ESTUDO DA PRODUO DE XILANASE POR LINHAGENS

FNGICAS

FERREIRA, L. L.1; RODRIGUES, L. C.B.1; ALVES-PRADO, H. F.2

1
Universidade Estadual Paulista Jlio Mesquita de Filho, Campus de Ilha Solteira, Graduao em
Licenciatura/Bacharelada em Cincias Biolgicas
2
Universidade Estadual Paulista Jlio Mesquita de Filho, Campus de Ilha Solteira, Departamento de
Fitotecnia, Tecnologia de Alimentos e Scio Economia.
E-mail para contato: leticia01054@aluno.feis.unesp.br

Introduo
As hemiceluloses so heteropolmeros de xilose, galactose, manose, arabinose e
vrios outros acares, bem como seus cidos urnicos. A xilana o principal polissacardeo
da hemicelulose e formada por unidades de D-glicoses ligadas entre si por ligaes
xilopiranosdicas b (14) .As xilanases so enzimas que degradam as xilanas por mecanismo
de ao exo e endo. A degradao total da xilana inclui as enzimas que degradam o esqueleto,
formado pelos resduos de D-glicose e aqueles que atuam nos resduos substituintes das
ramificaes do esqueleto (BEG et al., 2001).
Sua aplicao industrial est em ascenso principalmente na industria alimentcia,
produo de lcool, entre outros. O avano das pesquisas sobre as caractersticas fsico-
qumicas e de purificao das enzimas, tem possibilitado o surgimento de novas aplicaes
enzimticas na indstria.
Entre os fungos xilanolticos destacam-se: Aspergillus niger; Trichoderma
longibrachiatum; Humicola lanuginosa; H. grisea; Talaromyces emersonii; Thermoascus
aurantiacus entre outros (BOCCHINI et. al., 2002).
O presente trabalho propem isolar e selecionar micro-organismos produtores da
enzima xilanase, em reas em duas reas de Cerrado do estado do Mato Grosso do Sul, MS,
prximas da divisa com o estado de So Paulo. Uma rea est localizada no municpio de
Selvria, MS, na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extenso (FEPE) da Faculdade de
Engenharia, Campus de Ilha Solteira UNESP (202038 S; 512436 O). A outra rea est
localizada em uma propriedade particular, Fazenda So Jos, localizada no municpio de
Inocncia, MS. Foram realizadas coletas nas reas de Cerrado da FEPE UNESP Campus
de Ilha Solteira.

Material e Mtodos

Isolamento de micro-organismos
Aproximadamente 1,0 g de amostra de solo, madeira em decomposio ou
serrapilheira, foram coletados de solos de Cerrado do Mato Grosso do Sul e transferidos
diretamente para frascos contendo 4 mL de meio nutriente, compostos de: 2 tiras de palha de
milho ou 2 tiras de papelo; 0,1 % peptona; 0,14 % (NH4)2SO4; 0,20 % K2HPO4; 0,02 %
-1 -1 -1
MgSO4.7H2O; 0,03 % uria; 1,60 mg L MnSO4.H2O; 1,40 mg L ZnSO4.7H2O; 2,0 mg L
-1
CoCl2; 5 mg L FeSO4.7H2O, pH 5,0 (ALVES PRADO et al., 2010).
Os tubos foram incubados a 45 C por 12 a 24 horas e em seguida, o crescimento lquido
foi transferido por esgotamento em estria, com o auxlio de uma ala de inoculao, para
placas de Petri contendo o meio correspondente, com 1,0 % de palha de milho triturado ou
papelo picado, acrescido de 1,5% agar. Todas as colnias morfologicamente diferentes foram
purificadas por estriamento em placas. As culturas puras foram estocadas em meio inclinado
em tubos de ensaio, contendo 0,5% de xilano, e mantidas a 7C, para os testes de produo.

Determinao de atividade enzimtica

A atividade enzimtica para xilanase foi determinada de acordo com DAMIANO et al,
2003 onde uma mistura de reao contendo 0,1 mL da soluo enzimtica bruta e 0,9 mL de
xilana Birchwood-Sigma a 0,5 % em tampo acetato 0,1 M em pH 5,0, foi incubada por 10 min
a 60 C. O acar redutor liberado foi quantificado pelo mtodo do DNS (MILLER, 1959),
adicionando-se 1 mL do reagente DNS mistura de reao. Tal mistura foi incubada em
banho-maria a 100 C por 5 minutos, em seguida resfriada e adicionada 10 mL gua destilada.
Aps homogeneizao, foi determinada leitura em espectrofotmetro a 540 nm. Uma unidade
de atividade xilanase foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 mol de
xilose por minuto, nas condies de reao, utilizando curva padro de xilose.
A atividade enzimtica para CMCase foi determinada de acordo com DAMIANO et al,
2003, em cuja mistura de reao foi semelhante a usada para atividade de xilanase, no entanto
o substrato utilizado foi carboximetilcelulose (Sigma-C5678) a 0,5 % em tampo acetato 0,1 M
em pH 5,0. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade capaz de liberar 1 mol
de glicose por minuto, nas condies de reao, usando curva padro de glicose.

Resultados
Foram isoladas cerca de 60 linhagens de fungos filamentosos produtores de xilanase e
celulase de diferentes locais em torno de Ilha Solteira, SP, e de com vegetao tpica de
Cerrado, nos municpios de Selviria-MS e Inocncia-MS. Os micro-organismo foram
selecionados atravs de anlises morfolgicas. Dessas linhagens 6, foram analisadas quanto
produo de xilanase por fermentao em estado slido por 72 horas a temperatura de 35C.
Das linhagens analisadas apenas CNS4, A-6.3 e E-2.3 foram as que deram maior atividade
xilanase em torno de 6,0 U mL-1. A linhagem E-2.3 apresentou alta atividade CMCase 5,95 U
-1
mL (Tabela 1).
 -
Tabela 1. Atividade xilanase Carboximetilcelulase (U mL ) para as linhagens produtoras de
xilanse sob fermentao em estado slido aps 72 horas de cultivo.
-
Linhagens Local de Coleta Xilanase (U mL ) Carboximetilcelulase
-
(U mL )
A-6.3 FEPE 6,058 1,05
AF-22 Cerrado-FEPE 2,01 2,36
CNS4 Silagem- FEPE 6,12 2,12
P2D19 Cerrado-FEPE 5,25 0,92
IAP15F Inocncia-MS 2,24 0,59
E-2.3 6,03 5,94

Discusso e Concluso
A partir das amostras de serrapilheira coletada nas duas reas de Cerrado em estudo,
foram isoladas 60 linhagens de fungos filamentosos produtoras de xilanase e celulases. Os
micro-organismos foram selecionados atravs de analises morfolgicas.
Foram avaliadas seis linhagens quanto produo de xilanase por fermentao em
estado slido. Das linhagens analisadas apenas CNS4, A-6.3 e E-2.3 foram as que deram
maior atividade xilanase em torno de 6,0 U m L-1. A linhagem E-2.3 apresentou alta atividade
-1
CMCase 5,95 U mL
Os isolados tem apresentado potencial na produo de xilanase, porm novos isolados
sero avaliados, bem como os isolamentos ainda esto em andamento, busca de micro-
organismos com o mesmo potencial CNS4, A-6.3 e E-2.3.

Agradecimentos
Os autores agradecem Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo,
FAPESP, pelo suporte financeiro, bolsista Letcia Louzada Ferreira, processo N 2012/17695-9.

Referncias

ALVES-PRADO, H. F.; PAVEZZI, F. C.; LEITE, R. S. R.; OLIVEIRA, V. M.; SETTE, L. D.;
DaSILVA, R. Screening and production study of microbial xylanase producers from Brazilian
Cerrado. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 161, p. 333-346, 2010.
BEG, Q.K.; KAPOOR, M.; MAHAJAN, L.; HOONDAL, G.S. Microbial xylanases and their
applications: a review. Applied microbiology and Biotechnology, v. 56, p. 326-338, 2001.
BOCCHINI, D. A.; ALVES-PRADO, H. F.; BAIDA, L. C.; ROBERTO, I. C.; GOMES, E.;
DASILVA, R. Otimization of xylanase production by Bacillus circulans D1 in submerged
fermentation using surface metthodology, Process Biochemistry, v. 38, p. 727-731, 2002.
DAMIANO, V.B.; BOCCHINI, D.A.; GOMES, E.; DASILVA, R. Aplication of crude xylanase from
Bacillus licheniformis 77-2 to the bleaching of eukalyptus Kraft polp. Wourld Journal of
Microbiology & biotechnology, v.19, p. 139-144, 2003.
DEMIRIJAN, D; MORIS-VARAS, F; CASSIDY, C. Enzymes from extremophiles. Current
Opinion in Chemical Biology, v. 5, p. 144-151, 2001.
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal.
Chem., v. 31, p. 426-8, 1959.
POLIZELI, M.L.T.M.; RIZZALTI, A.C.S.; MONTI, R.; TERENZI, H.F.; JORGE, J.A.; AMORIM,
D.S. Xylanases from fungi: properties e industrial applications. Applied microbiology and
Biotechnology, v. 67, p. 577-591, 2005.