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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS DA SADE
DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS DE

MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

Roteiro de Aulas Prticas de Microbiologia e Imunologia

NDICE
I - ESTERILIZAO E DESINFECO -------------------------------------------------------- 3
II TCNICAS DE COLORAO DE BACTRIAS -------------------------------------------- 9
III MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ----------------------------------------------------16
IV ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS -------------19
V ANTIBIOGRAMA: TCNICAS DE PREPARAO E INTERPRETAO ---------------22
VI ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS ------------27
VII ASPECTOS MICROSCPICOS E MACROSCPICOS DOS FUNGOS -----------------33
VIII REAES ANTGENO ANTICORPO --------------------------------------------------37
IX REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ------------------------------------------------------41

Esterilizao e Desinfeco

I - ESTERILIZAO E DESINFECO
Esterilizao o processo de destruio por meio de agentes
fsicos ou qumicos de todas as formas de vida microbiana
(vrus, bactrias, fungos e esporos) presentes num material.
A esterilizao pode ser realizada por agentes fsicos e
qumicos.

ESTERILIZAO POR MTODOS FSICOS

1.
Calor mido
1.1.
Autoclavao - um processo de esterilizao pelo
vapor sob presso em cmaras conhecidas como autoclaves
onde vapor de gua mantido em temperatura acima de
100oC, pelo emprego de presso maior que a atmosfrica, a
uma temperatura de 121oC. O tempo de exposio depende do
material a ser esterilizado. Este processo utilizado
para esterilizar vidraria, instrumentos cirrgicos, meios
de cultivo e outros.
1.2.
Tindalizao ou esterilizao fracionada - Processo
de esterilizao na temperatura de 100oC durante 30
minutos,
repetindo-se
o
aquecimento
2
a
3
dias
consecutivos. Este processo usado na bacteriologia para
a esterilizao de certos meios de cultura que se alteram
em temperaturas elevada, como meios contendo acares,
leite etc.
2.
Calor Seco
2.1.
Forno de Pasteur - Neste processo so empregados
fornos ou estufas, onde a temperatura pode ser regulada e
mantida
pelo
tempo
necessrio
para
que
haja
esterilizao. realizada em temperatura de 170-180oC,
em estufas eltricas por 1 a 2 horas. O material a ser
esterilizado deve ser distribudo de modo uniforme para
facilitar a distribuio do calor que emana das paredes
laterais e da base da estufa. Este processo indicado
para
esterilizar
vidraria,
instrumentos
cirrgicos
passveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais
impermeveis como ceras, pomadas, p e leos.
2.2.
Incinerao - um processo usado para materiais
descartveis
e
carcaa
de
animais
utilizados
em
experimentos.
2.3.
Flambagem - Aquecimento direto na chama do bico de
Bunsen
utilizado
em
rotina
de
laboratrio
para
esterilizao de alas de platina e bordas da boca de
tubos e bales.

Esterilizao e Desinfeco

3.

Filtrao - um processo usado para esterilizao de

gases e lquidos tais como soros, solues de enzimas e
vitaminas, acares, que no podem ser submetidos ao
calor. A filtrao consiste em passar o material a ser
esterilizado por filtros de poros muito pequenos que no
permitem a passagem de bactrias e fungos.
3.1.
Tipos de filtros:
Disco de amianto - Filtro de SEITZ
Membrana de ester de celulose- Millipore
Filtros de partculas de ar de alta eficincia (HEPA)
removem quase todos os microrganismos maiores que
0,3m de dimetro. So utilizados para reduzir o
nmero de micrbios transmitidos pelo ar.

4.
Radiaes
4.1.
Radiao ultra-violeta (UV) tem sido utilizada na
esterilizao do ar e de ambientes. Na indstria de
alimentos
so
aplicados
para
esterilizao
de
superfcies de pes, xaropes, sacos plsticos, garrafas
de gua mineral, carnes mantidas sob refrigerao.
Porm, seu uso limitado, devido a seu baixo poder de
penetrao, pois trata-se de radiao no ionizante.
4.2- Raios gama e raios X (radiaes ionizantes)tm alto
poder de penetrao. Raios gama tem sido empregado na
esterilizao de certas vacinas e sanitizao de
alimentos embalados.

MTODOS QUMICOS

Glutaraldedo 2% - As solues de glutaraldedo so

indicadas para esterilizao ou desinfeco de instrumentos
mdicos cirrgicos sensveis ao calor, equipamentos de
anestesia
gasosa,
fibroscpios,
partes
pticas
de
endoscpios etc. Exposio em torno de 18 horas.
Formaldedo (Soluo Alcolica 8%) - A frmula alcolica
apresenta 8% de Formaldedo. Sua atividade germicida
atribuda inativao de protenas e cidos nuclicos
microbianos. Exposio em torno de 18 horas.
Formaldedo (soluo aquosa 10%) - As solues aquosas alm
de
no
liberar
vapores
irritantes
no
possuem
os
inconvenientes das solues alcolicas sobre lentes de
equipamentos pticos e artigos de poliestireno e borracha
em exposies prolongadas. Exposio em torno de 18 horas.
MTODOS FSICO-QUMICOS
Estes mtodos associam o produto qumico com o uso de
equipamentos, garantindo assim a efetividade ao processo e
a segurana dos profissionais de sade, sendo utilizado
para materiais termosensveis.
1 Esterilizao por xido de etileno: A esterilizao
realizada baixa temperatura em torno de 54C durante 8 a

Esterilizao e Desinfeco

12 horas. Para materiais de implantes e prteses se

recomenda uma aerao ambiental em torno de 7 dias.
Esterilizao por vapor de formaldedo baixa temperatura:
A esterilizao por vapor de formaldedo realizada em
autoclaves, em concentraes baixas em torno de 2% sob
forma de vapor, em temperaturas que variam entre 73C e
82C durante 90 e 180 minutos.
Precaues - As precaues recomendadas para estas solues
consistem em utilizar luvas ou pinas para o manuseio de
artigos nelas imersas e, nos casos das solues alcolicas,
mant-las em cubas de esterilizao fechadas em ambientes
ventilados.
DESINFECO E ASSEPSIA
* Desinfeco - A Desinfeco consiste na destruio ou
reduo dos microrganismos na forma vegetativa, presentes
num material inanimado ou superfcies inertes, mediante a
aplicao de agentes fsicos ou qumicos. A desinfeco no
implica a eliminao de todos microrganismos viveis, porm
elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfcies
ou local tratado.
* Assepsia - o termo usado para designar o processo de
desinfeco
de
tecidos
vivos.
Os
anti-spticos
so
preparaes
contendo
substncias
microbiocidas
ou
microbiostticas podendo ser usadas na pele, mucosas e
ferimentos.
Exemplos:
solues
alcolicas,
solues
iodadas, solues de permanganato de potssio, formulaes
base de sais de prata, iodforos, etc.
Obervaes:
No so recomendados a utilizao de iodofros no recmnascido, pois pode ocorrer absoro transcutnea de iodo
com supresso da funo tireoideana.
Para a finalidade de antissepsia, no so permitidas as
formulaes
contendo
mercuriais
orgnicos,
acetona,
quaternrios de amnio, hipoclorito a 0,5%, ter e
clorofrmio.
A desinfeco pode ser realizada por agentes fsicos e
qumicos.
AGENTES FSICOS:
1.0. Pasteurizao - um processo empregado na indstria de
alimentos que elimina microrganismos patognicos (bacilos
tficos,
paratficos
e
desintricos,
brucelas,
estreptococos, bacilo da tuberculose) de produtos como o
leite pasteurizado, vinho, cerveja, submetendo-os a
temperatura de 63oC por 30 minutos ou 75oC por 15
segundos.
Os tempos e as temperaturas de pasteurizao dependem do
mtodo e do produto a ser tratado. A pasteurizao no

Esterilizao e Desinfeco

um processo de esterilizao, uma vez que esporos e

bactrias no patognicas podem permanecer viveis.
1.1.
gua Fervente - Artigos de pequeno porte, depois de
lavados com detergente adequado, podem ser desinfetados
por imerso em gua a 100oC durante 10 minutos.
AGENTES QUMICOS:
Principais compostos utilizados em desinfeco e assepsia:

lcoois - solues a 70% e 80%

Fenis e Derivados - Fenol, Cresis, Ac. saliclico e c.
Benzico.
Iodo,
Iodforos
(Polivinil
PiralidonaHalognios
Iodo/PVP-I, cloro, Hipoclorito de Sdio ou clcio).
Metais Pesados - Mercrio (Mercrio Cromo, Mertiolato),
Prata (Nitrato de prata), Cobre (Sulfato de Cobre).
Corantes - Verde brilhante e malaquita. Violeta de
Genciana, Azul de Metileno.
Detergentes Sintticos
-Aninicos: laurilsulfato de sdio
-Catinicos: cloreto de cetilpiridnio.
Oxidantes - gua oxigenada, permanganato de potssio.
cidos, lcalis - c. Sulfrico, c. clordico, soda
(NaOH).

NOTAS:
As seguintes precaues devero ser tomadas para evitar
a sobrevivncia de microrganismos contaminantes, falhas de
esterilizao ou a recontaminao dos artigos esterilizados,
independentes do processo de esterilizao.
1.

A escolha do processo de esterilizao

Processo de esterilizao mais eficaz o vapor saturado

sob presso, seguindo-se o calor seco e os esterilizantes
qumicos.A escolha depende da natureza do artigo a ser
esterilizado.
2.
Limpeza prvia
A presena de matria orgnica (leo, gordura, sangue, pus
e outras secrees) protege os microrganismos contaminantes
do contato indispensvel com o agente esterilizante. Por
outro lado, quanto menor for o nmero de microrganismos
presentes, maior ser a possibilidade de esterilizao.
Assim, necessrio lavar cuidadosamente todos os artigos
em
solues
desencrostantes
(hiploclorito
de
sdio,
detergentes sintticos etc), e enxagu-los abundantemente
com gua corrente e no ltimo enxague com gua destilada ou
deionizada antes de submet-los a qualquer processo de
esterilizao.
3.

Invlucros e pacotes

Esterilizao e Desinfeco

4.

5.

Os invlucros devem permitir o contato dos artigos com o

agente
esterilizante,
bem
como
mant-los
livres
de
microrganismos durante a estocagem. A permeabilidade ao
vapor e ao xido de etileno, a impermeabilidade a
partculas,
a
ruptura
e
a
flexibilidade
so
as
caractersticas mais importantes para a seleo de um
invlucro.
Estocagem
Aps a esterilizao, essencial que os pacotes estejam
ntegros secos e frios, a fim de conservarem a esterilidade
dos artigos neles contidos. Se o pacote, ao ser removido da
cmara ainda estiver quente, o vapor contido no papel
condensa na temperatura ambiente, criando uma presso
negativa que aspira o ar (contaminado) do ambiente atravs
do invlucro. Este atua como se fosse um filtro, deixandose penetrar pelo ar e retendo clulas, partculas
bacterianas ou no. Se este invlucro no estiver ntegro,
os artigos no pacote sofrero recontaminao. A umidade
alm de diminuir a resistncia de invlucros de papel,
facilita rupturas e interfere no mecanismo de filtrao do
ar. Para evitar a contaminao posterior, recomenda-se o
uso de cestos metlicos.
Os pacotes esterilizados devem ser manuseados o menos
possvel, sempre com delicadeza e estocados em ambientes
limpos e secos (30 a 60% de umidade) e temperatura em torno
de
25oC,
reesterilizados
quinzenalmente
quando
no
utilizados.
Medidas Preventivas

Uso de luvas, Avental e, se necessrio, mscara.

Materiais contaminados por agentes patgenos devem ser
esterilizados antes de serem descartados.
Aps o manuseio de materiais contaminados por agentes
microbianos, lavar cuidadosamente as mos com sabo ou
solues detergentes antisspticas, como solues aquosas
de Polivinil Pirrolidona-Iodo (PVP-I) a 10%, cloro-hexidina
a 4% ou hexaclorofeno a 3% adicionado de 0,3% de
clorofenol.
Aula Prtica - Anlise do efeito da ao de anti-spticos
relacionada ao crescimento bacteriano.
Objetivo: Observar o efeito de anti-spticos sobre
crescimento bacteriano na superfcie da pele das mos.

Esterilizao e Desinfeco

Materiais:
Swab estril
Placa com meio de cultura gar nutriente.
Anti-spticos: Sabo lquido e Soluo lcool-iodado e
lcool 70%
Tcnica:
1. Abrir a placa rapidamente e colocar a ponta dos dedos,
sobre a superfcie do meio de cultura. Fechar a placa.
2. Lavar as mos com gua corrente e sabo lquido, deixar a
gua escorrer espontaneamente em seguida colocar a ponta
dos dedos sobre a superfcie do meio de cultura. Fechar a
placa rapidamente.
3. Friccionar a ponta dos dedos com soluo de lcool iodado
2%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos
sobre o meio de cultura, como item 2.
4. Friccionar a ponta dos dedos com soluo de lcool 70%.
Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos sobre o
meio de cultura, como item 2.
5. Incubar a 37C por 24 horas.
OBS:
Esta prtica dever ser realizada com apenas um aluno de
cada grupo.
Para observao da eficcia dos anti-spticos, utilizar
dedos diferentes.
Resultado:
Ao dos Agentes
lcool Iodado
lcool 70%
Sabo
Sem anti-spticos

Crescimento Bacteriano

Tcnicas de Colorao de Bactrias

II TCNICAS DE COLORAO DE BACTRIAS

As tcnicas de colorao iniciadas por Paul Erlich e
Robert Koch (1843-1910) permitiram ao microbilogo distinguir
as clulas bacterianas quanto a sua morfologia, tamanho e
arranjo celular e diferenci-las de acordo com as suas
caractersticas tintoriais. Os corantes so divididos em dois
grupos: os cidos e os bsicos. Os corantes bsicos so sais
com base corada que se unem eficazmente a substratos cidos,
tendo uma grande afinidade para corar material nuclear (azul
de metileno, cristal violeta, fucsina bsica, safranina). As
bactrias comportam-se como material nuclear e desse modo,
quase todos os corantes utilizados em bacteriologia so
corantes bsicos. Os corantes cidos tendem a corar mais
eficientemente os substratos bsicos, como o citoplasma.

MORFOLOGIA
As
clulas
bacterianas
so
caracterizadas
morfologicamente pelo tamanho, forma e arranjo.
Tamanho - as bactrias so microscpicas medindo desde 0,3
por 0,8m at 10 por 25m. As espcies de maior interesse
mdico medem entre 0,5 a 1m por 2 a 5m.
Forma - as bactrias podem ser classificadas quanto a forma
em trs grupos bsicos:
Cocos - clulas esfricas.
Bacilos - clulas cilndricas, em forma de bastonetes.
Espirilos - clulas espiriladas. Algumas delas se comportam
como bacilos curvos, em forma de vrgula, que podem ser
denominados vbrios. Ex: Vibrio cholerae.
Arranjos - Grupamentos bacterianos.
Dependendo do plano e do nmero de divises atravs das
quais as bactrias continuam unidas, podem aparecer os
seguintes arranjos:
1.Cocos
Pares: diplococos (ex.: gonococos)
Cadeias: (ex.: estreptococos)
Ttrades ou cbicos (Sarcina)
Cocos em cachos (ex.: estafilococos)
2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como clulas
isoladas, porm ocasionalmente, pode-se observar: bacilos
aos pares (diplobacilos) ou em cadeia (estreptobacilos).
Aps a diviso de algumas bactrias, podem ocorrer
movimentos caractersticos, por exemplo:, um movimento em
chicotada pode levar as bactrias a posies paralelas.

Tcnicas de Colorao de Bactrias

10

Divises repetidas e seguidas desses movimentos determinam

posies semelhantes a letras chinesas caractersticas do
bacilo diftrico.

PREPARAO DE ESFREGAO BACTERIANO PARA COLORAO

1-Preparao a partir de meio lquido
Usando ala de platina estril, colocar duas a trs
alquotas de cultura bacteriana preparada em meio lquido
sobre a superfcie de uma lmina de microscopia.
Espalhar sobre a lmina, fazendo movimentos circulares
de dentro para fora e deixar o esfregao secar a temperatura
ambiente. Em seguida, realizar a fixao passando duas a trs
vezes a lmina na chama do bico de Bunsen.
2-Preparao a partir de meio slido
Colocar uma pequena gota de gua destilada numa lmina.
Com ala de platina colocar sobre a lmina uma pequena poro
do crescimento bacteriano. Espalhar sobre a lmina e
prosseguir a preparao como no item anterior.
3-Preparao a partir de material biolgico
Usando um swab estril (zaragatoa), friccionar a
superfcie da mucosa ou leso oral por exemplo e fazer um
esfregao circular na superfcie de uma lmina. Deixar secar
temperatura ambiente. Recolocar o swab dentro do tubo de
ensaio e executar a fixao, como no item anterior.

COLORAO SIMPLES
Tcnica de colorao caracterizada pelo uso de apenas um
corante, permitindo a observao da forma, tamanho e
grupamento da clula bacteriana. Esta tcnica de colorao
bastante utilizada para a deteco de cocos que causam
meningite (Neisseria meningitidis), em amostra de lquido
cefalorraquidiano (LCR).
MTODO
1)Preparar o esfregao bacteriano em lminas;
2)Cobrir toda a lmina com soluo de azul de metileno, aguar
dar 5 minutos e desprezar o corante na pia;
3)Lavar a lmina rapidamente em gua corrente, secar com
papel de filtro ou temperatura ambiente (sem esfregar) e
observar em objetiva de imerso.
RESULTADO
Visualizar, descrever a
bactrias existente na lmina.

morfologia

arranjo

das

Tcnicas de Colorao de Bactrias

11

COLORAO DE GRAM (Colorao diferencial)

Este mtodo de colorao foi empiricamente desenvolvido
pelo bacteriologista dinamarqus, Christian Gram, em 1884, e
permite distino entre diferentes bactrias que podem
mostrar uma morfologia similar, porm com propriedades
tintoriais diferentes. A colorao de Gram classifica as
bactrias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas.
TCNICA DE COLORAO DE GRAM
1)cobrir toda a lmina com soluo de cristal violeta,
aguardar um minuto e desprezar o corante na pia;
2)cobrir a lmina com lugol, aguardar um minuto, desprezar o
lugol na pia;
3)inclinar a lmina e gotejar lcool-acetona at que no haja
desprendimento de corante (cerca de 30 segundos), lavar a
lmina rapidamente em gua corrente.
4)cobrir a lmina com fucsina de Gram e aguardar 30 segundos.
Lavar, secar e observar em objetiva de imerso.
NOTAS
1)O Cristal violeta s se liga a parede celular bacteriana
aps a adio da soluo de lugol (mordente)
2)O etanol poder ser usado como agente descorante fraco.
3)O
material
dos
corantes
empregados
na
tcnica,
principalmente
sedimento
do
cristal
violeta,
poder
aparecer como artefato.
4)O descoramento para mais ou menos resultante da incorreta
diferenciao pelo lcool-acetona.
5)A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental
na colorao de Gram. Em culturas envelhecidas, clulas
Gram Positivas freqentemente se tornam Gram Negativas.
Enzimas lticas excretadas normalmente por culturas
envelhecidas podem causar danos parede da clula, como por
exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes (lcoolacetona). Conseqentemente, o complexo iodo cristal violeta
poder ser retirado da clula, nessa fase de colorao.
RESULTADO
Visualizar, desenhar a morfologia e classificar as
bactrias nas lminas de acordo com o seu comportamento
diante dos corantes de Gram:
Bactrias Gram positivas

coradas em roxo
Bactrias Gram negativas

coradas em rosa
INTERPRETAO
A colorao de Gram classifica as bactrias em Gram
positivas ou Gram negativas. O mecanismo da colorao de
Gram, se refere composio da parede celular, sendo que as
Gram positivas possuem espessa camada de peptidoglicano e
cido teicico, e as Gram negativas, uma fina camada de

Tcnicas de Colorao de Bactrias

12

peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta

por
lipoprotenas,
fosfolipdeos,
protenas
e
lipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, o
tratamento com o lcool (ou lcool-acetona) extrai os
lipdeos, da resultando uma porosidade ou permeabilidade
aumentada da parede celular das bactrias Gram negativas.
Assim, o complexo cristal violeta iodo (CV-I) pode ser
retirado e as bactrias Gram negativas so descoradas. A
parede celular das bactrias Gram positivas, em virtude de
sua composio diferente, torna-se desidratada durante o
tratamento com lcool, a porosidade diminui, a permeabilidade
reduzida e o complexo CV-I no pode ser extrado.
COLORAO DIFERENCIAL PELO MTODO DE ZIEHL-NEELSEN (1882)
A colorao de Ziehl-Neelsen o mtodo para a pesquisa
de bacilos lcool cido resistentes (BAAR) incluindo-se o
bacilo da tuberculose, o bacilo de Hansen e micobactrias
atpicas. Este mtodo de colorao se baseia na propriedade
das
micobactrias
de
se
corarem
inicialmente
pela
carbolfucsina (a fucsina dissolvida numa soluo de fenollcool-gua) e resistirem a uma descolorao por lcoolcido.
Atravs desta colorao, podemos visualizar um grupo
restrito de bactrias que possuem sua parede celular
constituda de lipdeos em grande concentrao, devido a
presena de cras e cidos graxos de cadeia longa(cidos
miclicos), que conferem clula a caracterstica de lcoolcido resistncia.
COLETA DO MATERIAL
1- Coletar a amostra, antes da antibioticoterapia.
2- Obter, de preferncia o primeiro escarro da manha antes da
ingesto de alimentos.
3- Orientar o paciente para escovar os dentes com gua (no
utilizar pasta dental) e enxaguar a boca varias vezes,
inclusive com gargarejos.
4- Respirar fundo, umas oito ou dez vezes, e tossir
profundamente, recolhendo o material no frasco de coleta
estril.
5- Quando o material produzido for escasso, coletar amostra
aps nebulizao.
6- Enviar ao laboratrio o mais breve possvel.
O escarro obtido deve ser purulento. As amostras salivares
so imprprias para anlise bacteriolgica, pois no so
representativas do processo infeccioso.

Tcnicas de Colorao de Bactrias

13

PREPARAO DO ESFREGAO
Colocar as amostras em lminas (novas e desengorduradas)
com aplicador de madeira. Escolher a partcula mais densa ou
uma mistura da amostra, quando s existirem pequenas
partculas purulentas ou mucosas. E com aplicador estirar a
amostra em 1/3 da lmina, deixar secar temperatura ambiente
e fixar como no procedimento anterior.
Tcnica:
1)Cobrir toda a lmina com fucsina fenicada.
2)Com auxlio de uma chama, aquecer a lmina, pela sua parte
inferior at emitir vapores. Repetir duas vezes esperando o
corante esfriar. Aguardar 5 minutos, no deixando o corante
nem ferver nem secar.
3)Lavar a lmina com gua corrente, suavemente.
4)Inclinar a lmina descorar com soluo lcool cido
clordrico, at no sair mais corante.
5)Lavar a lmina com gua corrente.
6)Cobrir o esfregao com soluo de azul de metileno de
Loeffler durante 30 segundos.
7)Lavar a lmina em gua corrente.
8)Deixar secar e observar ao microscpio, com a objetiva de
imerso.
Notas:
1.Na colorao de Ziehl, o aquecimento no deve ser feito
muito intenso, a ponto de ferver o corante, mas apenas at
ligeira emisso de vapores.
2.A colorao de fundo feita para corar bactrias e outras
estruturas
que
foram
diferenciadas,
para
o
efeito
contrastante ou distino entre as bactrias e clulas
presentes no material.
RESULTADO:
Visualizar, esquematizar e classificar as bactrias
existentes nas lminas. A classificao dever ser quanto
resistncia ou no das bactrias ao descoramento em lcool
cido.
Bactrias lcool cido resistente (BAAR) permanecem
coradas de vermelho pela fucsina.
Bactrias no lcool cido resistente (BNAAR) no retm
a fucsina, aparecem coradas pelo azul de metileno.

Tcnicas de Colorao de Bactrias

14

TCNICAS DE PREPARAO DOS CORANTES DE GRAM

Preparao do Cristal
Cristal violeta
cido fnico
lcool absoluto
gua destilada

de Violeta:
1g
2g
10ml
100ml

Triturar num gral de vidro o corante e acrescentar o

lcool. Juntar aos poucos o cido fnico, misturando sempre,
de modo a obter uma mistura bem homognea. Juntar a gua
pouco a pouco, misturando bem. Filtrar aps 24 horas de
repouso, em papel de filtro.
Preparao do Lugol:
Iodo
Iodeto de potssio
gua destilada

1g
2g
300ml

Triturar o iodo com o iodeto de potssio em gral de

vidro. Juntar a gua e misturar bem. Preparar em quantidade
que seja usada antes de 30 dias.
Preparao de lcool acetona:
lcool
800ml
Acetona
200ml
Unir os dois componentes e misturar bem.
Preparao da Fucsina para Colorao de Gram:
Fucsina
2,5g
lcool etlico
100ml
gua destilada
90ml
A soluo estoque (fucsina e lcool etlico) deve ser
preparada unindo-se os dois componentes e misturando bem.
Para usar 10ml da soluo em 90ml de gua destilada, isto ,
diluir a 10% em gua destilada.
Armazenamento de corantes:
Os corantes devem ser estocados em frascos de vidro
mbar em local onde as condies ambientais sejam favorveis,
com temperatura entre 20 e 25C (T.A.) e sem teor de umidade.

Tcnicas de Colorao de Bactrias

TCNICAS DE PREPARAO DOS

Preparao de Fucsina
Fucsina bsica
lcool a 95%
Fenol fundido
gua destilada

15

CORANTES DE ZIEHL-NEELSEN
fenicada:
1g
10ml
5g
100ml

Dissolver num gral o corante no lcool. Adicionar aos

poucos o cido fnico, misturando sempre, de modo a obter uma
mistura bem homognea. Juntar a gua pouco a pouco, lavando o
gral.
Filtrar aps 24 horas de repouso.
cido clordrico
lcool 95%
cido clordrico (dens. 1,19)

100ml
1ml

Azul de Loeffler
A)Azul de metileno
lcool a 95%
B)Soluo de hidrato de sdio a 0,01%
gua destilada

10,3g
30ml
1ml
100ml

Misturar A) e B). Diluir 10 vezes em gua destilada.

Meios de Cultivo Bacteriano

_______________________________________________________________________

16

III MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO

Meios de cultivo so compostos de gua e de nutrientes
essenciais ao crescimento de microrganismos.
Basicamente, um meio de cultivo deve conter alm de
extrato
de
carne
para
o
fornecimento
de
protenas,
carboidratos e sais, peptona e Cloreto de Sdio.
A constituio de um meio de cultivo adequado bastante
variada
e
depende
das
exigncias
nutricionais
do
microrganismo.
Os meios de cultivo so utilizados para o isolamento e
identificao de microrganismos, testes para controle de
esterilizao ambiental, anlise de alimentos e de gua, etc.
Os meios de cultivo podem ser preparados no laboratrio
de microbiologia de duas formas: (1) a partir de seus
ingredientes
bsicos,
(2)
dos
desidratados
disponveis
comercialmente, ou podem ser comprados prontos para uso em
tubos de ensaio ou placas de Petri.
Didaticamente,
os
meios
de
cultivo
podem
ser
classificados quanto consistncia e quanto funo.
a) Quanto consistncia: o meio pode ser lquido, semi-slido
e slido.
Meio lquido: aquele em que os nutrientes esto
dissolvidos em aquosa. So os caldos (broth).
Meio semi-slido: Esse meio possui na sua composio alm
dos nutrientes, gar (polissacardeo extrado de algas
marinhas) a 0,5%.
Meio slido: um meio que possui na sua composio
nutrientes e um teor de 1,5% de gar. Apresentado em placas
ou tubos inclinados ou no.
b) Quanto funo: O meio de cultivo pode ser enriquecedor,
seletivo, diferenciador e de manuteno.
Meio enriquecedor ou enriquecido: aquele que permite o
crescimento de microrganismos exigentes que necessitam de
fatores de crescimento.
Ex.: BHI, gar sangue, gar chocolate.
Meio seletivo: aquele que contm substncias que inibem o
crescimento de certos microrganismos, sem impedir o
crescimento de outros.
Ex.: gar SS (Salmonella, Shigella)
Meio diferenciador ou indicador: empregado para detectar
colnias
bacterianas
com
propriedades
distintas.
As
bactrias acidognicas so conhecidas pela ao da cor do
indicador cido-base adicionado ao meio. As bactrias que
hidrolisam o amido podem ser conhecidas pelas zonas claras
produzidas
nos
meios
contendo
suspenses
de
amido.
Bactrias hemolticas so visualizadas pelas alteraes
produzidas no gar sangue. Os produtores de gs sulfdrico

Meios de Cultivo Bacteriano

_______________________________________________________________________

17

formam uma zona escura de sulfito ferro no meio contendo

excesso de ferro.
Ex.: gar EMB, gar sangue.
Meio de manuteno: um meio utilizado para estocagem e
deve ser de baixo teor nutritivo para evitar a rpida morte
celular, devido a eliminao de substncias txicas
resultantes do metabolismo dos microrganismos.
Ex.: gar Nutriente.
Preparao:
Um fator que influencia na preparao do meio de cultivo
a temperatura. Ao preparar um meio de cultivo no podemos
manter temperatura ambiente uma soluo no estril por
mais de uma hora, devido a possibilidade de evaporao da
gua e de crescimento microbiano. Alguns componentes so
utilizados pelos microrganismos e os demais, pelo efeito da
evaporao, se concentram. Aps preparados os meios devem ser
esterilizados pelo processo de esterilizao adequada.
Tcnica
Preparao de meio lquido: Meio de B.H.I. (Brain-HeartInfusion).
Componentes do meio:
Infuso de corao ................... 250g
Infuso de crebro ................... 200g
Peptona ............................... 10g
Dextrose................................ 2g
Cloreto de Sdio ....................... 5g
Fosfato de Sdio ..................... 2,5g
gua destilada ...................... 100ml
Execuo
a)Adicionar 100ml de gua destilada aos ingredientes
previamente pesados;
b)Dissolver o meio aquecendo em chama de bico de Bunsen
ou forno de microondas;
c)Distribuir o meio em tubos 16x16 aproximadamente 10ml
por tubo. Colocar tampo de algodo em cada tubo;
d)Autoclavar (121C por 15 a 20 minutos).
Preparao de meio slido: Meio gar nutriente (gar Base) ou
gar Gelose.
Componentes do meio:
Extrato de Carne ....................... 3g
Peptona ................................ 5g
gar ................................. 15g
gua destilada ..................... 1000ml

Meios de Cultivo Bacteriano

_______________________________________________________________________

18

Conservao dos meios de cultivo

Aps preparados, os meios devem ficar temperatura
ambiente at o esfriamento total. Quando a quantidade de meio
preparado for pequena e de uso imediato (uma semana), deve
ser armazenado em geladeira dentro de sacos plsticos para
evitar desidratao. Quando a quantidade de meio for grande e
no de uso imediato, deve ser distribudo em frascos com
rolha,
selados
com
tampas
de
alumnio
e
logo
aps
autoclavados.
A maioria dos meios de cultura na forma desidratada pode
ser conservada temperatura ambiente durante anos e outros
que contenham substncias termolbeis em sua composio so
guardados em geladeiras.
Para usar frascos de meio lquido, abrimos o selo de
alumnio, retiramos a rolha de borracha com cuidados
asspticos e, em ambiente estril, transferimos o meio para
tubos estreis (atravs de pipetas).
Para usar frascos de meio slido, fundimos o gar
imergindo o frasco fechado, em banho-maria fervente ou forno
de microondas a temperatura de 100oC. Aps a fuso do gar
abrimos o selo de alumnio, retiramos a rolha de borracha e
transferimos o meio para tubos (atravs de pipetas estreis)
ou para placas de Petri e deixamos solidificar a temperatura
ambiente.

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Positivas

_______________________________________________________________________

19

IV ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS

Em se tratando de material clnico para ser submetido a
exame
bacteriolgico
este
deve
ser
colhido
antes
da
administrao de antimicrobianos, porque se a bactria for
sensvel quele antibitico, dificilmente ela crescer nos
meios de cultura. A bactria poder estar morta no momento da
colheita ou ento ter o seu crescimento inibido pelo
antimicrobiano presente no material clnico.
1- ISOLAMENTO - As bactrias podem ser cultivadas in vitro em

meios de cultura que lhes forneam todas as condies

nutricionais e ambientais necessrias ao seu crescimento.
As culturas so feitas pela semeadura dos materiais
clnicos em meios slidos distribudos em placa de Petri, em
tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos.
Depois de semeados os meios devem ser incubados em
temperatura e atmosfera adequadas. O perodo de incubao
varia de acordo com a velocidade de crescimento da bactria.
A grande maioria das bactrias pode ser cultivada em 24 a 48
horas. Excees so feitas para o cultivo de Neisseria (1416hs) e Mycobacterium (at 21 dias).
Material para colheita e isolamento:
Abaixador de lngua
"Swab"
gar sangue
Procedimento:
Transferir a amostra colhida com o "Swab" para um ponto
da superfcie do meio distribudo em placa e semear pela
tcnica de estrias. Incubar a placa a 37C por 24h e fazer a
identificao
bioqumica
e
diferenciao
de
atividade
hemoltica e enzimtica.
2- IDENTIFICAO:

2-1 Gnero: Streptococcus

As
espcies
de
maior
interesse
Streptococcus
pyogenes,
Streptococcus
Streptococcus pneumoniae.

clnico
so:
agalactiae,

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Positivas

_______________________________________________________________________

20

Atividade hemoltica
Os estreptococos podem ser classificados de acordo com o
atividade hemoltica no no meio de gar sangue em:
a)-hemolticos: quando lisam completamente as hemcias
(in vitro) liberando hemoglobina e formando uma zona
clara ao redor da colnia.
b)-hemolticos: quando causam lise incompleta das
hemceas com liberao de pigmento verde (reduo da
hemoglobina) promovendo uma zona esverdeada ao redor
da colnia.
c)-hemoltico: ausncia de atividade hemoltica.
Morfologia celular:
Corados pelo mtodo de Gram, aparecem como Gram
positivos esfricos ou lanceolados, de tamanho varivel,
isolados ou em grupos formando cadeias curtas ou longas.
Diferenciao bioqumica:
Estreptococos -hemolticos
Utilizar o Teste de sensibilidade a Optoquina para
diferenciar o Streptococcus pneumoniae (sensvel a optoquina)
de estreptococos viridescentes (resistente a optoquina), e o
Teste de Solubilidade em Bile. As bactrias solveis em Bile
so da espcie Streptococcus pneumoniae, as bactrias
insolveis em Bile so de estreptococcos viridescentes.
Estreptococos -hemolticos
Os estreptococos -hemolticos elaboram carboidratos
grupo-especficos. Estes carboidratos so utilizados em
reaes de precipitao com anti-soros especficos, que
possibilitem a separao dos grupos. Grupo A representado
pelo Streptoccus pyogenes.
1. O Teste de sensibilidade Bacitracina permite separar os
estreptococos do grupo A (cerca de 85%) dos demais grupos.
Nos resultados de identificao baseados nesta prova devese indicar estreptococos -hemolticos do grupo A pelo
teste de Bacitracina.
2. Pyr Teste Baseado na hidrlise enzimtica da Lpyrrolidonyl-beta-naphtylamide. Destina-se a identificao
do Streptococcus pyogenes. A hidrlise atravs da enzima Lpyrroglutamyl-aminopeptidase, presente nesta bactria
verificada atravs da reao do PYR Reagente com a betanaphtylamide livre que forma uma base de SHIFF de colorao
vermelha-cereja.

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Positivas

_______________________________________________________________________

2-2 Gnero Staphylococcus

As trs espcies de maior interesse
Staphylococcus
aureus,
Staphylococcus
Staphylococcus saprophyticus.

21

clnico so:
epidermidis,

Morfologia celular
So cocos Gram positivos que podem apresentar-se
isolados ou em pares, em pequenas cadeias ou aglomerados em
cachos.
Identificao e diferenciao
a)Atividade enzimtica
Prova de coagulase:
A 0,5ml de plasma de coelho, adicionar 0,1ml de cultura em
caldo. Incubar em banho-maria a 37C e verificar a intervalos
de 30 minutos, se h formao de cogulo. O Staphylococcus
aureus produtor de coagulase.
O Staphylococcus epidermidis, no produtor de coagulase,
usualmente
considerado
no
patognico
mas
pode
estar
envolvido
em
certas
situaes
clnicas:
endocardite
bacteriana, em cirurgia com prtese, em transplante de medula
e em cateterismo venoso (Manual de Procedimentos Bsicos em
Microbiologia Clnica Ministrio da Sade).
b)Sensibilidade a novobiocina
Teste de novobiocina
Preparar uma suspenso em caldo e semear em gar. Colocar um
disco de novobiocina (5mg), incubar a 37C por 24 horas e
verificar a formao de um halo de inibio de 14mm.
Esse teste diferencia o S. saprophyticus (resistente a droga)
do S. epidermidis (sensvel a droga). O S. saprophyticus
causa relativamente freqente de infeco do trato urinrio
em pacientes jovens.

Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao

___________________________________________________________________________

22

V ANTIBIOGRAMA: TCNICAS DE PREPARAO E INTERPRETAO

Introduo:
A anlise da sensibilidade das bactrias aos agentes
antimiccrobianos est relacionada vrias tcnicas ou
mtodos laboratoriais in vitro utilizados para determinar a
sensibilidade e a resistncia de determinado microrganismo a
antimicrobianos.
DETERMINAO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS EM BACTRIAS
A identificao de bactrias isoladas de espcimens
clnicas necessita de teste complementar para determinar o
perfil
de
sensibilidade
daquela
espcie
frente
a
quimioterpicos antimicrobianos (Antibiograma). As drogas
disponveis no combate quela infeco, so estudadas por
grupos (aminoglicosdeos, betalactmicos, fluorquinolonas,
macroldeos,
peptdeos
e
sulfas)
e
em
concentraes
padronizadas (proporcionais s concentraes atingidas no
soro de pacientes em tratamento) obtidas por estudo "in
vitro". Drogas que mostraram-se inibidoras para determinado
isolado bacteriano so selecionadas pela seletividade txica,
efeitos secundrios, facilidade de administrao (oral e
parenteral), e pelos custos do tratamento. Vrias tcnicas
foram desenvolvidas mas a metodologia desenvolvida por Kirby,
Bauer & Turck (1966) utilizada mundialmente por apresentar
resultados rpidos e seguros.
Um segundo tipo de teste de sensibilidade realizado
utilizando-se espcies no patognicos, para fins de pesquisa
bsica, quando se deseja estudar mecanismos de ao das
drogas ou modelos de resistncia antimicrobiana ou ainda para
marcar uma populao. Neste caso, so determinados os grupos
de drogas e a concentrao mnima inibitria (CMI) por mtodo
quantitativo.
Objetivos:
1) Avaliao da atividade e do espectro de ao de novos
agentes antimicrobianos;
2) Nos estudos de populaes bacterianas, para estabelecer o
padro
de
sensibilidade
sob
o
efeito
seletivo
de
antimicrobianos;
3) Como marcadores epidemiolgicos.
Fundamento: Substncias antimicrobianas so incorporadas ao
meio
de
cultivo
(lquido
ou
gar),
em
concentraes
inibitrias para aqueles organismos sensveis. A concentrao
dada em g/ml ou Unidades Internacionais (UI).

Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao

___________________________________________________________________________

23

Mtodos:
1.Qualitativo - Pesquisa que grupos de drogas antimicrobianas
so bactericidas para determinada espcie bacteriana numa
determinada
concentrao.
Ex.:
Tcnica
de
Kirby
Bauer(1966).
2.Quantitativo - Pesquisa que concentrao de determinada
droga
antimicrobiana

inibitria
para
uma
espcie
bacteriana isolada. Determinao da concentrao mnima
inibitria (CMI).
Mtodo de difuso com disco (Tcnica Kirby Bauer):
Difuso da droga, sob forma de disco ou comprimido na
superfcie do meio slido.
1. Padronizao do inculo bacteriano:
A partir da placa original da cultura bacteriana do
microrganismo a ser testado so transferidas 4 a 5 colnias
para um meio de cultura lquido (Caldo-Soja-Casena, Caldo
BHI, caldo Mueller-Hinton). Em seguida, incuba-se durante 2 a
4 horas. A densidade do inculo deve ser comparada com a
escala de turbidez de McFarland (cido sulfrico + cloreto de
brio), equivalente a 104 bactrias por ml de meio.
2. Semeio: Realizado atravs de swab estril embebido no
inculo bacteriano e passado em toda a rea da superfcie do
meio gar Mueller-Hinton (crescimento confluente). Deixar
secar por 2 minutos.
Com auxlio de uma pina estril colocar sob a
superfcie do meio inoculado os discos de antibiticos em
pontos eqidistantes (30 mm).
Incubar a temperatura ideal para o crescimento daquela
populao bacteriana por 18-24h.
Leitura: Observar halo de inibio em torno do disco de
antimicrobiano. O dimetro deste halo medido em mm
(halmetro) e comparado com a tabela recomendada pelo NCCLS
(National Committee for Clinical Laboratory Standards). Para
cada agente antimicrobiano, o dimetro do halo poder ser
interpretado
como
sensvel
(S),
resistente
(R)
ou
intermedirio (I).
Teste E: Mtodo de difuso mais avanado que permite estimar
a concentrao mnima inibitria (CMI), a mais baixa
concentrao
de
antibitico
que
impede
o
crescimento
bacteriano. Uma tira revestida de plstico contendo um
gradiente de concentrao do antibitico, e a CMI pode ser
lida em uma escala impressa na tira.
Utilizao de Drogas de baixa difuso: molculas grandes e
polarizadas. Considerar pequenos halos como sensveis.
Drogas de
Considerar

alta difuso: molculas pequenas

halos com maiores dimetros que

e apolares.
os padres.

Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao

___________________________________________________________________________

24

Considera-se uma populao sensvel a determinada droga

quando esta populao inibida por concentrao trs ou mais
vezes inferior a concentrao que a substncia atinge no
sangue. Amostras resistentes so inibidas por concentraes
intermedirias.
Ex.:
Droga
X
atinge
concentrao
srica
de
32g/ml.
Populaes que so inibidas por 8g so consideradas
sensveis e aquelas inibidas por concentraes acima de 16g
consideradas resistentes.
Fatores Intervenientes capazes de alterar a interpretao:
1.Utilizao de meio muito ricos ou muito pobres em
composio de "simular" falsos microrganismos resistentes ou
sensveis.
2.Utilizao de inculos muito concentrados (densos) e
formao de tapetes de clulas mortas entre bactrias vivas e
a droga.
3.Para algumas infeces como difteria (C. diphteriae),
meningite meningoccica no so realizados antibiogramas.
Utilizam-se drogas de escolha.
4.Devido a variabilidade de marcas de resistncia a
drogas
devem
ser
realizados
sempre
nas
bactrias
Enteropatognicas
(Salmonella,
Shigella,
E.
coli
soropatognicas e para Mycobacterium tuberculosis).
5.Observar a concentrao da droga que impregna o papel
de filtro que compe o disco ou comprimido.
6.Observar prazo de validade das drogas ensaiadas.
Seleo de substncias antibiticas:
Bactrias gram positivas: Penicilina, Eritromicina,
Clindamicina,
Gentamicina
e
Tetraciclinas.
Para
Staphylococcus no precisa testar Ampicilina e Carbenicilina
(Produtores de betalactamases). A meticilina representa
betalactmico (penicilina) no degradada pela betalactamase.
Bactrias
gram
negativas
(Enterobacteriaceae):
Ampicilina,
Cefalosporinas,
Gentamicina,
Tetraciclinas,
Cloranfenicol, Trimetoprim + Sulfametoxisazol e Amoxacilina.
Infeces
urinrias:
Ampicilina,
Ac.
Nalidxico,
Nitrofurantonas, Cefalosporinas, Sulfas e Fluorquinolonas.
Para infeces por Pseudomonas sp.: Carbenicilina,
Gentamicina, Tobramicina, Pipraciclina e Amicacina.
Para infeces por cpas de Anaerbios: Bacterides,
Peptococos,
Fusobactrias
e
Clostrdios:
Clindamicina,
Metronidazol, Rifampicina, Vancomicina e Tetraciclinas.
Microrganismos de referncia
Mantenha culturas-estoques de S. aureus (ATCC25923) e E.
coli (ATCC25922).

Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao

___________________________________________________________________________

25

Teste esses microrganismos de referncia, pelo mtodo

que
foi
descrito,
usando
discos
de
antibiticos
representativos daqueles a serem empregados no teste de
isolados clnicos.
Comparaes de resultados para os microrganismoscontrole de teste para teste oferecem uma verificao na
reprodutibilidade do processo do teste e na credibilidade dos
discos-teste.
Limitaes do mtodo
O mtodo de interpretao descrito aqui se refere a
patgenos de crescimento rpido e no deve ser aplicado a
microrganismos de crescimento lento, para os quais os
critrios dos halos no so apropriados. E para antibiticos
que se difudem lentamente em gar, ex: polimixina B.

Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao

___________________________________________________________________________
Tabela 1.
Limites para interpretao do antibiograma com 24
antibacterianos de uso corrente na teraputica clnica.
Antibacteriano

Smb.

Conc.
disco

Zonas de inibio (em mm)

Resistente
Interme
Sensvel
dirio

Amicacina
Ampicilina ao
testar
microrganismos
Gram-negativos e
enterococos
Ampicilina ao
testar
estafilococos e
microrganismos
sensveis
penicilina G
Ampicilina ao
testar Haemophilus
sp.
Bacitracina
Carbenicilina ao
testar Proteus sp.
E E. coli.
Carbenicilina ao
testar Pseudomonas
aeruginosa
Cefalotina ao
relatar
sensibilidade a
todas as
cefalosporinas
Clindamicina ao
relatar
sensibilidade
clindamicina e
lindomicina
Cloranfenicol
Colistidina
Eritromicina
Estreptomicina
Gentamicina
Konanilcina
Nalidxico, cido
Neomicina
Nitrofurantona
Novoblocina
Oxocilina
Penicilina G. ao
testar
Estafilococos
Penicilina G. ao
testar outros
microrganismos
Penicilina G.
Sulfazotrin
(Sulfatomoxazol +
Trimetoprin)
Sulfonamidas
Tetraciclina
Tobramicina
Vancomicina

AM

30mcg

14 ou menos

15-18

17 ou mais

AP

10mcg

11 ou menos

12-13

14 ou mais

AP

10mcg

20 ou menos

21-28

29 ou mais

AP

10mcg

19 ou menos

___

20 ou mais

BC

10un.

8 ou menos

9-12

13 ou mais

CR

100mcg

17 ou menos

18-22

23 ou mais

CR

100mcg

13 ou menos

14-16

17 ou mais

CF

30mcg

14 ou menos

15-17

CL

2mcg

14 ou menos

15-16

17 ou mais

CO
CL
EL
ET
GN
KN
AN
NO
NT
NV
OX

30mcg
10mcg
15mcg
20mcg
20mcg
30mcg
30mcg
30mcg
300mcg
30mcg
6mcg

12 ou menos
8 ou menos
13 ou menos
11 ou menos
12 ou menos
13 ou menos
13 ou menos
12 ou menos
14 ou menos
17 ou menos
9 ou menos

13-17
9-10
14-17
12-14
13-14
14-17
14-18
13-16
15-16
18-21
10-13

18
11
18
15
15
18
19
17
17
22
14

PN

10un.

20 ou menos

21-28

29 ou mais

PN

10un.

11 ou menos

12-21

22 ou mais

PL

50un.

8 ou menos

0-11

12 ou mais

SFT

25mcg

10 ou menos

11-15

16 ou mais

SF
TT
TB
VC

300mcg
30mcg
10mcg
30mcg

12 ou menos
14 ou menos
12 ou menos
9 ou menos

13-16
15-18
13-14
10-11

17
19
15
12

18 ou mais

ou
ou
ou
ou
ou
ou
ou
ou
ou
ou
ou

ou
ou
ou
ou

mais
mais
mais
mais
mais
mais
mais
mais
mais
mais
mais

mais
mais
mais
mais

26

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas

___________________________________________________________________________

27

VI ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS

As bactrias Gram-negativas incluem vrios gneros de
bacilos fermentadores de carboidratos (Enterobactrias) ou
no
fermentadores
de
carboidratos
(Ex.:
Pseudomonas,
Acinetobacter). Os bacilos mais freqentemente isolados de
amostras clnicas em laboratrios de microbiologia pertencem
a
famlia
Enterobacteriaceae
e
so
denominados
enterobactrias
(Ex:
Escherichia
coli,
Klebsiella,
Enterobacter,
Hafnia,
Shigella,
salmonella,
Proteus,
Serratia, etc.). Esses bacilos esto amplamente distribudos
na natureza e so encontrados principalmente no trato
intestinal do homem e de animais.
O isolamento e identificao das bactrias Gramnegativas baseiam-se principalmente em reaes bioqumicas
que ocorrem nos meios de cultura, resultantes do metabolismo
bacteriano.
1 - ISOLAMENTO
Para o isolamento dos bacilos Gram-negativos
utilizados principalmente meios seletivos diferenciais.

so

a) Meios de isolamento
gar salmonella Shigella (SS), gar Hektoen (HE), gar
MacConkey, gar Verde Brilhante, gar Eosina Azul de Metileno
(EMB), gar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e gar Bismuto
Sulfito.
b) Tcnica de semeio para isolamento
Transferir o inculo bacteriano para um ponto da
superfcie do meio de cultivo distribudo em placa e semear
pela tcnica de estrias utilizando a ala de platina
flambada. Incubar a placa a 37oC por 18-24h e fazer a
diferenciao e identificao bioqumica.
2 - IDENTIFICAO (Provas bioqumicas)
2-1.
Fermentao
glicose)

de

carboidratos

(lactose,

sacarose,

Nos sistemas de provas bacteriolgicas o processo de

fermentao detectado por observao visual das mudanas de
cor dos indicadores de pH do meio quando os produtos cidos
so formados pelas bactrias.
a) Princpio
Os testes de fermentao de carboidratos determinam a
capacidade de um microrganismo em hidrolizar determinado

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas

___________________________________________________________________________

28

acar, incorporado numa concentrao de 0,5 a 1,0% em meio

base de vermelho de fenol, produzindo cidos com ou sem gs.
b) Meio: base de vermelho de fenol
Indicador de pH: Vermelho de fenol
cido (cor amarela) - pH < 6,8
Alcalino (cor rosa) - pH > 8,4
Neutro (cor laranja) - pH = 7,4
c) Tcnica
Transferir, com ala de platina estril, uma colnia
bacteriana isolada para o meio lquido vermelho de fenol
adicionado do carboidrato a ser fermentado. Incubar a 37oC
por 18-24h.
d) Resultado
POSITIVO: cor amarela -- presena de cido (carboidrato
fermentado)
NEGATIVO: cor rosa -- ausncia de cido (Carboidrato no
fermentado)
2-2 gar TSI (gar Trplice-acar-ferro)
a) Princpio
No meio TSI distribudo em tubos de ensaio observa-se a
fermentao ou no dos acares (lactose, glicose e sacarose)
pelas bactrias Gram-negativas, com produo ou no de gs
CO2. Tambm pode se observar a formao de H2S (gs sulfdrico
ou sulfeto de hidrognio) pela sua reao com o sulfato
ferroso (presente no meio TSI), resultando num precipitado de
sulfeto ferroso que se manifesta por uma reao visvel de
cor negra.
b) Meio TSI
Neste meio, alm do gar e das fontes de carbono e de
nitrognio, tambm esto presentes o tiossulfato de sdio que
uma fonte de enxofre para a produo de H2S e o indicador
de pH vermelho de fenol,que j foi visto no tpico anterior.
c) Tcnica
Transferir a colnia bacteriana isolada para o meio TSI,
utilizando-se a agulha de platina flambada. A inoculao
dever ter a profundidade de 2/3 do meio em uma nica picada.
Em seguida, fazem-se estrias na superfcie inclinada. Incubar
a 37oC por 18-24h.
d) Resultado e interpretao
O resultado obtido pela visualizao da mudana de cor
no pico (superfcie inclinada) e no fundo (profundidade) do
tubo de ensaio contendo o gar TSI:

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas

___________________________________________________________________________

29

Pico alcalino/fundo alcalino - Ausncia de fermentao dos

aucares. Ex: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter.
Pico alcalino/fundo cido - Fermentao apenas da glicose.
Ex: Shigella.
Pico alcalino/fundo cido e negro - Fermentao da glicose
e produo de H2S. Ex: Salmonella, Proteus, Citrobacter.
Pico cido/fundo cido - Fermentao dos trs aucares. Ex:
Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e outros
componentes do grupo coliforme.
2-3. Motilidade
a) Princpio e meio
O meio de cultivo apropriado para teste de motilidade
bacteriana deve ser semi-slido (0,5% de agar) para permitir
a difuso de bactrias mveis.
b) Tcnica
Inocular em uma nica picada a colnia bacteriana
isolada no meio, utilizando-se a agulha de platina estril.
Incubar a 37oC por 18-24h.
c) Resultado
A
motilidade
bacteriana

detectada
pelo
exame
macroscpico do meio para se observar uma zona de crescimento
difuso (turbidez) que parte da linha de inoculao feita com
a agulha de platina.

2-4. Citrato
a) Princpio
Determinar se um microrganismo capaz de utilizar o
citrato como nica fonte de carbono para seu metabolismo e
crescimento. Se o citrato for utilizado, o nitrognio
presente no meio tambm ser, havendo liberao da amnia com
a conseqente alcalinizao do meio.
b) Meio: gar Citrato de Simmons
Este um meio slido no qual a nica fonte de carbono
o citrato de sdio, tendo como indicador de pH o azul de
bromotimol.
c) Tcnica
A bactria em estudo inoculada na superfcie do gar
inclinado em tubo fazendo-se estrias na superfcie do meio,
utilizando-se a ala de platina flambada. Incubar a 37oC por
18-24h ou at 3 dias, se necessrio.
d) Resultado
POSITIVO: meio azul (alcalino) - Utilizao do citrato

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas

___________________________________________________________________________

30

NEGATIVO: meio verde (neutro) - No utilizao do citrato

2-5. Teste da lisina descarboxilase
a) Princpio
Determinar a habilidade enzimtica de uma determinada
bactria em descarboxilar o aminocido lisina, com a
subsequente alcalinizao do meio devido a formao de amina
alcalina (cadaverina).
b) Meio LIA (gar lisina ferro)
Este
meio
contm
como
indicador
o
prpura
de
bromocresol:
cido: cor amarela -- pH < 5.2
Neutro a bsico: cor prpura -- pH = 6.8
c) Tcnica
A bactria teste inoculada em uma nica picada no meio
LIA em tubo de ensaio, utilizando-se uma agulha de platina
estril.
Em
seguida,
fazem-se
estrias
na
superfcie
o
inclinada. Incubar a 37 C por 24h.
d) Resultado
POSITIVO: meio prpura (alcalino) - Ocorreu a descarboxilao
da lisina e conseqente formao de aminas.
NEGATIVO: meio amarelo (cido) - No ocorreu a descarboxilao
da lisina. A acidificao do meio ocorre porque a bactria
fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio.
2-6. Teste de Indol
a) Princpio
Determinar a habilidade do organismo em produzir o indol
a partir da molcula de triptofano. Quando ocorre a
degradao deste aminocido por bactrias que possuem a
enzima triptofanase ocorre a formao de: Indol, cido
pirvico e amnia. Este teste til para diferenciar a
E.coli (indol positiva) de outras enterobactrias.
b) Meio e reativo

Caldo Triptofano

Reativo de Kovac ou Reativo de Ehrlich Composio: pdimetilaminobenzaldedo,

HCL
concentrado,
lcool
isoamlico (Kovac), lcool etlico absoluto (Ehrlich).
c) Tcnica
Inocular o caldo triptofano com a bactria em estudo e
incubar a 37oC por 18-24h. Em seguida, adicionar gotas do
reativo de Kovac no tubo.
d) Resultado

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas

___________________________________________________________________________

31

O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfcie do

meio aps a adio do reativo indica a presena de indol e
uma prova positiva. A cor vermelha aparece na camada de
lcool
quando
o
indol
produzido
reage
com
o
pDimetilaminobenzaldedo presente nos reativos de Ehrlich ou
de Kovac.
2-7. Teste de urease
a) Princpio
Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar
enzimaticamente a uria pela urease com a formao de duas
molculas de amnia (NH3), resultando na alcalinizao do
meio.
b) Meio caldo uria
Este meio tem como indicador de pH o vermelho de fenol,
j visto anteriormente.
c) Tcnica
Inocular o caldo uria com uma ala de platina carregada
de cultura pura do organismo em estudo. Incubar a 37oC por
18-24h.
d) Resultado
POSITIVO: meio rosa (alcalino) - Presena de urease
NEGATIVO: meio amarelo (neutro) - Ausncia de urease
3 MTODOS DE IDENTIFICAO AUTOMATIZADOS
3-1. Sistema API
Enterobactrias

20E

(bio

Mrieux)

Identificao

de

O sistema de identificao API 20E consiste em tiras

plsticas com 20 compartimentos miniaturizadas que contm os
substratos desidratados (meio de identificao bioqumica) e
uma cmara plstica de incubao com tampa frouxa. Cada
compartimento possui um pequeno orifcio superior atravs do
qual a suspenso bacteriana diluda em soluo salina ou gua
destilada estril pode ser inoculada com uma pipeta. A ao
bacteriana sobre o substrato produz mudana de cor que
interpretada visualmente em 24 horas a 35C. O fabricante
fornece folhas de trabalho para registro das interpretaes
visuais das reaes coloridas, que em seguida so convertidas
em nmero do bitipo de 7 dgitos, levando a identificao da
espcie bacteriana.
Os 20 substratos includos para identificao de
enterobactrias
so:
ONPG,
arginina
diidrolase,
lisina
descarboxilase, ornitina descarboxilase, citrato, sulfeto de
hidrognio, urease, triptofano desaminase, indol, Voges-

Isolamento e Identificao de Bactrias Gram Negativas

___________________________________________________________________________

32

Proskauer, gelatina, glicose, manitol, inositol, sorbitol,

ramnose, sacarose, melibiose, amigdalina, arabinose.
Pelo sistema API 20E so identificadas mais de 100
espcies de bactrias Gram-negativas. Esse sistema um dos
mais utilizados nos laboratrios clnicos e de pesquisa.
Obs: Tambm so comercializados outros sistemas API para
identificao de bactrias Gram-positivas.
3-2. Sistema VITEK
(bio
Mrieux)

um
sistema
O
sistema
VITEK
computadorizado que consiste em um mdulo gerador de vcuo,
leitor-incubador, computador-impressora e um monitor de
computador. Este sistema utilizado com cartes de teste
VITEK
para
identificao
bacteriana
e
provas
de
susceptibilidade a antibiticos, totalmente automatizadas.
Este sistema permite a identificao de enterobactrias em 8
horas,
sendo
aceito
como
um
mtodo
confivel
para
identificao
rpida
de
bacilos
Gram
negativos
nos
laboratrios de microbiologia clnica.
Cada
carto
de
identificao
possui
30
testes
bioqumicos que no necessita adio de reagentes, evitando
erros. VITEK capaz de detectar mais de 300 espcies de
microrganismos (bactrias Gram-negativos e Gram-positivos e
leveduras).

Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos

________________________________________________________________________

33

VII ASPECTOS MICROSCPICOS E MACROSCPICOS DOS FUNGOS

Os
fungos
so
organismos
eucariticos,
heterotrficos,
obtendo sua alimentao a partir de matria orgnica
inanimada ou nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos.
Estes microrganismos causam doenas humanas, em animais e
vegetais. De um modo geral, os fungos incluem os bolores (ou
mofos) e as leveduras. Os bolores so filamentosos e
pluricelulares e as leveduras se apresentam sob forma
unicelular.
Conhecer os aspectos microscpicos e macroscpicos dos
fungos de extrema importncia para a identificao destes
organismos
que
so
agentes
etiolgicos
de
processos
infecciosos, de reaes de hipersensibilidade imediata e
tardia e produtores de micotoxinas.
A coleta do material o primeiro passo para
obteno de um resultado laboratorial confivel. Deve-se
sempre questionar o paciente em relao ao uso de medicaes
antifngicas tpicas e/ou sistmicas. Caso o paciente esteja
fazendo uso da medicao, o mesmo dever ser orientado a
suspend-la por um perodo de 15 dias, em caso de uso tpico
e 1 ms, quando se tratar de drogas de uso sistmico. Esta
suspenso deve ser realizada com autorizao mdica.
de grande importncia que todos os espcimes
clnicos encaminhados para diagnstico laboratorial, venham
acompanhados de uma ficha, que contenha no mnimo as
seguintes
informaes:
identificao
e
procedncia
do
paciente, tempo de evoluo da leso, localizao e aspectos
clnicos da leso, possveis contatos com animais e solo, uso
de drogas.
1)ASPECTOS MICROSCPICOS DOS FUNGOS
1.1- Exame microscpico direto
O diagnstico microbiolgico e imunolgico das micoses
pode ser feito pelo exame microscpico direto, exame
histopatolgico, cultivos, testes intradrmicos, pesquisa de
anticorpos sricos e de antgenos. O exame microscpico
direto o mtodo mais usado no diagnstico de rotina das
micoses por ser rpido e sensvel, permitindo a visualizao
do fungo e em muitas ocasies, sua identificao.
importante
salientar
que
a
realizao
do
cultivo
paralelamente ao exame direto imprescindvel para um
completo diagnstico laboratorial micolgico.
A tcnica de preparao para o exame direto, varia de
acordo com o material biolgico a ser investigado e da
suspeita clnica da etiologia do processo.
Preparao do exame direto com amostras clnicas densas
(p.ex.: escamas epidrmicas, ungueais e plos):

Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos

________________________________________________________________________

34

a) Clarificar a amostra clnica, j sobre a lmina, com 1 gota

da soluo de hidrxido de potssio (KOH) a 10-20%;
b) Aquecer suavemente a lmina na chama do bico de Bunsen; o
calor juntamente com o KOH vai dissolver a queratina
presente na amostra, clareando o material de fundo; esperar
10 minutos, tempo necessrio para clarear o material de
fundo.
c) Corar o material com 1-2 gotas de lactofenol azul-algodo
(ou azul de Amann);
d) Cobrir com lamnula;
e) Examinar ao microscpio com objetiva de 40X.
Exemplos de algumas caractersticas morfolgicas dos
fungos:
clula brotante

Pseudo-miclio

Hifa cenoctica Hifa septada

Hifa artrosporada
Epidermophyton sp Microsporum sp Trichophyton sp

A- Macrocondeos
B- Microcondeos

Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos

________________________________________________________________________

35

Preparao da lmina a partir do cultivo de fungos:

a) Colocar 1 a 2 gotas do corante lactofenol azul-algodo;

b) Retirar uma pequena poro da colnia (do miclio
reprodutivo ou areo, no caso dos fungos filamentosos) e
colocar sobre a lmina;
c) Cobrir com lamnula;
d) Observar ao microscpio com objetiva de 40X.
Aps o preparo da lmina podemos visualizar os aspectos
microscpicos dos fungos.
Observaes:
9 As amostras de consistncia lquida e relativamente claras
podem ser examinadas diretamente ao microscpio aps a
mistura em uma gota de soluo salina em lmina de vidro.
9 A
utilizao
do
corante
lactofenol
azul-algodo

importante porque o fenol inviabializa os microrganismos

vivos e o azul-algodo cora a quitina, presente nas paredes
das clulas fngicas.
1.2- Aspectos microscpicos dos fungos filamentosos ou bolores
O fungo filamentoso se origina a partir de um esporo,
que emite um filamento tubular microscpico, chamado hifa,
que posteriormente se ramifica formando um conjunto de hifas
denominado miclio, que pode ser vegetativo ou reprodutivo
(areo). Algumas hifas apresentam paredes transversais ou
septos e so chamadas hifas septadas, outras no possuem
septos e so chamadas hifas cenocticas .
Microscopicamente,
os
bolores
so
identificados
principalmente pelos tipos de esporos, corpos de frutificao
e hifas. Os esporos so muito importantes na classificao
dos fungos, sendo as classes diferenciadas, primariamente,
pelas caractersticas morfolgicas dos esporos.
A anlise conjunta das caractersticas microscpicas,
em geral, permite a classificao genrica do fungo. A
definio da espcie, geralmente, tarefa de laboratrios de
referncia.
1.3- Aspectos microscpicos das leveduras
Como leveduras, os fungos apresentam-se unicelulares
com forma oval ou arredondada. A reproduo assexuada das
leveduras ocorre principalmente por gemulao ou brotamento.
Algumas vezes, aps a gemulao, as leveduras e as clulasfilhas ficam aderidas, formando uma estrutura conhecida como
pseudomiclio (p.ex., Candida). As leveduras tambm podem se
reproduzir
sexuadamente
atravs
de
ascosporos
ou
basidiosporos.
Portanto,
a
observao
microscpica
de
estruturas assexuadas e sexuadas bastante empregada na
identificao genrica das leveduras.

Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos

________________________________________________________________________

36

2) ASPECTOS MACROSCPICOS DOS FUNGOS (Observao macroscpica

das colnias em meio slido).
Ao contrrio do que se verifica no estudo das
infeces bacterianas, em que o cultivo o principal mtodo
diagnstico, nas infeces fngicas ele um complemento do
exame microscpico direto. As razes que podem contribuir
para isso, so o crescimento lento dos fungos e as
dificuldades para cultivar alguns deles.
O
isolamento
primrio,
seguido
da
correta
identificao dos agentes etiolgicos, uma condio
indispensvel para o diagnstico laboratorial das micoses, e,
para tanto, a escolha do meio de cultura adequado uma
tarefa de extrema importncia.
Uma ampla variedade de meios de cultura pode ser
utilizada num laboratrio de micologia, atendendo a diversos
fins, tais como: isolamento primrio do fungo a partir dos
espcimes clnicos, a identificao taxonmica dos gneros e
espcies, a estocagem e manuteno em micoteca, e, mais
recentemente a execuo de testes de susceptibilidade frente
a diferentes antifngicos.
A seleo do meio a ser empregado deve, basicamente,
levar em considerao o tipo de amostra biolgica a ser
semeado e a suspeita clnica.
Apesar
da
variedade
de
meios
de
cultivo
disponveis(muitos
vendidos
pronto
para
uso,
outros
preparados artesanalmente), o gar Sabouraud ainda o meio
mais utilizado dentro de um labotatrio de micologia. A esse
meio podem ser acrescidos muitos inibidores,tais como o
cloranfenicol e a cicloeximida, objetivando otimizar o
isolamento em espcimes clnicas possivelmente contaminadas
por bactrias e fungos anemfilos (fungos que apresentam suas
estruturas de reproduo comumente vetorizadas por correntes
de ar). O meio de Sabouraud o principal meio de cultura
utilizado na micologia mdica. utilizado para o cultivo
primrio geral dos fungos (leveduras, filamentosos e alguns
dimrficos), emespecial para Dermatoftos, uma vez que as
principais
caractersticas
macro
e
microscpicas
desse
grupamento fngico so descritas a partir do seu crescimento
nesse meio.
Porm importante salientar que alguns fungos
filamentosos
dos
gneros
Aspergillus,
Fusarium,
Scopulariopsis, ou algumas leveduras como o Cryptococcus
neoformans, por exemplo, podem ter seu crescimento inibido na
presena da cicloeximida.
As caractersticas principais deste meio so o seu pH
cido (5.8) e seu elevado teor em glicose, que o torna mais
seletivo para fungos, dificultando o crescimento bacteriano.
Entretanto,
o
meio
no

totalmente
impediente
para
bactrias, por esta razo deve ser acrescido de antibiticos
que
inibem
o
crescimento
destes
microrganismos.
O
clorafenicol um dos antibiticos mais utilizados, pela
comodidade do seu uso, pois pode ser esterelizado na
autoclave e pelo seu amplo espectro de ao.

Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos

________________________________________________________________________

37

A composio do gar Sabouraud foi,inicialmente

proposta pelo micologista Raymond Jacques Sabouraud, em 1904,
e vem apresentando diversas modificaes com o passar dos
anos, com alteraes na quantidade de alguns componentes,
tais como a dextrose e a adio de substncias inibidoras ,
como o clorofenicol e a cicloeximida.
COMPOSIO DO MEIO GAR SABOURAUD:
Dextrose (glicose) ---- 20g
Peptona -------------- 10g
gar ------------------ 20g
gua ---------------- 1.000ml
pH final = 5.6
Dissolver
aquecendo
121C.

agar, peptona e dextrose em gua destilada,

em banho-maria. Autoclavar, por 15 minutos, a

OUTROS MEIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA O ISOLAMENTO DOS

FUNGOS: gar batata dextrose, gar malte, gar fub, gar
extrato de levedura glicose, etc.

Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos

________________________________________________________________________

38

2.1- Aspectos macroscpicos dos fungos filamentosos

A morfologia das colnias dos fungos filamentosos um
importante
dado
e
pode
auxiliar
bastante
em
sua
identificao. Para isso so feitas observaes quanto
textura, cor, topografia, consistncia, contorno da colnia,
etc.
TEXTURA A textura da colnia refere-se s caractersticas
dos miclios areos em seu conjunto e pode ter aspecto:
ALGODONOSO OU COTONOSO: miclio areo denso e alto;
AVELUDADO: miclio areo baixo, lembrando veludo;
PULVURULENTO: hifas planas, esfarelam-se facilmente devido
densa produo de condias;
CREO OU GLABROSO: superfcie lisa, pois no produzem
miclio areo.
COR- A colnia pode ser branca, amarelada, acinzentada,
alaranjada, verde, rosa, creme, marrom, etc. A cor do verso e
anverso da colnia e os anis concntricos de diferentes
cores so aspectos a serem considerados na identificao.
CONSISTNCIA- A colnias pode ser pastosa, branda, coricea,
mole, etc.
CONTORNO- A colnia
irregular, etc.

pode

ser

circular,

oval,

elptica,

2.2- Aspectos macroscpicos das leveduras

A maioria das leveduras cresce adequadamente a 30oC ou
temperatura ambiente em gar Sabouraud. Caractersticas
como cor, consistncia, bordos, superfcie e topografia
tambm so observadas em meios de cultivo slidos. Com 2 a 3
dias de incubao formam-se colnias de cor branca a creme,
amarelada, alaranjada ou vermelha, de textura pastosa,
mucides ou secas, lisas ou enrugadas.
A habilidade da levedura crescer a 37oC uma
caracterstica
importante;
a
maioria
das
leveduras
patognicas cresce bem a 30-37oC, enquanto as saprfitas no
crescem em temperaturas mais elevadas.

Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos

________________________________________________________________________

ASPECTOS DAS COLNIAS FNGICAS QUANTO AO RELEVO

1. Cerebriformes
2. Rugosas
3. Apiculadas
4. Crateriformes

39

Aspectos Microscpicos e Macroscpicos dos Fungos

___________________________________________________________________________

ASPECTOS DE COLNIAS FNGICAS QUANTO TEXTURA

1.Algodonosas
2.Furfurceas
3.Penungentes
4.Arenosas
5.Veludosas
6.Glabrosas

40

Reaes Antgeno - Anticorpo

41

VIII REAES ANTGENO ANTICORPO

Introduo terica
A exposio de eptopos (antgenos=imungenos) a um
sistema de clulas e tecidos imunologicamente competentes,
origina estimulao de linfcitos B e T . Os primeiros(LB),
diferenciam-se aps divises mitticas, em plasmcitos que
so clulas munidas de um Sistema de membranas (Golgi e
RE)prprios de clulas produtores e secretoras de protenas.
Estas protenas so glicoprotenas globulares com funo de
se combinar quimicamente com os elementos que formam parte do
eptopo que deu origem a todo este fenmeno celular e
secretor.
Os
linfcitos
T,
ao
serem
estimulados,
secretam
interleucinas, que so protenas cuja funo estimular
outros linfcitos T e B (interleucinas 2,4) macrfagos, NK,
linfcitos citotxicos (interferon gama)por exemplo.
Apenas
discutiremos,
por
enquanto,
a
ao
das
globulinas produzidas pelos plasmcitos: Os anticorpos ou
imunoglobulinas.
AES IN VITRO: Reaes antgeno anticorpo
Estas acontecem entre a poro Fab das molculas de
anticorpo e o eptopo dos imungenos. Nesta poro Fab, que
se estabelecem ligaes no covalentes fracas como :pontes de
Hidrognio, ligaes eletrostticas, hidrfobas e mediante
foras de Van der Waals. Conhecendo os tipos de ligaes que
se
estabelecem
e
mantm
unidos
o
complexo
antgenoanticorpo, fica fcil entender o conceito de especificidade,
pois somente podero se formar estas ligaes em nmero
suficiente para se manterem estveis, SE O ANTICORPO
REALMENTE FR DIRIGIDO CONTRA ESSE EPTOPO. Se as ligaes se
formam tambm a nvel de estrutura primria e secundria do
anticorpo, formando numerosas ligaes de curto alcance, o
complexo estvel.
Ento, numa primeira instancia, deve haver interao
qumica entre imungeno (antgeno quando falamos de reao in
vitro
E FAB do anticorpo. Numa Segunda etapa, grande nmero de
molculas do complexo antgeno-anticorpo, tendem a formar
malhas que naturalmente sedimentam como grumos grosseiros ou
como sedimento fino, dependendo da condio fsica do
antgeno. Se particulado (hemcias, bactrias, protozorios)
se observam grumos; se solvel, se forma fino precipitado com
o imunocomplexo.
ALGUNS CONCEITOS IMPORTANTES:
Atravs
das
reaes
sorolgicas
pode-se
pesquisar
anticorpos contra um determinado antgeno bacteriano,
parasitrio, mictico, ou at mesmo contra componentes do

Reaes Antgeno - Anticorpo

42

prprio indivduo como acontece nas doenas autoimunes.

Nestes casos ,variaes no ttulo de anticorpos indicam
evoluo ou involuo da doena ou infeco. J ,quando
interessa utilizar estas reaes para detectar antgenos
circulantes no soro ou plasma, basta saber se estes existem
ou no, as reaes podem ser apenas qualitativas. Se quiser
quantificar o antgeno, basta comparar o resultado com
concentraes de padres bem quantificados.
Ttulo: a maior diluio do soro que ainda reage
positivamente numa reao antgeno-anticorpo. Assim, um
alto ttulo indica uma grande quantidade de anticorpos(foi
necessrio diluir muito os anticorpos presentes para que
estes desaparecessem na unidade de volume pr-fixada. Ex.:
ttulo 1/10<1/455.Este ltimo contm mais anticorpos que
1/10,pois foi necessrio diluir os soros 455 vezes, para
que no ficasse mais anticorpos no tubo de ensaio.
Sensibilidade da reao; Qualidade de uma determinada
tcnica, que permite detectar pequenas quantidade s de
antgeno ou anticorpo no material analisado. Por exemplo,as
tcnicas imunoenzimticas, detectam <1g de anticorpo ou
antgeno,
enquanto
que
as
reaes
que
utilizam
radioimunoensaio, detectam anticorpos ou antgenos na ordem
de picogramas.
Especificidade: Qualidade de uma tcnica que permite que a
reao antgeno anticorpo acontea com eptopos que so
exclusivos de uma determinada doena. Quando h reao com
outros eptopos, outros anticorpos tambm entram a somar na
reao, e estamos frente a reaes cruzadas ou falso
positivas

REAO DE AGLUTINAO DIRETA

Na reao de aglutinao direta utilizam-se partculas
antignicas insolveis em sua forma integra ou fragmentada.
Hemcias,
bactrias,
fungos
e
protozorios
podem
ser
aglutinados diretamente por anticorpos.
REAES DE PRECIPITAO
Ao reagir antgenos solveis com seus respectivos anticorpos,
formam se redes que tendem a precipitar. Nesta reao
possvel observar que as reaes antgeno-anticorpo dependem
das concentraes do antgeno e dos anticorpos presentes.
Assim se formar um complexo estvel quando Antgeno e
anticorpo estejam em concentraes equivalentes, de outro
modo, haver dissoluo do complexo e o precipitado no se
forma, embora haja Ag e Ac.
As reaes de precipitao hoje em dia, so executadas em
meios semi slidos como gis de agarose (gel neutro,
incolor).
Tanto antgeno e anticorpo podem difundir neste meio,
dependendo do seu tamanho molecular, at encontrar as
propores timas de antgeno anticorpo, ento precipitam
formando linhas ou halos de precipitao no local. Varias

Reaes Antgeno - Anticorpo

aplicaes existem na rotina

tcnicas:
Imunodifuso radial
Imunodifuso dupla
Imunoeletroforese
Contra imunoeletroforese

laboratorial

para

estas

43

REAO DE FLOCULAO TCNICA DE VDRL

Teste no treponmico para o diagnstico de Sfilis: VDRL
A tcnica de VDRL ( Venereal Disease Research Laboratory)

um

exemplo

pesquisa

de

de

reao

anticorpos

de

floculao,

em

um

cujo

indivduo

objetivo

com

suspeita

a
de

sfilis, sendo esta doena causada pela espiroqueta Treponema

pallidum sub-espcie pallidum.
A tcnica de VDRL pode ser realizada atravs dos mtodos
qualitativo

quantitativo.

utilizada

como

triagem

sorolgica para a pesquisa de anticorpos em um indviduo com

suspeita de sfilis e tambm para acompanhamento da resposta
teraputica do paciente positivo, atravs da titulao dos
anticorpos. A cardiolipina o antgeno utilizado na tcnica
que pesquisa anticorpos, chamados de reagina. Trata-se de um
fosfolpideo que atualmente preparado a partir do corao
bovino, sendo assim denominado cardiolipina. Aparentemente,
ocorre

produo

sfilis,

que

de

reage

um

anticorpo

com

este

denominado

complexo

de

reagina

na

cardiolopina-

lipoprotena. No se sabe exatamente por que a reagina

produzida; todavia, no se trata de um anticorpo especfico
contra o T. pallidum. Os espiroquetas possuem uma substncia
lipide,

suficientemente
lipoprotena

possvel
semelhante

para

que

os

que
ao

esta
complexo

anticorpos

substncia
de

seja

cardiolipina-

produzidos

contra

antgeno lipide dos espiroquetas tambm possam reagir com a

cardiolipina.
Um

fato

de

grande

importncia

nesse

teste

de

triagem

sorolgica para Sfilis , que nem todo sifiltico comprovado

Reaes Antgeno - Anticorpo

atravs de provas treponmicas, produz reao positiva para

essa

prova

de

VDRL.

Outro

dado

de

grande

44

importncia

laboratorial, o fato de cerca de 2% de pacientes na sfilis

primria e secundria serem falsamente negativos devido a um
excesso

de

antgenos

(fenmeno

conhecido

como

pr-zona).

Devido a esta ocorrncia a OMS, sugeriu a realizao desse

teste

de

triagem,

qualitatiamente

quantitativamente

na

diluio de 1/8 para todos pacientes submetidos a esse meio

de diagnstico laboratorial.
Por outro lado, alguns pacientes apresentam resultados falsopositivos, sem possuir a doena ou terem se submetido a algum
tipo

de

exposio.

Segue

abaixo

as

principais

causas

de

resultados falso-positivos:
1.

Infeces virais ou bacterianas e em muitos estados

febris, como hipersensibilidade ou vacinao;

2.

Doenas sistmicas crnicas, com presena de anticorpos

antifosfolpideos;

3.

Doenas reumatides do colgeno;

4.

Doenas infecciosas como Malria e Tuberculose;

5.

Doenas

treponmicas

no-sifilticas,

como

bouba,

pinta, Borrelia (doena de Lyme) ou febre recidivante.

Material para um grupo

Mtodo qualitativo
VDRL, soro positivo e negativo, ponteiras, pipeta automtica
de 50 l, lminas, luva descartvel, culos protetor.
Procedimento:
Sobre a lmina limpa marcar retngulos.
Colocar 50 l de da amostra do soro positivo e do soro
negativo.
Colocar uma gota do antgeno (cardioplina).

Reaes Antgeno - Anticorpo

Homogenizar durante um minuto com movimentos de vaivm

45

para que ocorra a reao Antgeno-Anticorpo e observar a

presena ou no de floculao na lmina.
Leitura dos resultados:
O

resultado

observado

pela

floculao

que

ocorrer,

poder ser uma floculao leve, moderada ou intensa,depender

da presena do ttulo dos anticorpos no soro do indivduo.

Reaes Antgeno - Anticorpo

TESTE RPIDO DE TRIAGEM

ANTICORPOS PARA HIV 1/2.

QUALITATIVA

PARA

DETECO

DE

46

O teste rpido HIV 1/2 - Bio-Manguinhos um teste de

triagem, que usa um coquetel de antgenos para detectar
anticorpos para HIV 1/2 em soro, plasma ou sangue total
humano.
O
teste
se
baseia
nas
tecnologias
de
imunocromatografia e fluxo lateral.
Resumo:
O Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV) um retrovrus,
identificado em 1983 como agente etiolgico da Sndrome de
Imunodeficincia Adquirida. A AIDS caracterizada por
alteraes em funo e nmero na populao de linfcitos T (T
helper),
que
desempenha
um
papel
chave
na
resposta
imunolgica do hospedeiro humano, deixando os portadores
deste vrus suscetveis a infeces oportunistas e certas
malignidades.
O HIV constitudo por uma molcula de RNA, protegida
por um capsdeo e um envelope. O envelope do vrus o
principal alvo da resposta imune. A presena do vrus faz com
que o sistema imune dos pacientes produza anticorpos antiHIV. A deteco destes anticorpos deve ser usada como parte
do diagnstico laboratorial para o HIV 1/2. Ensaios de ELISA,
Imunofluorescncia, Western Blot, tcnica da Cadeia de
Polimerase (PCR) entre outros, complementam o diagnstico
laboratorial definitivo para AIDS.
PRINCPIO DO TESTE:
O Teste Rpido HIV- 1/2 Bio-Manguinhos emprega a
combinao de uma protena conjugada com partculas de ouro
coloidal e antgenos de HIV 1/2 ligados a uma fase slida
(membrana). A amostra aplicada ao respectivo poo (S),
seguida da adio de um tampo de corrida. O tampo
proporciona o fluxo lateral dos componentes liberados,
promovendo a ligao dos anticorpos aos antgenos. Os
anticorpos presentes, em casos positivos, se ligam s
protenas especficas conjugadas ao ouro coloidal. No caso de
uma amostra ser positiva o complexo imuno-conjugado migra
na membrana de nitrocelulose, sendo capturado pelos antgenos
fixados na rea do TESTE(T), produzindo uma linha roxo/rosa.
Na ausncia de anticorpos para HIV 1/2, a linha no aparece
na rea do teste. Nos dois casos, a amostra continua a migrar
na membrana produzindo uma linha roxo/rosa na rea de
CONTROLE(C), o que caracteriza o funcionamento adequado dos
reagentes.

Reaes Antgeno - Anticorpo

47

COLETA DA AMOSTRA:

O teste Rpido HIV 1/2, Bio-Manguinhos realizado com soro,

plasma, ou sangue total humano.
Soro: o soro obtido do sangue total coletado assepticamente
por puno venosa em tubo sem anticoagulante. Aguardar o
sangue coagular a temperatura ambiente e centrifugar a
2000rpm, durante 10 minutos. Separar o soro do cogulo para
evitar hemlise.
Plasma: coletar o sangue total em tubo com anticoagulante,
centrifugar a 2000rpm durante 10 minutos e separar o plasma
sobrenadante.
Sangue total: Coletar o sangue em tubo com EDTA, heparina ou
citrato de sdio. Para sangue de ponta digital, utilizar a
lanceta, conforme as instrues, desprezando a primeira gota.
Coletar a segunda gota com a ala coletora descartvel.
Para todos os materiais, seguir as instrues do procedimento
do teste, como demonstrado a seguir.

Reaes Antgeno - Anticorpo

Procedimento para interpretao dos resultados a seguir:

48

Reaes Antgeno - Anticorpo

49

Referncias Bibliogrficas

50

IX REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. AMATO NETO, V. et al. Antibiticos na Prtica Mdica.

2. BAILEY, R. et al. Diagnstico Microbiolgico.Editora mdica Pan
Americana S.A 1973. 3a ed.

3. JAWETZ, E. et al. Microbiologia Mdica. 18. ed. Guanabara

Koogan, 1996.

4. KONEMAN E.W.; ALLEN S.D.; JANDA W.M.; SCHRECKENBERGER P.C. & WINN JNIOR W.C.
Diagnstico Microbiolgico Texto e Atlas colorido 5aed. Medsi,
2001.

5. LACAZ, C.L. Micologia Mdica, 1995.

6. PELCZAR M.J., CHAN E.C.S; KRIEG N.R. Microbiologia: conceitos e
aplicaes. v.1, 2a ed. Makron Books, 1996.

7. ROITMAN, I. Tratado de Microbiologia. Vol. 1.

8. TRABULSI, L.R.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O F.; CANDEIAS J.A N.;
Microbiologia. 3a. ed. Atheneu, 2002.

9. RAVEL, Richard. LABORATRIO CLNICO: APLICAES CLNICAS DOS

DADOS LABORATORIAIS. 6 edio. Editora Guanabara Koogan, 1995.

10. SIDRIM, J.J.C & ROCHA, M.F.G. MICOLOGIA MDICA LUZ DE

AUTORES CONTEMPORNEOS. Editora Guanabara Koogan, 2004.