Produo de nanofibras com propriedades anti biofilme

Resumo
Materiais txteis tm sido cada vez mais empregados na fabricao dos mais diferentes
objetos e de novos materiais, e, portanto esto cada vez mais presentes no cotidiano. Por
isso, alm do apelo ambiental para o desenvolvimento de tcnicas e processos de
beneficiamento ecologicamente sustentveis, diversos estudos buscam inovaes nas
caractersticas do produto final. Neste sentido, o desenvolvimento de nanofibras e
txteis inteligentes (conhecidos ainda como txteis tcnicos ou funcionais) se tornou um
caminho promissor. Dentre as diversas categorias de obteno de txteis com
propriedades diferenciadas, podemos destacar a obteno destes materiais usando a
eletrofiao. Esta tcnica permite a obteno de tecidos-no-tecidos atravs da fiao de
fibras manomtricas com alta rea superficial. Dentre as aplicaes destes txteis,
podemos destacar o uso de aditivos antimicrobianos para uso em muitas aplicaes
como a mdica e a odontolgica. Neste sentido, um problema recorrente a formao
de biofilme na superfcie destes materiais, que muitas vezes impedem que antibiticos
tenham ao efetiva. A formao do biofilme controlada pelo mecanismo de
comunicao bacteriana, conhecido como qurum sensing. Assim, interferindo na
comunicao bacteriana, possvel reduzir ou at mesmo inibir a formao do biofilme,
proporcionando uma ao eficaz, por exemplo, de antibiticos. Dentro deste contexto, o
objetivo deste trabalho foi a obteno de nanofibras de celulose e de PLGA contendo
leos essenciais, caracterizando a seu efeito sobre a inibio de aderncia e formao de
biofilme de E. faecalis para as membranas de celulose e S. mutans para as membranas
de PLGA. Os resultados mostraram que os extratos tm diferentes atividades sobre as
bactrias. As nanofibras incorporadas com leo de cha (tea tree oil) mostraram uma
tendncia inibio do biofilme nos dois sistemas estudados. A presena deste leo em
altas concentraes nas nanofibras induz uma mudana na tendncia inibio de
biofilme por ao anti-QS para uma tendncia inibio do crescimento bacteriano, por
ao bactericida ou bacteriosttica.

Introduo
Nanofibras e no-tecidos so nanoestruturas nicas com um potencial
extraordinrio tanto em reas tcnicas como em aplicaes medicinais tais como filtros,
funcionalizao de txteis, fibras de reforo, catlise, entrega de medicamentos,

cicatrizao de feridas ou engenharia de tecidos so apenas alguns exemplos de

aplicaes potenciais. A principal rota para a obteno destas nano fibras baseada na
tecnologia de eletrofiao. Este um mtodo que utiliza fontes de alta tenso e baixa
corrente para produzir fibras de dimetro reduzido (normalmente em escala
manomtrica), quando um jato de um material fluido acelerado e estirado na presena
de um campo eltrico externo produzindo no-tecidos.
No tecidos base de nanofibras podem ser utilizados para modificar fortemente
as propriedades de txteis convencionais usados majoritariamente em vesturio, moveis,
hospitais, aplicaes tcnicas, etc. [1]. A melhora das propriedades pode ser obtida de
forma muito eficaz pela ancoragem de camadas manomtricas de no-tecidos nos
txteis. O objetivo pode ser, entre outros, a proteo do corpo humano contra o efeito de
ventos fortes, temperaturas baixas, bactrias ou melhora nas propriedades anti-chama.
Recentemente, pesquisadores mostraram que uma fina camada de nanofibras depositada
sobre a superfcie de um txtil capaz de aumentar a resistncia ao vento forte em at 5
vezes [1], [2].
Outras aplicaes interessantes incluem o desenvolvimento de nanofibras
sintticas contendo ingredientes ativos. Fibras sintticas incluem a famlia das
poliamidas, polipropileno, PET (polietileno tereftalato), etc. Dentre os polmeros mais
utilizados para o preparo destes materiais para uso na rea mdica, podemos destacar o
poli(cido ltico-co-cido gliclico) (PLGA) um copolmero utilizado em uma
variedade

de

dispositivos

teraputicos

devido

sua

biodegradabilidade

biocompatibilidade [3][6].
Desta forma, a eletrofiao pode agregar valor ao produto final criando nano
fibras com alta rea superficial. Alm disso, pode incorporar molculas reativas no
corao das nano fibras atravs da co-fiaao [7]. Dentro desta perspectiva, diversos
estudos mostram que o uso de leos trazem benefcios para a sade humana. Alm
disso, molculas promissoras so as molculas que podem ser utilizadas para inibir o
qurum sensing em bactrias. Qurum sensing (QS) um sistema de estmulo e
resposta correlacionada com a densidade populacional. Muitas espcies de bactrias
utilizam este mecanismo para coordenar a expresso do gene de acordo com a sua
densidade de populao local (por exemplo, motilidade, virulncia, produo de
antibiticos, etc). Desta forma, nano fibras sintticas que possam carregar um agente
capaz de interferir neste sistema de forma adequada um material promissor [8][11].

Dentre os mecanismos regulados pelo QS, a formao de biofilme tem

importncia significativa em diversas reas, pois o biofilme formado protege as
bactrias da ao de agentes antibacterianos [9]. Um biofilme consiste em um complexo
ecossistema microbiolgico, formado por populaes desenvolvidas a partir de uma
nica ou de mltiplas espcies, sejam bactrias, fungos e/ou protozorios de modo
isolado ou em combinao, associados a seus produtos extracelulares constituindo uma
matriz de polmeros orgnicos e que se encontram aderidos a uma superfcie bitica ou
abitica [12], [13]. O biofilme contm partculas de protenas, lipdeos, fosfolipdios,
carboidratos, sais minerais e vitaminas, entre outros, que formam uma espcie de crosta
denominada matriz, abaixo da qual, os microrganismos continuam a crescer, formando
um cultivo puro, ou uma associao com outros microrganismos e aumentando a
proteo contra agresses qumicas e fsicas [12], [13].
O processo de formao de biofilme inicia com a adeso de micro-organismos
a uma superfcie planctnica, seguido de colonizao e de co-adeso, crescimento,
maturao, e, finalmente, descolamento de alguns microrganismos [13]. Na primeira
fase, os micro-organismos so fixados, mas ainda no ocorre o processo de
diferenciao biofilme. Para desenvolver um biofilme maduro, a adeso deve ser
irreversvel e os microrganismos devem crescer em populao. A formao do biofilme
um processo dinmico, assim, fixao, co-adeso e crescimento pode ocorrer
simultaneamente. A maturao do biofilme resulta em uma arquitetura complexa com
canais e poros. Os microrganismos, individualmente ou em grupos, tambm podem ser
liberados da superfcie do biofilme para encontrar outros locais de colonizao.
Como a formao de biofilme um processo que regulado pelo mecanismo
de comunicao bacteriana, uma tcnica para inibir eficientemente este processo o uso
de inibidores de qurum sensing (IQS). O mecanismo consiste em bloquear a
comunicao bacteriana usando molculas sinalizadoras modificadas que, ao ligar-se ao
receptor na bactria, no desencadeia a transcrio dos genes responsveis pela
atividade bacteriana [9], [14]. Muitos inibidores j foram caracterizados e muitos esto
disponveis na natureza. IQS so alternativas atraentes para tratamento antimicrobiano
tradicional de txteis e vesturio [14], [15]. Por exemplo, furanonas bromadas
encontradas na superfcie da alga vermelha Delisea pulchra inibem a colonizao
bacteriana nesta alga, provavelmente pela interferncia na comunicao bacteriana [16].
Alm disso, diversos estudos mostraram que furanonas e derivados bromados naturais
podem influenciar a formao de biofilme em vrias espcies bacterianas, como a

Pseudomonas aeruginosa [17], Escherichia coli [18] e Streptococcus mutans [19], sem
inibir a taxa de crescimento dessas bactrias. Lnn-Stensrud e colab. estudaram o
mecanismo de formao de biofilme da S. mutans e mostraram que, neste caso, o
autoindutor 2 (AI-2) um dos responsveis pela comunicao bacteriana e posterior
formao do biofilme. Alm disso, esses mesmos autores sintetizaram a furanona (Z)-5bromomethylene-2(5H) e a utilizaram como inibidor da comunicao bacteriana
obtendo reduo de aproximadamente 63% na formao do biofilme [19].
No caso especifico da S. mutans que uma bactria que evoluiu para um
estilo de vida dependente de um biofilme para a sobrevivncia e persistncia em seu
ecossistema natural: a placa dentria. Por isso, ela considerada um dos principais
agentes etiolgicos da crie dentria. A superfcie do dente um habitat indispensvel
para esta bactria, sendo uma das principais bactrias cariognicas que normalmente
habita um complexo de biofilme sobre a superfcie do dente (placa dentria) [20]. Esta
bactria produz grandes quantidades de exopolissacridos, especialmente na presena de
sacarose, que lhes permitem aderir eficientemente ao dente. As bactrias tambm tm a
capacidade de produzir grandes quantidades de cidos de acares fermentveis. O
acumulo de cido pode, eventualmente, dissolver a estrutura cristalina do dente,
resultando numa leso de crie [21]. Alm de causar problemas que resultam em uma
leso de crie, o biofilme formado pela S. mutans pode abrigar diversas outras bactrias
que, no caso de uma cirurgia bucal, podem se infiltrar na corrente sangunea, causando
vrios problemas de sade. Assim, diversas metodologias tm sido desenvolvidas para
evitar a formao de biofilme, bem como a adeso destas bactrias me curativos. Uma
das metodologias que vem recebendo muita ateno o uso de membranas contendo
ingredientes ativos, como antibiticos e leos essenciais. Dentre os leos mais
estudados, podemos destacar o tea tree (tambm conhecido como leo de ch ou
melaleuca) e o leo de caf. Estes leos essenciais tm sido reportados com ao
antibacteriana e com ao na formao do biofilme. No caso da cafena (um dos
compostos presentes no caf), alguns estudos mostram que a cafena pode ter influncia
no qurum sensing em bactrias [22], [23]. Por outro lado, o tea tree tem mostrado
atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de bactrias, fungos e vrus [24].
H uma necessidade de biocidas seguros e eficazes para a preveno e destruio
de biofilme. Existe tambm interesse em compostos naturais para este propsito. Assim,

leos essenciais e os seus componentes tm sido estudados como agentes anti-biofilme

com grande potencial para diversas aplicaes.
Desta forma, neste trabalho estudou-se a obteno de nanofibras a partir de
dois materiais bio compatveis: o acetato de celulose e o PLGA atravs da tcnica de
eletrofiao. Alm disso, foram incorporadas nas fibras dois leos essenciais, o tea tree
e o leo de caf. As membranas obtidas foram testadas quanto inibio da formao
do biofilme em sua superfcie.

Materiais e Mtodos
O PLGA usado foi o PURASORB PLG 8218. Os leos essenciais foram
adquiridos no mercado local e usados como recebidos: leo de caf - Coffea canefora Pierre 2011, leo de ch (Tea tree australian oil, Marca Desertessence). Alm destes,
Clorofrmio (Vetec) e Dimetil Formamida (Synth) foram usados.
Para o PLGA, primeiramente solubilizou-se o polmero no clorofrmio
(soluo 10% m/v) durante 8 horas. Para cada agente a ser testado, foram separados 2
ml da soluo polimrica (PLGA+clorofrmio) e adicionou-se os diferentes agentes, na
proporo de 4% (v/v), alm de dimetilformamida (0,5 % v/v), com o objetivo de
diminuir a condutividade da soluo e melhorar a estabilidade do processo. As fibras de
acetato de celulose foram diludas em agua (15 % m/v), e adicionou-se o leo
correspondente na concentrao determinada. A
Tabela 1. Formulaes estudadas e nomenclatura usada neste estudo, concentraes em %m/v (massa de
polmero/volume de leo).

Amostra
Acetato
AC+Tea
AC+Coffe
PLGA
PLGA+Tea
PLGA+Coffe

Acetato de
Celulose
95
95
95
-

PLGA

Tea tree

Coffe

96
96
96

5
4
-

5
4

As solues foram colocadas em seringas de plstico (5,0 ml) e injetadas

atravs de agulhas de ao inoxidvel, que foram ligados a uma fonte de alimentao de
alta tenso usando voltagem de 13 kV com vazo de 2 mL/h de soluo polimrica. A
distncia entre a ponta da agulha e do coletor foi de 15 cm e o coletor formado por uma
placa metlica retangular. As solues foram injetadas por uma bomba de infuso e no

decurso entre a agulha e o coletor o solvente evapora restando apenas as fibras aderidas
sobre a folha de alumnio. Alm das fibras contendo os diferentes leos, foram
preparados filmes de PLGA, usadas como referncia e nomeadas PLGA e celulose sem
oleo essencial, para testes comparativos.
Os fragmentos de nanofibras foram cortados em igual tamanho e rea definida,
posteriormente esterilizados por exposio ao UV em fluxo laminar por 30 min de cada
lado da amostra. E. faecalis, ATTH ou S. mutans foram micro aerofilicamente incubados
a uma temperatura de 37 C, durante 24 h, inoculadas em Caldo de Soja Triptico (TSB)
(Bacto, Difco, USA), acrescido 200 g/L de sacarose. Posteriormente, as clulas foram
ressuspensas no volume total do experimento de TSB, acrescidos de sacarose (200 g/L),
a fim de obter uma DO630 (densidade ptica 600 nm).
Para quantificar o crescimento bacteriano (planctnico) o contedo de cada
poo foi homogeneizado e 200 l da fase lquida foram transferidos para uma nova
placa de 96 poos. A leitura da DO630 foi realizada atravs da leitura de microplacas.
O biofilme foi desagregado mecanicamente das nanofibras e a suspenso
bacteriana assim obtida foi semeada em placas de Petri contendo o meio BHI-agar. Para
a desagregao do biofilme, foram realizados trs ciclos de lavagem das amostras para
remoo das bactrias no aderidas. Em seguida estas amostras foram agitadas sobre o
vortex continuamente durante 60 s, e 100 l da suspenso bacteriana, que foram
semeados em BHI-gar, e incubadas por 24 h em estufa 37 C.
Analises em microscpio eletrnico de varredura (MeV) foram realizadas em
um equipamento da Hitachi, modelo TM3030.

Discusso
Nanofibras de acetato de celulose
A seguir so mostrados resultados selecionados que foram apresentados no 4
CONTEXMOD, realizado em Blumenau entre 09 e 12/08/2016.
Aps a contagem das colnias crescidas nas placas de Petri, quantificou-se a
formao do biofilme (Figura 1) e inibio do crescimento bacteriano (Figura 2).
As nanofibras incorporadas com tea tree apresentaram tendncia de inibio do
biofilme da E. faecalis. Por outro lado, as fibras contendo coffe apresentaram uma
tendncia maior na inibio de crescimento bacteriano contra a linhagem bacteriana
testada.

Figura 1. Leitura da microplaca 630 nm.

0.26
0.26
0.25
0.25
0.24
AC+
Crescimento
Coffe 0.34 Planctnico
AC + Tea Tree Oil 0.34
0.24

Acetato celulose

0.23
0.23
0.22
0.22

Figura 2. Quantificao do biofilme (UFC-Unidades Formadoras de Colnias) sobre as nanofibras com

diferentes extratos vegetais incorporados, diluio 10-6.
1800
1600
1400
1200
1000
UFC
AC + Coffe 0.34
800

AC + Tea Tree Oil 0.34

Acetato Celulose

600
400
200
0

Os ndices de inibio calculados para todas as amostras foram estatisticamente

semelhantes, demonstrando que a incorporao de 5,6 % de extrato nas nanofibras
representa uma quantidade saturante de extrato, no que diz respeito ao
antimicrobiana. Este resultado indica que a incluso destes extratos em nanofibras de
celulose pode resultar em um biomaterial com efeito antimicrobiano, capaz de inibir o
crescimento bacteriano. No que diz respeito capacidade de inibio de biofilmes,
devido esta interferncia no crescimento bacteriano, considera-se que quaisquer
efeitos observados na formao de biofilme sobre estes materiais corresponda na
realidade a um efeito indireto, no caracterizando, portanto, uma atividade especfica
sobre o biofilme.

A incorporao do tea tree nas nanofibras de celulose no resultou em inibio

de crescimento bacteriano, tornando interessante investigar para estas amostras uma
possvel atividade especfica sobre a inibio de formao de biofilmes (aderncia
bacteriana).
Nanofibras de PLGA
A Figura 1 mostra as imagens obtidas por anlise de Microscopia eletrnica de
varredura. Pode-se observar que o dimetro das fibras esta homogneo e no ocorreu a
formao de contas para os parmetros escolhidos.
Figura 1. Imagens MeV das amostras aps o teste de formao de biofilme: A) Tea Tree; B) Cofee; C)
PLGA.

As fibras contendo tea tree tiveram influncia significativa sobre a formao do

biofilme bacteriano testado (S. mutans) ao passo que as nanofibras contendo coffe no
mostraram influncia significativa na formao do biofilme comparadas as fibras
controle (PLGA), conforme mostrado na Figura 1. Por outro lado, nenhum destes
compostos mostrou influncia significativa no crescimento bacteriano (Figura 1). O
leo de ch tem composio heterognea. Hammer e colaboradores identificaram mais
de 100 compostos neste leo [25], sendo difcil identificar qual das molculas presentes
pode interferir no mecanismo de comunicao bacteriana. Alm disso, este leo tem
propriedades antibacterianas, porm no interferiu no crescimento bacteriano da S.
mutans (Figura 1) provavelmente devido ao fato de estar imobilizado no interior da
fibra.
Figura 1. Influncia dos diferentes aditivos na formao do biofilme.

Geralmente, a formao de biofilmes da bactria S. mutans tem sido descrita

como um processo complexo que inicia com a adeso de bactrias a uma superfcie,
seguida de interao clula-a-clula (envolvendo o sistema QS), formao da
microcolnia, proliferao e diferenciao. Entre as possveis molculas sinalizadoras
no caso da S. mutans, os peptdeos regulam a formao de biofilme no caso desta
bactria [26][28]. Alm disso, outra molcula indutora, AI-2, que tem funo na
comunicao inter espcies, j foi identificada em diversas bactrias presentes na boca
[29][31]. A presena destas bactrias na boca importante pois o AI-2 produzido por
elas tambm pode regular a formao de biofilme da S. mutans [32].
O mecanismo de ao dos inibidores de QS, tais como as furanonas, que estas
molculas, cujas estruturas so semelhantes aos autoindutres, podem ligar-se aos
reguladores de resposta presentes nas bactrias, sem ativ-los, inibindo assim a
transcrio dos genes responsveis pela atividade bacteriana (formao de biofilme,
virulncia, motilidade, entre outros). Uma das vantagens significativas desta abordagem
que estas molculas so utilizadas em concentraes em que no afetam o crescimento
e sobrevivncia da bactria, evitando assim uma presso seletiva e induo de
resistncia.
Figura 1. Influncia dos diferentes aditivos no crescimento bacteriano.

Concluses
Em concluso, este estudo demonstra que o tea tree usado pode inibir a formao
de biofilme da S. mutans, sem afetar a taxa de crescimento bacteriano. Alm disso,
quando avaliados os efeitos sobre a comunicao bacteriana, no apresentaram efeitos
irritativos ou genotxicos, mostrando que estas molculas atuam na comunicao
bacteriana e no indiretamente, como bactericidas. O tratamento de infeces baseado
principalmente em antibiticos. Isto pode, no entanto, em muitos casos, no ser
adequado, uma vez que geralmente antibiticos so desenvolvidos e testados contra
microrganismos planctnicos, desprezando a natureza dos microrganismos organizados
num biofilme. A rpida disseminao da resistncia antimicrobiana outro desafio. A
descoberta de que os microrganismos se comunicam uns com os outros para regular
coordenadamente genes abre novas possibilidades para combater infeces microbianas
ao direcionar sistemas de comunicao microbianas, que podem diminuir a formao de
biofilme e, assim, prevenir doenas causadas por biofilmes. Isso oferece a possibilidade
da utilizao destes compostos para prevenir a formao do biofilme da S. mutans, que
uma bactria importante presente na boca. Mais estudos vo contribuir para uma
abrangente e aprofundada compreenso dos mecanismos reguladores QS em S. mutans
alm da toxicidade destes compostos que um ponto importante a ser estudado para
aplicao, por exemplo, na rea odontolgica como curativos.

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