forma linear, ou seja, a concentrao do produto diretamente proporcional ao intervalo de tempo da reao.
Dessa maneira, podemos representar uma velocidade de reao de acordo com a seguinte equao:
v = P/T ou S/T
Graficamente, esta dada equao para uma velocidade de reao linear poder ser representada pela Figura 2.4.
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Cap. 2
Iniciar um estudo enzimtico em laboratrio nem sempre uma tarefa fcil, pois necessrio padronizar as condies de ensaio de forma minuciosa. Vrios fatores podem influenciar de forma negativa a linearidade de um ensaio. Dentre eles, a baixa concentrao
de enzima, baixa concentrao do substrato, pouco tempo de incubao, utilizao de tampes incorretos, entre outras coisas. Alm disso, devemos conseguir quantificar o produto
da reao sem que a concentrao do substrato altere a quantificao do ensaio.
Em geral, as quantificaes dos produtos em uma determinada reao so feitas utilizando leituras em equipamentos de laboratrio que medem a absorvncia ou fluorescncia.
Assim sendo, as quantificaes dos produtos obtidos nos ensaios utilizando a enzima de interesse devem ser comparadas uma curva padro. Nesta curva, adicionaremos
quantidades crescentes da molcula representada como produto da catlise em concentraes pr-determinadas.
Para exemplificar, tomemos como base a amilase. Esta enzima caracterizada como
uma hidrolase responsvel pela clivagem do amido em acares simples, tendo como
produto, entre outros acares, a glicose. Nesse contexto, a curva padro da amilase
pode ser feita com glicose em concentraes molares conhecidas (Figura 2.5).
Figura 2.5. Curva Padro de Glicose. Conforme mostra a figura, a curva deve
ser feita utilizando uma soluo estoque de glicose de concentrao
conhecida (10 mM). Por exemplo, poo nmero 1 - controle sem
glicose; poo 2 - 10 L; no poo 3 - 20 L; poo 4 - 30 L; poo
5 - 40 L; poo 6 - 50 L; poo 7 - 60 L e no poo 8 - 70 L.
Aps normalizao dos volumes finais em cada poo para 100 L
e deteco colorimtrica de acares, pode ser construda uma
correlao entre concentrao (de 0 a 7 mM), ou quantidade de
glicose (de 100 a 700 nmol), e absorvncia.
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Vol. 1
Aps a leitura das absorvncias dos poos, o grfico deve ser plotado e seus valores comparados aos valores obtidos nos ensaios da amilase. As absorvncias dos ensaios de atividade
enzimtica devem estar entre o limite inferior e superior da curva padro. Se obtivermos como
resultado do ensaio enzimtico valores de absorvncia maiores do que o ponto mais alto da
curva padro, as amostras devem ser diludas e o ensaio deve ser repetido. Em contrapartida,
se as absorvncias dos ensaios enzimticos forem inferiores ao menor ponto da curva padro,
as amostras devem ser concentradas e o ensaio tambm deve ser repetido. As condies de
ensaio devem ser sempre padronizadas buscando a linearidade da reao.
Uma vez padronizadas as condies timas de ensaio, temos ainda um segundo
problema: no conhecemos a concentrao molar da nossa enzima de interesse. Consequentemente, a concentrao dessa enzima deve ser determinada utilizando como
parmetro a sua atividade.
Para quantificar a atividade enzimtica, a Unio Internacional de Bioqumica definiu que:
Para exemplificar esses conceitos, suponhamos que em um determinado experimento, foram obtidos os seguintes resultados:
Absorvncia da Curva Padro de Protena (albumina)
massa de protena (g)
0
1
2
3
4
5
6
7
34
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Absorvncia 595 nm
0,006
0,020
0,059
0,090
0,120
0,162
0,175
0,210
Cap. 2
Absorvncia 595 nm
10
0,045
20
0,098
30
0,128
40
0,190
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Vol. 1
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Cap. 2
Absorvncia 550 nm
0,010
0,080
0,170
0,270
0,350
0,457
0,535
0,628
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Vol. 1
Tempo de incubao
(horas)
Absorvncia 550 nm
0,075
0,142
0,220
0,300
0,410
38
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Cap. 2
L de amostra
0,0009 Abs/nmol
Levando em considerao que 1mU = 1nmol/min, em 1 mL de amostra temos
que:
Concentrao de atividade = 1,64mU / 25 L que equivale a 0,07 mU/L.
Sabemos que a atividade especfica = concentrao de atividade/ concentrao de
protena, ento:
Atividade especfica = 0,07 mU / L = 0,407 mU / g = 407 mU/mg
0,172 g/ L
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39
Vol. 1
mente prximo ao seu stio-ativo. Aps esta mudana, o substrato at pode ligar-se ao
stio-ativo da enzima; entretanto, a enzima no poder catalisar a reao de forma to
eficiente.
As figuras abaixo exemplificam as inibies enzimticas reversveis competitivas (A)
e no-competitivas (B).
Figura 2.6. Tipos de inibies enzimticas reversveis. (A) Inibio Competitiva e (B) Inibio
no-Competitiva.
2.8. Concluso
O metabolismo celular de todo organismo pode ser caracterizado como um conjunto
de reaes bioqumicas que, por sua vez, depende da ao contnua de catalisadores biolgicos, ou seja, das enzimas.
Tendo em vista a sua grande importncia vida, as enzimas devem ser amplamente
estudadas, pois alm de serem protenas fundamentais nos processos fisiolgicos, podem tambm contribuir de inmeras maneiras para o avano tecnolgico.
40
S R I E E M B I O LO G I A C E L U L A R E M O L E C U L A R
Cap. 2
Assim sendo, o estudo minucioso das enzimas proporciona um conhecimento fundamental para tratamento de doenas, assim como para o desenvolvimento de poderosos
e eficientes frmacos. Um exemplo clssico o desenvolvimento de drogas que podem
inibir uma determinada enzima de um patgeno, como o caso da zidovudina (AZT) no
controle do vrus HIV pela inibio de uma asprtico protease.
Em sntese, compreender o funcionamento das enzimas significa compreender o funcionamento de peas fundamentais ao organismo.
Referncias Bibliogrficas
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2002) Molecular
Biology of the Cell . 4 ed. New York and London: Garland Science.
Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L. (2002) Biochemistry. 5 ed. New York: W H Freeman and Co.
Campbell, M.K. (2000) Bioqumica. 3 ed. Porto Alegre: Artmed.
Nelson, D.L., Cox, M.M. (2006) Princpios de Bioqumica. 4 ed. Artmed.
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41
MTODOS DE
PURIFICAO
DE PROTENAS
Rozana Crte-Real Faria
Cap. 3
S R I E E M B I O LO G I A C E L U L A R E M O L E C U L A R
43
Vol. 1
3.1.2. Solubilidade
Diversos fatores podem influenciar a solubilidade das protenas. A
solubilidade dependente diretamente da composio de aminocidos
da cadeia primria e de sua estrutura tridimensional, por influenciar no
arranjo de cargas e dipolos presentes na molcula. Alm das cargas devemos considerar o tamanho da molcula ou partcula dissolvida, lembrando que em fsico-qumica as diferenas entre soluo verdadeira, coloidal ou suspenso esto diretamente relacionadas ao tamanho do agente
disperso (no caso aqui a protena), e forma, em funo da superfcie de
contato estabelecida entre a protena e o solvente. Estes fatores mudam
radicalmente com a formao de agregados ou de protenas com estrutura quaternria, devido aos contatos protena-protena.
Grupamentos prostticos em protenas, ou seja, a parte no protica
(lipdeos, carboidratos, fosfatos etc.), tambm afetam sua solubilidade.
No caso de protenas glicosiladas ou fosfatadas estes grupos, por serem
polares, podem fazer interaes com o solvente (aumentando a solubilidade) ou mesmo facilitar a interao com outras protenas. Grupamentos
lipdicos, pelo contrrio, geralmente no interagem bem com a gua e, frequentemente, so responsveis pela fixao de protenas a membranas
lipdicas, fazendo com que no sejam solveis em gua. A solubilidade de
protenas de uma maneira geral pode ser modificada por fatores como:
pH
O pH afeta a natureza e a distribuio de cargas de uma protena. Em
geral, as protenas so mais solveis em pH baixos (cidos) ou elevados
(alcalinos) devido ao excesso de cargas de mesmo sinal, as quais iro
produzir repulso entre as molculas, o que diminui a formao de agregados (por interao eletrosttica) e, alm disso, contribui para uma
maior solvatao. Entretanto, valores extremos de pH podem induzir a
uma desnaturao protica, expondo regies hidrofbicas, o que poder gerar agregados (por interao hidrofbica) levando precipitao.
Por outro lado, quando uma protena se encontra em meio com pH igual
a seu ponto isoeltrico, ou seja, quando apresenta carga lquida nula,
a repulso eletrosttica entre partculas diminui, possibilitando interaes protena-protena, gerando uma condio favorvel para que as
molculas de protena se aproximem, agreguem e precipitem.
44
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Cap. 3
Fora inica
A solubilidade de uma protena pode variar de acordo com a concentrao de sal a que ela submetida. Em baixa concentrao de sal, observamos um aumento na solubilidade das protenas com a presena de
ons. Este fenmeno chamado de salting in, onde ocorre uma interao
entre os ons salinos e os grupamentos carregados das protenas diminuindo as interaes eletrostticas intermoleculares protena-protena
(responsveis pela diminuio da solubilidade protica). Por outro lado,
em elevada concentrao salina, observamos uma reduo na solubilidade das protenas. Este processo chamado de salting out, aonde alguns
sais, ao interagir com a gua, removem a camada de solvatao das protenas, o que facilita a formao de agregados e leva sua precipitao.
Temperatura
Uma grande parte das protenas solvel temperatura ambiente. O
aumento da temperatura at 40C em geral favorece a sua solubilidade.
O aumento da energia cintica favorece a interao do soluto com o solvente, fazendo com que se alcance um equilbrio dinmico, o qual permite
que a mesma quantidade de solvente presente no sistema possa participar na solvatao de uma maior quantidade de soluto. Entretanto, de
uma maneira geral, temperaturas acima deste valor podem desnaturar
protenas, o que na maior parte dos casos leva formao de agregados
e precipitao. interessante observar que a desnaturao tambm
pode ocorrer em baixas temperaturas, sendo que cada protena ter uma
determinada estabilidade para uma dada temperatura. Alm disso, mudanas bruscas de temperatura podem levar desnaturao protica
afetando seu funcionamento e solubilidade.
3.1.3. Soluo-Tampo
Um tampo uma soluo de um cido ou de uma base fracos, a qual
resiste a mudanas de pH quando se adicionam quantidades moderadas
de cido ou base. Esta soluo consiste na mistura de um par conjugado
cido-base, capaz de doar ou receber prtons. Protenas possuem certo
efeito tamponante, devido a alguns grupos ionizveis dos aminocidos
(COO-, NH2 etc.), que so cidos ou bases fracos. Entretanto, os valores
de pKa desses grupos so muito distantes de 7,4. Os nicos aminocidos
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Vol. 1
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Cap. 3
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Vol. 1
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Cap. 3
Mtodos Enzimticos
Para facilitar o rompimento de clulas bacterianas pode-se adicionar lisozima ao
tampo de lise. Analogamente, para a lise de clulas vegetais so usadas enzimas como
celulase e hemicelulases e para a lise de clulas fngicas so usadas enzimas lticas
como beta-glucanases e quitinases.
3.3.1. Centrifugao
A centrifugao uma tcnica que torna possvel a obteno de fraes
subcelulares e/ou organelas. Nesta tcnica, a separao de pequenas e grandes partculas ocorre pela aplicao de diferentes foras centrfugas ao extrato celular. As partculas maiores e mais densas sedimentam primeiro, ficando no sobrenadante as partculas pequenas e menos densas (Figura 3.2).
Para isolar organelas utilizam-se centrifugaes diferenciais aumentando
a fora centrfuga.
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Cap. 3
Aumento da densidade de
sacarose (g /cm3)
3.3.2. Dilise
A dilise um mtodo utilizado para separar molculas atravs do
seu tamanho utilizando uma membrana semipermevel com tamanho do
poro definido, de maneira a permitir a passagem seletiva de molculas.
Na prtica, uma mistura heterognea composta por molculas grandes
e pequenas colocada em um saco de dilise, o qual posteriormente
imerso em um grande volume de solvente aquoso. As pequenas molculas podem atravessar a membrana para o fluido externo e as molculas
maiores so retidas (Figura 3.4). O fenmeno que favorece a passagem
de molculas pequenas pela membrana a difuso destas, propiciada
pela diferena de concentrao destas entre a soluo presente no interior do saco de dilise e no seu exterior. O fluxo de difuso destas partculas ocorre de acordo com o seu gradiente de concentrao, indo da regio de maior concentrao para uma de menor concentrao at que se
atinja o equilbrio, com concentraes iguais nos dois compartimentos.
Assim sendo, as molculas que so capazes de atravessar a membrana
diluem-se por todo o recipiente. Se trocarmos apenas a soluo externa, pode-se continuar a dilise, pois o efluxo de molculas pequenas do
interior do saco novamente retomado, atingindo-se uma concentrao ainda menor aps o equilbrio. A eficincia de uma dilise depende,
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51
Vol. 1
t
Trocas do tampo (seta)
Saco de dilise
Solvente aquoso
(gua ou tampo diludo)
Barra magntica
Agitador magntico
Figura 3.4. Esquema da separao de molculas por dilise. O saco de dilise, composto por uma
membrana semipermevel, contm uma mistura de protenas imersa em tampo.
52
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Cap. 3
3.3.3. Cromatografia
A palavra cromatografia, de origem grega, onde chroma significa cor
e grafein significa escrita, ou seja, escrita em cores, envolve uma srie
de processos de separao de misturas. O termo cromatografia foi empregado primeiramente em 1906, sendo sua utilizao atribuda ao botnico russo, Mikhail Semyonovich Tswet. Em seu estudo, a passagem de
ter de petrleo (fase mvel) atravs de uma coluna de vidro preenchida
com carbonato de clcio (fase estacionria) permitiu a separao em faixas coloridas de pigmentos vegetais obtidos de um extrato de folhas de
plantas.
O mtodo foi descrito em 30 de dezembro de 1901 no 11 Congresso
de Mdicos e Naturalistas em So Petersburgo. Em 1907, Tswet demonstrou sua cromatografia para a Sociedade Botnica Alem. Em 1952, Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge ganharam
o Prmio Nobel de Qumica pela inveno da cromatografia de partio.
Desde ento, a tecnologia tem avanado rapidamente.
A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao. Este mtodo visa a migrao diferencial dos componentes de uma mistura, atravs de uma fase mvel e uma estacionria. Diferentes foras intermoleculares iro influenciar na interao entre os componentes da mistura e
das duas fases.
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53
Vol. 1
Fase mvel
A fase mvel o material que se move atravs da fase estacionria, carreando a
amostra. So observadas trs tipos de fase mvel: gasosa, lquida e supercrtica.
A lquida se subdivide em: clssica, onde a fase mvel passa atravs da coluna pela
fora da gravidade apenas ou e empurrada por bombeamento de baixa presso, e a cromatografia lquida de alta eficincia, aonde utilizado um dispositivo de alta presso
que bombeia a fase mvel atravs de uma tubulao capilar e de uma matriz porosa.
Na cromatografia gasosa so separados compostos volteis, os quais devem apresentar uma razovel presso de vapor na temperatura de trabalho. Na cromatografia
gasosa de alta resoluo usam-se colunas capilares, enquanto na cromatografia gasosa
habitual utilizam-se colunas com um dimetro maior.
Na cromatografia supercrtica emprega-se um fenmeno denominado de ponto crtico (capacidade de um lquido passar para vapor) em condies de presso, tipo de gs
utilizado, temperatura crtica e densidade.
Fase estacionria
A fase estacionria pode apresentar-se como slida, lquida ou quimicamente ligada.
Tcnica cromatogrfica
A fase estacionria pode ser depositada em suportes planos (cromatografia planar)
ou em colunas, as quais so comumente cilndricas.
Temos como cromatografias planares a cromatografia em papel e a cromatografia
em camada delgada. Nestas tcnicas o tipo de cromatografia de partio e o suporte
um papel ou uma placa de vidro (camada delgada). Na cromatografia em papel a gua que
solvata as fibras de celulose a fase estacionria e na camada delgada um gel ou silicato
que depositado sobre a placa de vidro. Na cromatografia de camada delgada o suporte
mais utilizado atualmente para deposio da fase estacionria uma folha de alumnio.
Apesar das cromatografias planares serem muito utilizadas para anlise de acares,
lipdeos e outros produtos naturais, no so utilizadas para purificao de protenas.
Na cromatografia em coluna, uma mistura de protenas aplicada em um suporte cilndrico,
o qual est preenchido por uma matriz (resina) hidratada que pode, ou no, apresentar determinado tipo de grupamento qumico funcional acoplado ela. A matriz ento percolada com
uma soluo apropriada para eluir diferencialmente as protenas de interesse. As diferentes
protenas migraro atravs da coluna em velocidades diferentes, que dependero do grau de
interao com a matriz, o que permite a sua separao. Os vrios mtodos de cromatografia
em coluna disponveis diferem quanto matriz utilizada e so classificados de acordo com as
propriedades fsicas ou qumicas nas quais se baseia o processo de diferenciao e separao
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Cap. 3
de protenas da amostra. So conhecidas cromatografias baseadas no volume molecular (cromatografia de excluso molecular), polaridade (cromatografia de troca inica, hidrxiapatita e
de carvo ativado), hidrofobicidade (cromatografia de interao hidrofbica e de fase reversa)
e especificidade de ligao (cromatografia de afinidade).
Cromatografia de excluso molecular
A cromatografia de excluso molecular ou filtrao em gel separa protenas pelos
seus diferentes volumes moleculares. A matriz constituda por esferas com poros de
tamanho bem definido. As molculas menores do que o dimetro dos poros penetram
nas esferas, ao passo que as maiores so foradas a percorrerem um caminho diferente,
por fora das esferas. Deste modo, as molculas menores percorrem, ao longo de uma
coluna, um trajeto muito maior do que as molculas maiores, que sairo da coluna em primeiro lugar (Figura 3.6). Um material comumente empregado para a fabricao de gis
cromatogrficos a dextrana, um polmero de glicose, comercialmente disponvel com o
nome de Sephadex; este produto sintetizado com diferentes tamanhos de poros, permitindo a excluso de molculas em um amplo intervalo de volume molecular. A filtrao
em gel tambm pode ser utilizada para diminuir a concentrao de sais de uma soluo
de protena, por exemplo, quando ela precipitada com sulfato de amnio.
A
Figura 3.6. Esquema da cromatografia de excluso molecular. (A) Aplicao da amostra coluna.
(B) Percurso das molculas de diferentes volumes moleculares, resultando na eluio
das molculas maiores; (C) Eluio das molculas de menor volume molecular e no
detalhe o poro da matriz retardando a passagem das molculas.
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Vol. 1
Figura 3.7. Cromatografia de troca inica. Os passos representam algumas etapas de uma troca
aninica. Esferas maiores representam grnulos da matriz (fase estacionria), esferas
menores, protenas, e sinais livres so ons em soluo. Molculas do solvente no esto
representadas. Em uma troca catinica, as cargas da matriz e das protenas seriam
opostas. (A) A fase estacionria est equilibrada com contra-ons negativos presentes no
tampo. (B) Aps a aplicao da amostra, protenas com carga superficial negativa ligamse matriz. Protenas com carga superficial positiva ou zero no interagem com a coluna
e so eludas junto com contra-ons. (C) A aplicao de uma soluo salina concentrada
desfaz a ligao entre protenas e fase estacionria, recarregando a matriz com contraons negativos e propiciando a eluio das protenas que estavam interagindo com a
coluna.
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Cap. 3
mesmo sinal que os da matriz no interagem com ela, passando livremente por toda
a coluna. Entretanto, as molculas de cargas opostas iro se ligar a matriz sendo eludas em uma ordem definida pela magnitude da carga apresentada pelas protenas,
nas condies da cromatografia. A eluio das protenas realizada, em geral, com
a passagem de um gradiente crescente de sal (contra-on) atravs da matriz. As protenas com maior carga permanecero ligadas mais fortemente matriz da coluna
e consequentemente sero eludas nas concentraes mais elevadas de contra-on.
Outras vezes, um gradiente de pH utilizado para eluio das molculas proticas de
maneira seletiva.
Os trabalhos na separao de aminocidos, peptdeos, cidos nuclicos e outros tipos de amostras, mostram o valor do processo de troca inica na rea da bioqumica.
Cromatografia de Interao Hidrofbica
A cromatografia por interao hidrofbica um mtodo que se baseia nas propriedades hidrofbicas das protenas para separ-las. A mistura de protenas aplicada
coluna na presena de altas concentraes de sulfato de amnio (sal comumente
utilizado). Este sal remove a camada de solvatao das protenas, expondo as regies
hidrofbicas das mesmas, que iro interagir com as regies hidrofbicas da matriz da
coluna. Ao reduzir a concentrao de sal na coluna, reconstituindo a camada de solvatao, as protenas com menor hidrofobicidade sero eludas primeiro e em seguida as
protenas com maior hidrofobicidade.
Cromatografia de Fase Reversa
Assim como a cromatografia de interao hidrofbica, a cromatografia de fase
reversa utiliza a hidrofobicidade das protenas para separ-las. Esta tcnica baseia-se na utilizao de uma fase estacionria apolar contendo cadeias longas de hidrocarbonetos e uma fase mvel polar. As protenas iro se ligar s cadeias de carbono
presentes na matriz de acordo com seu grau de hidrofobicidade. As protenas adsorvidas na matriz sero eludas em gradiente crescente de solvente apolar (Ex. acetonitrila), sendo as protenas com menor hidrofobicidade eludas primeiro (Figura 3.8).
Em comparao interao hidrofbica, a cromatografia em fase reversa apresenta
uma matriz cromatogrfica altamente hidrofbica. A utilizao de solventes orgnicos pode levar desnaturao da protena de interesse durante a cromatografia; por
isso, este tipo de cromatografia no se aplica a um grande nmero de casos.
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Vol. 1
Figura 3.8. Princpio de separao na cromatografia de fase reversa. (A) Em baixa concentrao
de solvente (meio com maior polaridade), protenas mais hidrofbicas (esferas cinza)
so adsorvidas fase estacionria apolar (cadeias de hidrocarbonetos). Protenas
polares (esferas brancas), mais hidroflicas, so arrastadas pela fase mvel. (B) Em
uma concentrao maior de solvente orgnico, mais apolar, protenas hidrofbicas
que antes estavam adsorvidas so dissolvidas pela fase mvel e eludas.
Cromatografia de Afinidade
Esta tcnica consiste em imobilizar na matriz cromatogrfica, atravs de ligao covalente, determinada molcula (ligante) pela qual a protena que queremos
purificar tenha afinidade. Posteriormente, nosso extrato protico aplicado
coluna. Todas as protenas com afinidade para o ligante ficaro retidas na coluna
e as outras protenas passaro atravs da coluna sem nenhum tipo de interao
(Figura 3.9). As protenas adsorvidas coluna podero ser eludas com concentraes crescentes de sal ou em valores extremos de pH. Em alguns casos a eluio
feita com uma soluo concentrada do prprio ligante (eluio por deslocamento
de equilbrio).
O receptor de insulina, uma protena da superfcie celular, foi isolado por cromatografia de afinidade em agarose contendo insulina covalentemente ligada. A cromatografia de afinidade tem, frequentemente, um poder de enriquecimento muito maior
que os outros mtodos cromatogrficos, embora seja restrita a uma classe especial
de protenas.
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Cap. 3
Figura 3.9. Cromatografia de afinidade. (A) Matriz cromatogrfica com ligantes covalentemente
presos fase estacionria. (B) Protenas com diferentes afinidades, ou stios de
ligao, esto presentes na amostra aplicada. (C) Apenas as protenas capazes de
reconhecer o ligante da matriz interagem com a fase estacionria. Protenas sem
afinidade com a matriz so eludas no lavado. (D) Protenas ligadas coluna com alta
afinidade permanecem aderidas matriz mesmo aps a lavagem da coluna. (E) Aps
alguma alterao nas condies fsico qumicas da fase mvel (pH, concentrao
de sais, presena de solventes orgnicos ou do prprio ligante na forma solvel), as
protenas de interesse so eludas da coluna.
Referncias Bibliogrficas
Amersham, Pharmacia Biotechnology AB, (1999) Protein Purification Handbook,
USA.
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2002) Molecular
biology of the cell, edio Garland Science, 4 ed.
Collins, C.H.; Braga, G.L., Bonato, P.S. (1995) Introduo a mtodos cromatogrficos,
Editora da Unicamp, 6 ed.
Nogueira, J., Mikhail, T. (2005) Um legado para a cromatografia moderna, Destaque100,
Universidade de Lisboa, Portugal.
Lehninger, A. (1986) Princpios de Bioqumica, editora Sarvier.
Radler, F., Nunes, D. (2003). Cromatografia princpios bsicos e tcnicas afins, editora
Intercincia.
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59
ELETROFORESE,
ZIMOGRAFIA &
WESTERN BLOTTING
Cap. 4
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Vol. 1
O objetivo principal desta tcnica separar molculas orgnicas, como DNA, RNA e
protenas, de acordo com sua carga eltrica e volume molecular.
A tcnica pode ser conduzida em diferentes meios-suporte tais como papel de filtro,
gel de slica, membranas de acetato de celulose, gis de agarose, acrilamida etc. Atualmente existem dois modelos mais utilizados de eletroforese: um baseado em gel de
agarose e outro em gel de poliacrilamida. Estes polmeros formam tramas de poros com
tamanhos variveis.
Dois componentes bsicos so necessrios para se realizar uma eletroforese: um
campo eltrico (obtido atravs de uma fonte de corrente contnua) e a prpria molcula
carregada.
Para visualizao das molculas separadas (na forma de bandas eletroforticas) so
utilizados corantes especficos para protenas, como Coomassie Blue, e solues especficas contendo os componentes necessrios (substratos, coenzimas, soluo-tampo
e sais) para revelao das bandas de atividade enzimtica. No caso de molculas de DNA
e RNA, diversos sistemas de revelao de bandas so empregados. J no caso do corante
brometo de etdio, a deteco da amostra feita atravs da fluorescncia emitida por
esse corante em presena da luz ultravioleta. As bandas podem ser detectadas tambm
por radioatividade, nitrato de prata ou quimioluminescncia.
Na tcnica, utiliza-se uma cuba com dois compartimentos separados. Os eletrodos
determinam os plos positivo e negativo em cada compartimento, onde adicionada
uma soluo-tampo com sal, que conduz eletricidade. O gel montado entre os dois
compartimentos de tal forma que a nica conexo eltrica entre os compartimentos seja
atravs do gel.
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Cap. 4
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Vol. 1
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Cap. 4
Esta forma de eletroforese em gel de poliacrilamida o mtodo mais utilizado para anlise de misturas de protenas de forma
qualitativa. Este mtodo baseado na separao de protenas
de acordo com a carga e o volume molecular; em uma de suas variantes (SDS-PAGE) pode ser utilizado na determinao da massa
molecular relativa de protenas.
Eventualmente, podemos utilizar gis contendo um gradiente de poliacrilamida, onde a concentrao do polmero (acrilamida) e o tamanho dos poros varia uniformemente ao longo do gel
(ex: 5 % acrilamida no topo do gel aumentando at 25% ao final
do gel). A vantagem da utilizao destes gis consiste no seu poder de separao de protenas com volumes moleculares muito
similares. Este tipo de gel pode ser utilizado tanto na eletroforese nativa quanto na eletroforese em condies desnaturantes
(SDS-PAGE).
4.3.2.4. Eletroforese
(SDS-PAGE)
em
condies
desnaturantes
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65
Vol. 1
quantidade s protenas, conferindo-lhes uma carga negativa homognea. Alm disso, o SDS um agente desnaturante capaz de
desfazer parcialmente a estrutura tridimensional de protenas.
Entretanto, o detergente no capaz de romper ligaes covalentes como as pontes dissulfeto.
O SDS-PAGE uma tcnica freqentemente utilizada na bioqumica e biologia molecular para determinao das massas moleculares relativas das protenas presentes
em uma amostra. Este tipo de eletroforese pode ainda ocorrer em condies redutoras,
atravs da adio de agentes redutores como ditiotreitol ou beta-mercaptoetanol. Estes agentes complementam a desnaturao das protenas atravs da reduo de ligaes dissulfeto finalizando o processo de desmantelamento das estruturas tercirias e
quaternrias (eventuais), previamente separao eletrofortica.
As protenas podem ser detectadas em amostras de clulas (homogenato) ou em extratos de tecidos. Estas amostras so preparadas atravs da lise celular, promovendo
o rompimento das clulas e das organelas. O tampo de lise celular tradicionalmente
composto por um detergente, como o SDS ou Triton X-100, associado a um coquetel de
inibidores de proteases. Ento, a soluo centrifugada e ao sobrenadante (material
solvel) adicionado um tampo de amostra que, geralmente, contm um corante, um
composto redutor (betamercaptoetanol) e detergente (SDS). Este tampo possibilitar o desenovelamento das protenas, pois a estrutura terciria ser desfeita devido
desestruturao de interaes hidrofbicas (detergente) e rompimento de ligaes
dissulfeto (composto redutor). Alm disso, a amostra ainda fervida, o que favorece a
desnaturao protica.
Anteriormente adio do tampo de amostra, a concentrao de protenas determinada para a padronizao do volume da amostra que dever ser aplicado na eletroforese unidimensional. No caso de cultura de clulas, o nmero de clulas tambm pode ser
utilizado como indicador da concentrao de protenas da amostra.
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Cap. 4
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4.4. Zimografia
A zimografia consiste em um mtodo sensvel para medida da atividade enzimtica
aps uma separao eletrofortica. O princpio fsico-qumico da eletroforese permite
a separao das protenas, e a atividade enzimtica determinada pelo nvel de degradao do substrato (normalmente co-polimerizado no mesmo gel de corrida). Usaremos como exemplo o substrato gelatina, para proteases. Aps a corrida eletrofortica
e incubao, o gel com gelatina corado com azul de Coomassie, permitindo a revelao das bandas. A diminuio, ou eventual desaparecimento de cor nas bandas do
gel, est relacionado com a quantidade de gelatina (substrato) degradada na reao de
protelise. Este mtodo amplamente utilizado para busca de enzimas que degradam
a matriz extracelular, em especial, metaloproteases de matriz extracelular (MMPs).
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Cap. 4
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Substrato
Produto (luz)
DETECO
Protena de interesse
Protena bloqueadora que no apresenta reao cruzada (albumina do soro bovina)
Existem quatro tipos principais de deteco do sinal no western blotting aps a adio do anticorpo primrio:
a) Colorimtrica Neste mtodo a deteco depende da incubao da membrana com
um substrato que reaja com a enzima reveladora, como a peroxidase, que est conjugada ao anticorpo secundrio. Esta reao converte o corante solvel em insolvel,
colorindo a membrana e gerando as bandas. Aps a lavagem para a remoo do co-
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Cap. 4
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INTRODUO
PROTEMICA
INTRODUO PROTEMICA
Cap. 5
5. INTRODUO PROTEMICA
5.1. Introduo
A Teoria Central da biologia molecular explica como a informao gentica contida nos
genes transferida para o citoplasma. Este processo inicia-se com a formao de uma
molcula, o RNA mensageiro (RNAm), atravs do processo da transcrio, e no citoplasma
esta molcula de RNAm traduzida em uma protena que exerce sua funo biolgica.
As protenas so macromolculas abundantes e relevantes pois desempenham diversas funes biolgicas, tais como estrutural, hormonal, transportadora, imunolgica
e enzimtica.
O intenso avano da Biologia, em especial aps o sequenciamento do genoma humano e de genes completos de vrios organismos, gerou uma infinidade de informaes
sobre a organizao gentica destes. Entretanto, o sequenciamento de genes no gera
informaes sobre quais protenas esto sendo expressas em um dado momento, sob
determinada condio. Ao contrrio do genoma, que permanece relativamente estvel
ao longo do ciclo de vida de um organismo, o proteoma, ou seja, o perfil de expresso
protica de uma clula extremamente dinmico, pois se modifica dependendo das condies e estmulos a que este organismo est exposto.
A necessidade de suprir essa grande demanda de conhecimento sobre a biologia da
clula atravs do mapeamento de perfis proticos, quantificao de protenas e estudos de modificaes ps-traducionais, levou ao surgimento da protemica, que permite investigar, alm do controle da expresso gnica, modificaes ps-traducionais e o
metabolismo celular. O termo protemica, sugerido por Marc Wilkins em um simpsio na
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Vol. 1
Figura 5.1. Teoria Central da biologia molecular com indicao dos diversos pontos de
controle existentes, os quais podem ocorrer na transcrio (1), no processamento
do RNA (2), no transporte do mRNA do ncleo para o citoplasma (3), na eventual
degradao desse mRNA (4), na traduo (5) e, finalmente, na eventual adio
de grupamento qumico e/ou processamento da protena recm-sintetizada
para gerar sua forma ativa (modificaes ps-traducionais) (6).
Itlia, em 1994, e subsequentemente publicado em 1995, definido como a caracterizao em larga escala do conjunto de protenas contidas em uma clula. Este conjunto de
protenas expressas em uma clula ou tecido, a partir do genoma, que denominamos
proteoma.
A anlise protemica uma tcnica relativamente recente, que permite caracterizar
um proteoma de uma amostra qualitativa e quantitativamente. As duas principais tcnicas para a anlise do proteoma so: eletroforese bidimensional (2D-PAGE 2-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis) e espectrometria de massas.
A tcnica de 2D-PAGE, descrita por OFarrel em 1975, consiste na separao de protenas com base em duas importantes propriedades fsico-qumicas independentes:
ponto isoeltrico e massa molecular. Inicialmente, a tcnica consistia na preparao de
gis cilndricos de poliacrilamida, em que o gradiente de pH era estabelecido atravs de
uma pr-corrida com partculas carregadas (tambm chamados de anflitos) especficas com elevada capacidade de tamponamento em pHs prximos aos seus pontos iso-
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a estrutura proteica nativa. Alm disso, confere uma carga negativa a todas as protenas,
fazendo com que estas se distingam somente pelas suas massas moleculares.
Molculas menores
correm mais
rpido no gel
Molculas maiores
correm mais
lentamente
5.3.2. SDS-PAGE
Na segunda etapa, a fita resultante da primeira dimenso submetida
tradicional eletroforese SDS-PAGE para uma segunda separao das protenas, agora pela diferena na massa molecular (Figura 5.5).
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INTRODUO PROTEMICA
Cap. 5
vcuo
amostra
Fonte de
Ionizao
MALDI
ESI
Analisador de
massas 1
TOF
Q
TridimensionaI Ion Trap
Analisador
de massas 2
Detector de
ons
TOF
TOF
----------ORBITRAP -FT
ICR -FT
Computador
Inte nsidade %
m/z
Espectro de massas
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Vol. 1
zation) (Figura 5.7) e ionizao por desoro a laser auxiliada por matriz (MALDI - Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization) (Figura 5.8). Geralmente, estas fontes podem ser
combinadas de diferentes formas com os analisadores permitindo a construo de equipamentos hbridos de alto desempenho. Uma combinao que tem se mostrado eficiente da fonte de ionizao MALDI com dois analisadores TOF (Time of Flight) em tandem
(um atrs do outro; alinhados).
No espectrmetro MALDI TOF-TOF a amostra misturada a uma matriz orgnica e
aplicada a uma placa de ao inoxidvel contendo microfissuras. medida que os solventes da matriz e da amostra evaporam, ocorre uma co-cristalizao destes. A placa ento
submetida a tiros de laser, o que provoca a fotoionizao dos analitos pela transferncia de carga dos ons da matriz para a amostra, e posterior dessoro, fazendo com que
os ons do analito entrem em fase gasosa. Aps entrarem em fase gasosa, os analitos
so encaminhados ao analisador do tipo TOF, onde os ons so acelerados pela aplicao
de uma diferena de potencial e percorrem um espao livre (tubo de vo) sob vcuo, at
serem detectados. Os ons de m/z diferentes atingem o detector em tempos diferentes;
os ons de maior massa levam mais tempo para atingir o detector, o que pode ser visualizado pela frmula a seguir:
U diferena de potencial
L espao percorrido
z carga do on
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Cap. 5
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Figura 5.8. Ionizao e dessoro por MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization).
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Cap. 5
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