Protocolo de Digesto em Gel

Laboratrio Max Feffer de Gentica de Plantas

Departamento de Gentica
Esalq/Usp

Shevchenko et al (2006). In-gel digestion for mass spectrometric

characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols 1 (6): 2856-2860.
doi:10.1038/nprot.2006.468
Obs: Todos os cidos e solventes orgnicos devem ser manipulados com
muito cuidado e sempre no interior de capela de exausto e descartados de
acordo com as normas para descarte de resduos. Acetonitrila e Metanol so
txicos e o cido frmico corrosivo. Dessa forma, devem ser manipulados
com muito cuidado.
Obs: Cuidados a serem tomados para minimizar contaminaes com
queratina, polmeros e outras impurezas que podem interferir na qualidade das
amostras:
i)

ii)

iii)

Use luvas de nitrila: www.danny.com.br o tempo todo e lave-as, caso

necessrio, para evitar contato com poeira e fios de cabelo que
eventualmente podem ficar aderidos devido esttica do material
das luvas.
Utilize sempre qumicos (grau MS), ponteiras e microtubos novos,
graduados e no siliconizados (Tabela 1), para evitar contaminao
por polmeros na amostra. Mantenha os tubos em locais livres de
poeira e no autoclave-os. Se possvel, utilize pipetas exclusivas
para tal finalidade.
Sempre verifique a limpeza dos tubos e frascos de preparo dos
tampes. aconselhvel separar a vidraria que deve ser de boro
silicato (Tabela 1), se possvel. Evite o uso de detergentes
polimricos, tais como: Triton X100, SDS, Tween, etc.. Recomendase fazer um enxge da vidraria com metanol, antes do uso.

Solues:
Obs: As solues devem ser novas (CRTICO), preparadas na quantidade
necessria, no dia do uso. No devem ser estocadas. O bicarbonato de
amnio extremamente voltil.
Obs: recomendvel, preparar um volume maior de 50mM AmBic e a
partir dessa soluo, preparar todas as outras.

1) Soluo de descolorao: 50% (v/v) de acetonitrila (ACN) (CAS# 75-058, Fluka, cat# 34967) e 25 mM de bicarbonato de amnio (AmBic)
(NH4HCO3, CAS# 1066-33-7, Sigma, cat# 9830 MW= 79.06) = [0.1 g/50
mL H2O milliQ]. Essa soluo pode ser feita a partir da soluo estoque
de 50 mM AmBic.
Obs: Essa soluo de descolorao utilizada para o caso de
spots de gis corados com Coomassie. Gis corados com prata
devem ser descorados com Acetonitrila 100%.
2) Acetonitrila (ACN) 100%.
3) Soluo de reduo: 20mM ditiotreitol (DTT, BioRad, cat# 161-0611,
MW=154.3) = [30 mg/10 mL de soluo 50 mM AmBic = [0.2 g/50 mL
H2O milliQ].
4) Soluo de alquilao: 55 mM de iodoacetamida (IAA, GE, cat# RPN
6302V, MW=185.0) = [102 mg/10 mL de soluo 50 mM AmBic. Obs: o
IAA sensvel luz! (CRTICO).
5) Soluo de tripsina (Promega Trypsin, Part No. V511): estoque de 10
ng/L.
6) Soluo bloqueadora: 5% (v:v) cido frmico 96% (Fluka/SigmaAldrich, cat# 56302) em 50% (v:v) ACN. Para 2 mL, aliquotar 1 mL de
ACN 100% em um frasco de vidro, pipetar 104.16 L de cido frmico
(96%) e completar o volume para 2 mL, com H2O milliQ (895.84 L).
7) Soluo de eluio I: 1% (v:v) cido frmico (96%) em 60% (v:v) metanol
(Merck, cat# 1.06009.1000). Para 2 mL, aliquotar 1.2 mL de metanol
100% em um frasco de vidro, pipetar 20.83 L de cido frmico (96%) e
completar o volume para 2 mL, com H2O milliQ (779.17 L).
8) Soluo de eluio II: 1% (v:v) cido frmico em 50% (v:v) ACN. Para 2
mL, aliquotar 1 mL de ACN 100% em um frasco de vidro, pipetar 20.83
L de cido frmico (96%) e completar o volume para 2 mL, com H 2O
milliQ (979.17 L).

Procedimento 1: Preparo dos spots/bandas

1) Corte os spots/bandas dos gis, com auxlio de uma ponteira de 1 mL

(adaptar a ponta com auxlio de uma gilete, para o tamanho do spot) ou
para o caso de bandas, utilizar uma lmina de bisturi pequena.
2) Pique os spots/bandas em fragmentos de aproximadamente 1 mm3 (use
placas de Petri de vidro previamente enxaguadas com metanol e gua
milliQ) e transfira-os para tubos eppendorf com auxlio de uma pipeta
Pasteur de vidro e gua milliQ.
Descolorao dos fragmentos de gel: lave-os (3X ou mais, at a
remoo completa do corante) com soluo de descolorao (200
L/spot) e agite (vrtex). Espere 5 a10 min a cada lavagem. Obs: alguns
spots, mesmo depois de vrias lavagens no descoram (prossiga
mesmo assim).
Obs: Os spots de gis corados com prata devem ser descorados
com Acetonitrila 100%.

3) Remova a soluo de descolorao, com auxlio de uma pipeta Pasteur

de vidro e desidrate o gel com 100% ACN (200 L/spot), por 10 min. D
um pulso na centrfuga, para remoo completa da ACN. Os fragmentos
de gel devem ficar bem branquinhos. Repita o processo at
desidratao completa do gel (normalmente 1X), ou seja, percebe-se
que os fragmentos de gel se soltam da parede do tubo. O resduo
remanescente do gel deve evaporar temperatura ambiente, em capela
(15 min). Obs: Nesse ponto, caso seja necessrio, pode-se
interromper o procedimento e manter as amostras a -20C por 1 a 2
horas, antes de prosseguir.
4) Reduo: reidrate os fragmentos de gel, pela adio de soluo de
reduo (40 L/spot). Mantenha as amostras a 56C, por 40 min.
Obs: No caso de spots de gis corados com prata deve-se repetir (1
X) a etapa de reduo.
5) D um pulso na centrfuga. Descarte o sobrenadante para remoo
completa da soluo de reduo.
6) Desidrate o gel com 100% ACN (200 L/spot), por 10 min. Remova a
ACN. A ACN residual remanescente deve evaporar temperatura
ambiente, em capela (15 min).

7) Alquilao: adicione a soluo de alquilao (de forma a cobrir os

fragmentos de gel, 40L/spot). Incube as amostras no escuro,
temperatura ambiente, por 30 min.
Obs: No caso de spots de gis corados com prata deve-se repetir (1
X) a etapa de alquilao.
8) D um pulso na centrfuga. Descarte o sobrenadante e lave os spots
com 25 mM AmBic (200 L/spot), com auxlio do vrtex, seguido de
desidratao com 100% ACN (2X). D um pulso na centrfuga para
remoo completa da ACN. O resduo remanescente do gel deve
evaporar temperatura ambiente, em capela de exausto (15 a 20 min).
Obs: Nesse ponto, caso seja necessrio, pode-se interromper o
procedimento e manter as amostras a -20C por 1 a 2 semanas,
antes de prosseguir com a digesto.

Procedimento 2: Preparo da Tripsina

Obs: A tripsina geralmente fornecida pelo fabricante liofilizada (100 ug em
5 vials de 20 g da (Promega Trypsin, Part No. V511A). A quantidade de
enzima deve ser ressuspendida vagarosamente (No utilize VRTEX!) no
tampo de cido actico 50 mM, que vem juntamente com a enzima.
Preparo da tripsina para digesto em gel: 20 g de tripsina em 200 L de 50
mM cido actico (Conc. Final = 100 ng/L). Distribua alquotas de 60 L
em vials- Waters Total Recovery Vial (Waters Part No. 186000385c,
100/pkg, preslit PTFE/silicone caps). Congele (-80C) esses tubos at o
momento do uso. Recomenda-se manter a tripsina armazenada congelada
em cido actico e deve-se evitar ciclos de descongelamento.

Procedimento 3: Digesto
1) No momento do uso, o volume das alquotas (10 L) da soluo de
tripsina (100ng/L), que est congelada, deve ser completado para 50
L com soluo de AmBic (50 mM) gelada. Assim, a concentrao final
da enzima ser de 20 ng/L em cada tubo. Essa a concentrao de
enzima que ser utilizada na digesto.
2) Adicione 15L (no mnimo) da soluo de tripsina (20 ng/L) sobre os
fragmentos de gis desidratados.
3) Deixe as amostras 15 min a 4C para que a tripsina penetre nos
fragmentos de gel. Retire o excesso da soluo de tripsina, caso haja.

4) Adicione 50 mM de AmBic at cobertura completa dos spots (40L).

Incube as amostras a 37C, por 14 horas.

Procedimento 4: Eluio dos peptdios

1) A ao da tripsina deve ser interrompida pela adio de 15 L de
soluo bloqueadora. Recupere o sobrenadante (= 55 L) e transfira-o
para um tubo novo. Obs: Nesse ponto, caso seja necessrio, pode-se
interromper o procedimento e manter as amostras a -20C por 1
semana.
2) Eluio I: adicione volume suficiente de soluo de eluio I para cobrir
os fragmentos de gel remanescentes nos tubos da digesto (40 L).
Incube as amostras por 15 min a 40C, com agitao (vrtex), a cada 5
min. Repita esse passo. Recupere o sobrenadante de cada passo e
transfira-os para o mesmo tubo que contm o sobrenadante da digesto
e a soluo bloqueadora (= 135 L). Guarde os tips nos tubos iniciais,
que contm os fragmentos de gis remanescentes, para utiliz-los nos
prximos passos.
3) Eluio II: adicione volume suficiente de soluo de eluio II para cobrir
os fragmentos de gel (40 L). Incube as amostras por 15 min a 40C,
com agitao (Vrtex), a cada 5 min. Repita esse passo. Recupere o
sobrenadante de cada passo e transfira-os para o mesmo tubo que
contm os sobrenadantes resultantes da Eluio I (= 215 L).
4) Eluio III: adicione volume suficiente (40 L) de ACN 100% para
desidratar os fragmentos de gel. Recupere o sobrenadante e transfira-o
para o mesmo tubo que contm os sobrenadantes da Eluio I e II. (=
295 L). Obs: Nesse ponto, caso seja necessrio, pode-se
interromper o procedimento e manter as amostras a -20C por 1 a 2
semanas.
5) A soluo final (~300 L), contendo os peptdios eludos do gel, deve ser
concentrada em concentrador a vcuo (speed vac), temperatura
ambiente, at 1 L (ir acompanhando de tempos em tempos, +/1min/L). Armazenar a amostra a -20C at a ressuspenso da mesma,
para anlise de espectrometria de massas. Obs: Nesse ponto, as
amostras podem ficar armazenadas por 1 a 2 meses at a anlise.
6) A amostra deve ser ressuspendida em 10 L TFA 0.1% (v:v) em H2O
milliQ (Sigma-Aldrich, cat# 299537, CAS# 76-05-1), agitada (vrtex),

dessalinizada com auxlio do ZipTip (ver protocolo site), eluda em 10 L

de 50% (v:v) ACN em H2O milliQ e transferida para vials- Waters Total
Recovery Vial (Waters Part No. 186000385c, 100/pkg, preslit
PTFE/silicone caps). Seque a amostra no speed vac caso seja
necessrio armazen-la (-80C). No caso de anlise por MALDI, reduza
o volume da amostra eluda, com auxlio do speed vac para 5L e
utilize 2L (1+1) para aplicar na placa de MALDI.
7) J no caso da anlise pelo SynaptG2, aps a passagem da amostra
pelo ZipTip e eluio em 10 L de 50% (v:v) ACN em H2O milliQ, devese secar a mesma a vcuo (speed vac), temperatura ambiente, at 1
L (ir acompanhando de tempos em tempos, +/- 1min/L). Aps
secagem, ressuspend-la em 13 L de cido frmico 0.1% (v/v),
preparado em H2O milliQ (Fluka/Sigma-Aldrich, cat# 56302), e agit-la
(vrtex). Do total de 13 L, utilizar 3.3 L na injeo.