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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
GCM

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS

 PRTICA No 1 TITULAO DE AMINOCIDOS E ESTUDO DO EFEITO-TAMPO

1. Introduo
1.1. Aminocidos estrutura e propriedades Esses ismeros so denominados enantimeros,
Em qumica, um aminocido qualquer so quirais (do grego kiros, que significa mo). So
molcula que contm simultaneamente grupos imagens especulares que no podem ser sobrepostas. A
funcionais amina e cido carboxlico. Em bioqumica, designao L ou D foi proposta por Emil Fischer, em
este termo usado como termo curto e geral para se 1891, com base na caracterizao das formas L e D do
referir aos aminocidos alfa: aqueles em que as funes gliceraldedo, conforme mostrado na Figura 3:
amino (NH3+) e carboxila (COO-) esto ligadas ao CHO CHO
mesmo carbono, conforme a frmula indicada na Figura
1:
HO H H HO
H

R C COO - CH 2OH CH 2OH

L-Gliceraldedo D-Gliceraldedo
NH 3+
+
COO - COO -
Figura 1 Frmula geral dos aminocidos

Como se pode observar, ambos os grupos esto H NH 3+ H3N+ H

ligados ao carbono central, ao qual est tambm ligado
um grupamento lateral varivel, denominado R. A
CH 3 CH 3
estrutura dos aminocidos d origem a dois ismeros
opticamente ativos, isto , capazes de promover a L-Alanina D-Alanina
rotao do plano da luz polarizada (Figura 2).
Figura 3 Relao entre as formas L e D do
Espelho Gliceraldedo e da Alanina.
O O- O- O Historicamente, as designaes L e D foram
usadas como abreviaes dos adjetivos levorrotatrio
(provoca a rotao da luz para a esquerda) e
R NH 3+ H3N+ R dextrorrotatrio (provoca a rotao da luz para a
direita), respectivamente. Entretanto, sabe-se que nem
todos os L-aminocidos so levorrotatrios. Todos os
HO OH aminocidos das protenas naturais tm a configurao
L, porque as protenas so sintetizadas por enzimas que
Imagem Imagem refletida
(D-aminocido) (L-aminocido) reconhecem e inserem apenas L-aminocidos nas
cadeias peptdicas. Apenas alguns poucos peptdeos de
Figura 2 Isomeria dos aminocidos

1
bactrias possuem aminocidos na forma D (ex.: cido Em pH = 1
H H
D-glutmico). Todos os 20 aminocidos que compem a
+ H+
estrutura das protenas so -aminocidos, mas existem R C COO - R C COOH
- H+
aminocidos em que os grupos amino e carboxlico no
NH 3 NH 3
esto ligados ao mesmo carbono; alguns desses + +
aminocidos so importantes precursores de algumas
H Em pH = 11 H
substncias (ex.: -alanina, precursora do cido
pantotnico) e possuem papis celulares especficos - H+
R C COO - R C COOH
(ex.: o cido -aminobutrico ou GABA, um
+ H+
neurotransmissor).
NH 3 NH 2
A presena dos grupos amina e carboxila +

propicia aos -aminocidos um carter anfotrico em Figura 5 Reaes de protonao e

soluo aquosa, ou seja, um comportamento tanto de
cido como de base (Cabe aqui ressaltar um ponto
importante: no h substncias cidas ou bsicas em
absoluto. Esses termos so conceitos; uma substncia s
cida ou bsica em relao a outra substncia). Em
valores de pH 6,0 7,0, os aminocidos existem
predominantemente na forma dipolar inica, cuja
representao aquela mostrada na Figura 1. Esta forma
denominada zwitterion (do alemo on hbrido). Em
faixas extremas de pH, por outro lado, eles se
apresentaro como espcies inicas diferentes (Figura
4):
Em pH 1 Em pH 11
H H
R C COOH R C
NH3+ NH2
Figura 4 Espcies inicas dos aminocidos
em valores extremos de pH.
Portanto, os aminocidos possuem no mnimo
dois grupos (pois o R tambm pode ser ionizvel) que
podem sofrer protonaes e desprotonaes e essas
desprotonao dos aminocidos em valores extremos de
pH.
Pode-se estudar a dissociao dos prtons de
um aminocido em soluo realizando-se uma curva de
titulao e observando-se a variao do pH do meio
com o auxlio de um medidor de pH (ou pHmetro). A
titulao de um aminocido consiste na remoo gradual
de prtons atravs da adio de uma base (como
NaOH) e a curva de titulao corresponde ao grfico
dos valores de pH da soluo em funo do volume de
base adicionado. Essa curva revela os pKas (que so
formas de expresso das constantes de dissociao Ka)
dos grupos ionizveis do aminocido (lembre-se que
pKa = -log Ka). medida que a base adicionada, a
curva passa apresentar estgios distintos, que dependem
COO- da concetrao de cada uma das formas doadoras de
prtons, como mostra a Figura 6:
1 2 3
H H H
H+
H+
R C COOH R C COO - R C COO -
pK1 pK2
NH 3 NH 3 NH 2
+ +
Adio de base

reaes dependero do pH da soluo em que os Figura 6 Reaes de dissociao de prtons

aminocidos se encontram (Figura 5): de um -aminocido simples monocarboxlico.

2
 Assim, para um -aminocido simples
monocarboxlico, observaremos trs pontos de inflexo
na curva: A) um ponto no qual o pH igual ao valor do
pK do grupo carboxlico, onde esto presentes
quantidades equimolares das formas A (carga lquida =
+1) e B (carga lquida = 0); B) um ponto no qual o valor
de pH corresponde ao ponto isoeltrico (pI) do
aminocido, onde a forma B est principalmente
presente; e C) um ponto no qual o pH igual ao valor
do pK do grupo amino, onde esto presentes
quantidades equimolares das formas B e C (carga
lquida = -1). Portanto, cada aminocido apresentar
uma curva especfica, j que esta depende das interaes
intramoleculares que o compem. Alm disso, alguns
aminocidos apresentaro mais de 2 valores de pK, uma
vez que possuem mais um grupo ionizvel no seu
grupamento R.
1.1. O medidor de pH
Em linhas gerais, o medidor de pH um
aparelho capaz de converter a diferena de potencial (ou
seja, um potencimetro) detectada pelo eletrodo em
uma escala de pH. O eletrodo de vidro combinado (ver
Figura 7) um eletrodo compacto no qual o eletrodo de
vidro acha-se envolvido pelo eletrodo de referncia de
Ag/AgCl (em alguns equipamentos esses eletrodos
podem ser encontrados em separado). O eletrodo de
vidro consiste de um tubo de vidro com um bulbo na
extremidade inferior, feito de vidro especial (constitudo
de xido de silcio). Nele est contida uma soluo de
Ag/AgCl em soluo de HCl 0,1 M. A superfcie do
bulbo revestida de ons Na+ que, quando em contato
com os ons hidrognio, so substitudos por prtons
que permanecem em equilbrio em cada lado da parede
de vidro:
Si ONa + H2O Si OH + NaOH
Quando o eletrodo imerso numa soluo que
se deseja investigar, formam-se potenciais de
membrana e a condutividade eltrica feita
+
principalmente pelos ons Na . A diferena de potencial
estabelecida comparada com o eletrodo de referncia
(Ag/AgCl ou Hg/HgCl2) que envolve o eletrodo de
vidro e entra em contato com a amostra atravs de uma
juno cermica onde se forma uma ponte salina.
Figura 7 Eletrodo
de vidro combinado.
O medidor de pH possui um boto para ajuste
da temperatura (j que esta influencia no equilbrio
qumico dos tampes), um para calibrao (com soluo
em pH neutro - 7,0) e outro para valores de pH extremos
(normalmente 4 ou 10), que normalmente chamado de
boto de ajuste de assimetria e permite correes de
desvios da curva do potencial do eletrodo. Alm disso,
alguns aparelhos possuem um boto para selecionar o
tipo de leitura que se deseja realizar em mV ou pH.
Para a calibrao do medidor, utiliza-se sempre
solues-padro disponveis comercialmente.
1.2. Solues-tampo
As substncias consideradas cidos ou bases
fortes so aquelas que tendem a se dissociar totalmente
quando em soluo, diminuindo ou aumentando o pH do
meio, respectivamente. Assim, o pH de uma soluo 0,1
3
M de HCl praticamente 1,0 (pH = -log [0,1]),
enquanto o pH de uma soluo 0,1 N de NaOH
praticamente 13,0 (pOH = -log [0,1] e pH = 14 - 1). O
pH dos fluidos biolgicos mantm-se mais ou menos
constantes em valores prximos de 7,0 devido
presena de um grande nmero de substncias capazes
de captar ou liberar prtons. Nas clulas e nos fluidos
biolgicos predominam cidos e bases fracos, que no
so completamente ionizveis em soluo (alguns
dissociam-se menos que 1 %). Sendo assim, a relao
entre pH e o grau de dissociao de um cido fraco no
direta como nos cidos fortes. No entanto, ela pode ser
analisada atravs da equao de Henderson-Hasselbach.
Considere a reao de dissociao de um cido
fraco em soluo aquosa:
HA H + A + -
Aplicando a lei de ao de massas temos:
formas, a razo [base]/[cido] ser alterada ao consumir
esses [H+] ou [OH-], sem variar o pH do meio e,
claro, mantendo-se inalterada a constante de
dissociao, Ka
Assim, o TAMPONAMENTO DE UMA
SOLUO a capacidade desta em resistir a variaes
de pH. Substncias cuja presena na soluo so
responsveis por este efeito so conhecidas como
TAMPES. O fenmeno do tamponamento um dos
fatores que possibilitou o surgimento da vida. Em
organismos vivos o pH dos diferentes ambientes
mantido estvel, mesmo aps a adio de cidos ou
bases. Em laboratrios pode-se preparar uma soluo
tampo utilizando-se uma base fraca ou um cido fraco
(ex.: cido actico) e sua base conjugada na forma de
um sal (ex.: acetato de sdio). Em pesquisa cientfica os
tampes so essenciais para a manuteno do pH em

Ka = [H+] [A-] uma grande variedade de procedimentos, por exemplo,

[HA] cultura de clulas e tecidos, medida de atividade
Onde Ka a constante de equilbrio da reao. enzimtica, purificao de protenas, etc... Normalmente
Rearranjando a equao temos: utiliza-se um tampo para manuteno de um valor de
1 = 1 x [A-] pH que se encontre uma unidade acima ou abaixo de seu

[H+] Ka [HA] Logo: valor de pK, pois dentro desta faixa o seu efeito
tamponante muito mais eficiente (como exemplo,
log 1 = log 1 + log [A-]
verifique as inflexes da curva de titulao dos
[H+] Ka [HA]
aminocidos nesta aula prtica).
Chegamos finalmente equao de Henderson-
Hasselbach: 2. Objetivos

pH = pKa + log [A-] Determinar os valores de pK das solues de

[HA] aminocidos (Glicina e cido glutmico) atravs de
A equao mostra que o pH de qualquer titulao;
soluo aquosa que contenha uma quantidade Construir as curvas de titulao para cada um dos
significativa de um cido fraco depender da proporo aminocidos;
(E NO DA QUANTIDADE ABSOLUTA) das formas Manusear e compreender o funcionamento de um
dissociadas e no dissociadas do cido e do pKa deste medidor de pH.
+ -
mesmo cido. Se H ou OH forem adicionados a uma
soluo contendo uma proporo adequada destas

4
 Estudar o efeito tamponante de misturas contendo (cuidado para o bulbo no esbarrar na barra
propores e concentraes diferentes de um cido magntica).
fraco e sua base conjugada. Sob agitao, titular com NaOH 0,5 N, adicionando
0,2 mL por vez e anotando o pH aps cada adio
3. Reagentes (adicionar o NaOH diretamente soluo, sem
Solues de Glicina e cido Glutmico 0,02 M esbarrar no eletrodo ou na parede interna do bcher).
(pH 1); Construir o grfico de pH da soluo versus volume
Soluo de NaOH 0,5 N. de NaOH adicionado.
Soluo de HCl 1 M.
Solues-padro para calibrao do medidor de 4.3. Procedimentos para estudo da capacidade
pH. tamponante
Soluo de cido actico 0,2 M Em quatro bcheres, adicionar os volumes indicados
Soluo de acetato de sdio 0,2 M. das solues de cido actico, acetato de sdio e
gua:
4. Procedimentos

cido Acetato de
Bcher H 2O
4.1. Procedimentos gerais de ajuste do medidor de actico sdio
pH 1 20 mL 20 mL --

Ligar o aparelho; 2 10 mL 10 mL 20 mL

Retirar o eletrodo do recipiente contendo soluo de 3 25 mL 15 mL --

KCl 3M e lav-lo com gua destilada. 4 15 mL 25 mL --

Imergir o eletrodo na soluo-padro de pH 7 e

calibrar o aparelho no boto adequado. Repetir os procedimentos descritos acima para

Retirar o eletrodo da soluo e repetir o titulao de cada uma das solues, mas desta vez

procedimento de ajuste, agora para a soluo-padro adicionar 5 x 0,5 mL de NaOH 0,5 N. Anotar o valor

de pH 4,0, no boto adequado. de pH a cada adio.

Lembrar de sempre colocar o aparelho em stand Construir o grfico de pH das solues versus

by quando eletrodo no estiver imerso em uma volume de NaOH adicionado.

soluo.
5. Questes para discusso

4.2. Procedimentos para titulao dos aminocidos 1) Em relao prtica realizada:

a) Quais os valores de pK e pI da glicina e do cido
Em um bcher colocar 40 mL de glicina ou cido
glutmico?
glutmico.
b) Por que a curva de titulao do cido glutmico
Mergulhar uma barra magntica na soluo e
diferente da curva da glicina?
posicionar o bcher sobre a placa agitadora.
c) Calcule o pH terico das solues 1, 2, 3 e 4, sabendo
Inserir o eletrodo limpo e calibrado na soluo, de
que o Ka do cido actico 1,74 10-5.
modo que a juno cermica fique submersa

5
2) Voc pode utilizar um aminocido para fazer uma
soluo-tampo? Por qu?
3) Como a concentrao de um tampo afeta a sua
capacidade tamponante?
4) Um tampo mantm constante o pH de um meio
indefinidamente?
5) Calcule o grau de dissociao inicial do cido actico
+
0,2 M. (Dica: considerando que a [H ] igual
concentrao de ons acetato, podemos reescrever a
reao de dissociao da seguinte forma: 0,2 y = y y.
Sendo assim a expresso de equilbrio pode ser:
6) Quais sero as concentraes de cido actico e
acetato de sdio necessrias para fazer um tampo de
pH 5,1 com a soma cido actico + acetato = 0,2 M?
7) Num laboratrio hospitalar uma amostra de 10 mL de
suco gstrico, obtida vrias horas aps uma refeio, foi
titulada com NaOH 0,1N at neutralidade; foram
necessrios 7,3 mL. Como o estmago no continha
nem alimento nem bebida, pode-se assumir que no
havia tampes presentes. Qual o pH do suco gstrico?

Ka = y2
0,2 - y

o que gera uma equao do segundo grau que

pode ser resolvida!).

6
 PRTICA No 2 - FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO

1. Princpios gerais INTERVALO COR COR

O termo espectro foi utilizado inicialmente por (nm) ABSORVIDA COMPLEMENTAR

Newton, quando este descobriu que a luz branca, ao 380-435 violeta Verde-amarelada

atravessar um prisma, dividida em vrias cores. 435-480 azul amarela

Atualmente, sabe-se que o espectro visvel apenas uma 480-490 azul esverdeada alaranjada
pequena parte do espectro eletromagntico. A luz , 490-500 verde azulada vermelha
portanto, definida como uma forma de energia 500-560 verde prpura
eletromagntica, formada por ondas que apresentam 560-580 Verde- amarelada violeta
)
comprimentos diferentes. O comprimento de onda ( 580-595 amarelada azul
-9
medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10 m. A tabela 595-650 alaranjada Azul-esverdeada
abaixo mostra as regies do espectro em relao ao 650-780 vermelha verde-azulada
comprimento de onda: comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua
REGIO: ) EM nm:
( determinao quantitativa e qualitativa, uma vez que o
Raios X 0,1-100
espectro de absoro caracterstico para uma
Ultravioleta 100-400
Visvel 400-800 determinada substncia e a quantidade de absoro
Infravermelho 800-5000 (intensidade) dependente da concentrao do
Microonda 5000-30000
composto.

A cor dos objetos devida a duas causas: A intensidade da radiao transmitida por uma

reflexo e absoro. Assim, um papel transparente, soluo pode ser determinada em aparelho (fotmetro),

vermelho, recebe todos os da luz branca, mas reflete e que dever ser constitudo de: uma fonte luminosa, um

transmite somente o vermelho, sendo o restante seletor de (filtro ou prisma), um compartimento para a

absorvido. Quando um objeto da cor branca, todos os amostra, uma clula fotoeltrica (ou fototubo) e um

so refletidos, se negro, porque, praticamente, sistema para amplificao e medida do sinal (corrente

todos os so absorvidos. No entanto, existe uma cor eltrica) proveniente da clula fotoeltrica (medidor de
potencial eltrico = potencimetro). Pode-se selecionar
(ou ) que mais absorvida, a qual corresponde
o comprimento de onda que incidir sobre a soluo
chamada cor complementar. Se uma soluo absorve na
usando-se um monocromador (prisma ou retculo de
faixa de 435-480 nm, que corresponde radiao azul, a
difrao) ou um filtro ptico (vidro colorido ou quartzo,
sua cor (cor complementar) ser o amarelo; a sensao
que transmite uma determinada faixa de na regio do
visual do amarelo ser dada pelo conjunto de todos os
outros componentes da luz branca, que no foram ultravioleta, UV). Se o aparelho dispe de filtro ptico,

absorvidos. A tabela abaixo mostra as cores de cada denominado fotmetro ou fotocolormetro e se dispe

intervalo de radiao da faixa do visvel e as suas de prisma ou retculo denominado de

respectivas cores complementares: espectrofotmetro. Este ltimo muito til, pois pode
selecionar faixas de comprimentos de onda

A capacidade que as diversas substncias extremamente estreitas, nas regies do UV, visvel e

qumicas tm de absorverem luz em determinados infravermelho (IV).

7
 A fotometria de absoro, portanto, presta-se
tanto para a medida da concentrao de compostos
naturalmente corados, como daqueles incolores, mas
passveis de adquirirem cor mediante o emprego de
certos reativos, bem como de compostos incolores que
absorvem UV ou IV. Esta metodologia, por conseguinte,
tem largo emprego na qumica analtica quantitativa.
Alguns poucos exemplos: na determinao de atividade
enzimtica ou nas dosagens de compostos orgnicos em
fluidos biolgicos, como glicose, uria, protenas, etc.,
em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de
uma reao qumica, ou um produto incolor que absorva
na regio do UV ou do IV. Ensaios imunolgicos
quantitativos (como o ELISA: Enzyme-Linke
ImmunoadSorbent Assay) tambm usam a fotometria.
1.1. Leis da fotometria
O princpio bsico da fotometria baseado no
fato de que: partculas dispersas ou dissolvidas em uma
soluo interferem seletivamente com um raio de luz
que passa atravs desta soluo. Esta interferncia
depende dos seguintes fatores:
a) cor do composto ou do tipo de ligao qumica
presente;
b) tamanho da partcula;
c) transparncia da soluo;
d) combinao dos fatores acima.
Deste modo, as partculas podem absorver e
transmitir parte do espectro, dependendo da sua
concentrao, da sua natureza qumica e/ou da sua cor.
Se pudermos medir o total de luz que incide (Io) sobre a
soluo de uma determinada substncia e o total da luz
transmitida (It), podemos avaliar o quanto a substncia
absorveu (absorvncia: A) O esquema abaixo mostra
como funciona um fotmetro ou um espectrofotmetro:
A seguinte formulao pode ser feita:
Transmisso = It / Io (luz transmitida / luz incidente).
Observe que o termo transmisso tem aplicao
limitada, uma vez que, a It I0 menos a luz que
absorvida no s pela substncia que se deseja medir,
mas tambm pelo solvente, pelo material da cubeta e por
outras substncias a existentes. Assim, It a luz
transmitida aps as absores pela substncia de
interesse mais os interferentes. Para corrigir tal efeito,
admite-se It =1 (100% de Transmitncia) a luz
transmitida aps I0 atravessar a cubeta contendo uma
soluo denominada branco. Este branco contm todos
os componentes do meio, exceto a substncia a ser
medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o
fototubo (fotoclula), a Transmitncia = 0, ou seja, no
h luz transmitida a ser medida.
Na prtica, a transmitncia (T), que medida
em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco
na passagem da luz), pouco utilizada, pois
substituda pelo valor de densidade ptica (D.O.) ou
absorvncia (A), termo mais aceito atualmente, que
corresponde ao logaritmo do inverso da transmitncia:
A = log 1/T
A absorvncia , desta forma, medida em uma
escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0). A relao da A
com a concentrao da substncia pode ser
compreendida pelas Leis de Lambert-Beer: a
absorvncia de uma soluo proporcional
concentrao da substncia na soluo e distncia
percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a soluo
(caminho ptico): A = . l.c,
onde: = coeficiente extino molar, que constante
para cada substncia, e definido como a absovncia (A)
de uma soluo l molar da substncia em um
), numa cubeta de
determinado comprimento de onda (
caminho ptico l = l cm (largura da cubeta) e c =
concentrao da soluo.
Observe, portanto, que a absorvncia uma
funo linear da concentrao. Assim, para uma mesma
substncia, considerando-se o caminho ptico constante,
a A diretamente proporcional concentrao desta
8
substncia. No entanto, as Leis de LambertBeer nem
sem pre so obedecidas. Algumas desobedincias so
conhecidas e atribudas a fatores como: mudana na
natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos
baixos das concentraes das solues, etc. Tambm as
presenas de cidos, bases e sais na soluo podem 4. Procedimentos
contribuir para essas desobedincias, por estarem mais 4.1. Procedimentos gerais de ajuste do fotmetro
completamente dissociados, medida que aumenta a Ligar o aparelho;
diluio, visto que absoro da luz pelos ons diferente Selecionar o comprimento de onda adequado.
daquela apresentada pelas molculas no ionizadas. Para
Ajustar o zero de transmitncia;
se evitar discrepncias das Leis de Lambert-Beer, deve-
Introduzir a cubeta com o branco (gua destilada) e
se trabalhar com solues mais diludas e construir,
ajustar a 100% de transmitncia, no boto
previamente, uma curva padro, em que so usadas
correspondente;
concentraes conhecidas (e crescentes) da substncia
Repetir os ajustes acima.
em anlise, e verificar as absorvncias no comprimento
Obteno do espectro de absoro:
de onda indicado e na cubeta de caminho ptico
Ajustar o comprimento de onda inicialmente em 400
adequado. Desta forma, teremos os limites de
nm;
concentrao nos quais a soluo obedece s Leis de
Ajustar o 100% de transmitncia com o branco. Isto
Lambert-Beer, ou seja, onde h linearidade. Com o
coincide com o 0 de absovncia;
emprego da curva padro, podemos, tambm,
Colocar a cubeta com a soluo de Azul de
determinar a concentrao de uma soluo problema. O
Bromofenol em meio cido concentrao de 1
) usado para a obteno da
comprimento de onda (
mg/100 mL;
curva padro obtido pela preparao do espectro de
Ler a absorvncia e registr-la;
absoro da substncia em estudo e , normalmente, o
Ajustar o a 430 nm, repetir o ajuste do branco,
onde a absorvncia para a substncia apresenta o valor
recolocar a soluo de Azul de Bromofenol e ler,
mximo.
novamente, a absorvncia correspondente a este ;
Repetir estas operaes para os seguintes valores de
2. Objetivos
: 450, 470 e 490;
Determinar o espectro de absoro de uma soluo
O mesmo ser feito para o Azul de Bromofenol em
de Azul de Bromofenol em pH neutro e em pH
pH neutro. Sendo os comprimentos de onda
cido;
analisados, respectivamente: 500, 530, 550, 570 e
Caracterizar o comprimento de onda (
) onde ocorre
590.
absoro mxima;
Fazer o grfico dos espectros de absoro do Azul
Construir uma curva padro do Azul de Bromofenol.
de Bromofenol em papel milimetrado, relacionando
3. Reagentes
absorvncia (ordenada) contra (abcissa);
Soluo de Azul de Bromofenol 1 mg /100 mL em
Determinar o de absorvancia mxima.
meio levemente cido (amarelo) e Soluo de Azul
de Bromofenol 1 mg /100 mL (azul/violeta).

9
 Azul de Bromofenol Azul de Bromofenol Concentrao de Absorvncia Absorvncia
(pH<3) (pH>4,6) Azul de
Bromofenol (pH<3) (pH>4,6)
A A
(mg/100ml)
410 0,50 (1/2)
430 0,25 (1/4)
450 0,125 (1/8)
470 0,0625 (1/16)
490 0,03125 (1/32)
510 0,015625 (1/64)
530
550 Ler as absorvncias das diferentes solues de Azul
570 de Bromofenol (no ideal) e registr-las;
590 Construir, em papel milimetrado, a curva padro
(absorvncias na ordenada e concentraes na
Dados:
abscissa), considerando os pontos zero de absoro e
1) Espectofotmetro: TUNER, modelo 330
de concentrao.
2) Soluo: Azul de bromofenol em meio cido
(1mg/100ml) e Azul de bromofenol em pH neutro
5. Questes para discusso
(1mg/100ml).
5.1- Explique porque o Azul de Bromofenol apresenta
3) : comprimento de onda.
coloraes diferentes com a mudana no pH da soluo.
4) A: absorvncia.
5.2- Voc dispe dos filtros azul, verde, vermelho e
amarelo de um fotmetro. Qual deles voc usar, para que
4.2. Curva padro Obteno
uma soluo de cor vermelha tenha uma absoro (contra o
1) Fazer diluio seriada:
branco) o mais prximo de zero possvel?
Utilizar 6 tubos de ensaio e enumer-los.
5.3- Avalie, nas condies experimentais acima, se o Azul
Adicionar 4ml de H2O em cada tubo.
de Bromofenol segue, estritamente, as Leis de Lambert-
Colocar 4ml de Azul de Bromofenol no tubo 1e Beer, admitindo que nada interferiu em seu procedimento.
agitar. 5.4- Explique por que no se deve usar cubetas de vidro
Retirar 4ml da soluo do tubo 1 e adicionar no para leituras na regio do ultravioleta.
tubo 2. Repetir em todos os tubos.
No tubo 6 retirar 4ml e descartar. 6. Questes complementares
Cada tubo estar, desta forma, diludo em 2x com 6.1 Voc pesou l, 2 e 3 mg de Azul de Bromofenol e

relao ao anterior. dissolveu cada uma quantidade em 50 mL. As absovncias

2) Preparar solues de Azul de bromofenol nas
concentraes citadas na tabela abaixo:
destas solues, em 430nm, foram, respectivamente, 0,2,
0,4 e 0,6. A abosvncia de uma soluo desconhecida do
sal foi 0,3. Calcule a sua concentrao, em mg/100mL.
6.2 Para a dosagem da glicose do sangue de um paciente,
a amostra foi diluda em 10 vezes (no processo de
desproteinizao). 1mL do desproteinizado e 2mL de cada

10
um dos padres de glicose (P) de 10, 20 e 30mg/100mL
foram processados para a dosagem da glicose, sendo o
volume final, em todos os tubos, ajustados para 5mL. Aps
as leituras espectrofotomtricas em comprimento de onda
adequado, as absorvncias obtidas foram:
Amostra...................... ...0,180
P-10 mg/100mL............. 0,150
P-20 mg/100mL..............0,298
P-30 mg/100mL..............0,400.
Qual a concentrao da glicose no sangue do paciente?
6.3 - O coeficiente de extino molar () de uma substncia
de peso molecular 200 14,5. Uma soluo desta
substncia apresentou , numa cubeta de caminho ptico de
2 cm, a absorvncia de 0,800. Qual a concentrao (em
mg/L) da substncia nesta soluo?
Papel milimetrado:
11
 PRTICA No 3 - ESTUDO FSICO-QUMICO DAS PROTENAS

1. Introduo
As protenas, excluindo a gua, so os 0 C
C O
NH
compostos qumicos mais abundantes nos organismos,
NH
com extrema versatilidade de conformaes e funes. R C H

O estudo de aspectos importantes da bioqumica nos R C H

O C Cu+2
leva, invariavelmente, ao estudo de protenas. Portanto, NH
C O
HN
torna-se importante a existncia de mtodos adequados
R CH
CH R
de purificao e quantificao destes compostos. A
purificao e caracterizao de uma protena baseiam-se
Dependendo dos aminocidos que fazem parte
em suas caractersticas fsico-qumicas. Por serem
das protenas (estrutura primria), podem-se ter
formadas por aminocidos e considerando-se que os
diferenas fisico-qumicas individuais entre protenas
aminocidos aromticos absorvem luz na regio
numa mistura, as quais podem ser utilizadas para a
ultravioleta, as protenas, em geral, podem ser
separao e purificao destes compostos. Por exemplo,
detectadas atravs da absoro de luz a 280 nm. No
mtodos cromatogrficos podem ser baseados em
entanto, a deteco de protenas em materiais biolgicos
diferenas no peso molecular e/ou carga eltrica.
envolve reaes especficas com determinados reativos,
As protenas so macromolculas coloidais,
os quais originam substncias coloridas que absorvem
possuem uma camada de solvatao ou hidratao. Ao
luz na regio visvel, permitindo a sua quantificao.
seu redor interagem molculas de gua, que permitem a
Dentre os mtodos utilizados, situa-se o mtodo do
sua solubilidade. Diversas substncias, entre elas os sais
biureto, que baseado na reao do sulfato de cobre em
inorgnicos ((NH4)2SO4, Na2SO4 e outros) podem
meio alcalino (reativo do biureto) com protenas e
alterar a camada de solvatao de protenas, aumentando
peptdeos (no mnimo tripeptdeos). O nome do mtodo
(salting-in) ou diminuindo (salting-out) a
provm do fato de que a uria aquecida a 180oC dar
solubilidade.
reao positiva com desprendimento de amnia:
As protenas possuem estruturas espaciais bem
NH2
0 C
NH2 definidas que, segundo o nvel de complexidade, podem
H 0 C
N N H
H ser caracterizadas como estruturas secundria, terciria e
NH3
H quaternria. A funo biolgica est associada
N 0 C
0 C H
NH2 NH2 estrutura espacial, que, por sua vez, depende da
estrutura primria (a simples disposio dos
BIURETO
aminocidos na cadeia polipeptdica). Certos agentes
URIA podem alterar a conformao espacial original das
Quando a substncia contm duas ou mais protenas, sem que ocorra alterao da estrutura
ligaes peptdicas, produz uma cor azul-violeta com o primria, modificando, desta forma, algumas de suas
reativo de biureto. Esta cor desenvolvida devida a um propriedades biolgicas. Este efeito, chamado de
complexo entre o on cprico e duas cadeias peptdicas desnaturao, pode ser produzido pelo aumento da
adjacentes:

12
temperatura do meio, alterao do pH ou pela adio de Soluo concentrada de protenas.
solventes orgnicos. A alterao da estrutura primria Soluo de ninhidrina 0,1g% (P/V).
das protenas (quebra das ligaes peptdicas) ocorre Soluo de aminocidos.
o
por tratamento quente (100 C) em presena de cido cido tricloroactico (TCA ) 10% (P/V).
ou base forte ou atravs de adio de enzimas Soluo saturada de sulfato de amnio (NH4)2 SO4.
proteolticas. Determinados agentes podem ser usados Soluo tampo de fosfato de sdio 0,2 M, pH 7,0.
na precipitao de protenas, o que til na Etanol gelado.
desproteinizao de materiais biolgicos, como o Resina Sephadex G-25 (faixa de separao PM
sangue: nions de cidos complexos (tricloroactico, 1000-5000 D).
tnico, fosfotngstico) formam sais insolveis onde a
Soluo contendo compostos de diferentes pesos
protena funciona como ction; metais pesados (cobre,
moleculares (azul de dextran: 2.000.000 D, vitamina
zinco, prata, mercrio) em meio alcalino formam
B12: 1355 D em tampo pH 7,0, contendo sacarose).
precipitados onde a protena atua como nion.
Os aminocidos componentes de uma protena
4. Procedimentos
podem ser genericamente caracterizados se, aps sua
Enumerar 12 tubos de ensaio
hidrlise, efetuarmos a reao da ninhidrina. A
ninhidrina (hidrato de tricetoidrindeno) reage com
4.1. Reao do Biureto:
aminocidos produzindo cor prpura. uma reao
Tubo 1 (tubo branco): colocar: 1 mL do reativo do
inespecfica quanto identidade do aminocido, sendo a
Biureto + 0,5 mL de gua destilada;
reao dependente da presena de grupos amina livres.
Tubo 2: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5
O aminocido prolina, na verdade um iminocido, ao
mL da soluo diluda de protenas;
reagir com a ninhidrina produz colorao amarela.
Tubo 3: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5
mL da soluo de aminocidos;
2. Objetivos
Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.
Realizar reao especfica para deteco de
protenas (reao do Biureto);
4.2. Reao da ninhidrina:
Realizar reao especfica de deteco de
Aquecer gua 100oC
aminocidos (reao com a ninhidrina);
Tubo 4 (tubo branco): colocar 2 mL da soluo de
Verificar a alterao de solubilidade de protenas em
ninhidrina + 0,5 mL de gua destilada;
presena de solues salinas e solventes orgnicos;
Tubo 5: colocar 2 mL da soluo de ninhidrina + 0,5
Verificar a ao de agentes desnaturantes;
mL da soluo diluda de protenas;
Observar a separao cromatogrfica (cromatografia
Tubo 6: colocar 2 mL da soluo de ninhidrina + 0,5
de excluso molecular) de substncias de pesos
mL da soluo de aminocidos;
moleculares diferentes.
Ferver os tubos de ensaio 4, 5 e 6 por 5 minutos;
Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.
3. Reagentes
Reagente do Biureto: CuSO4 em soluo alcalina.
4.4. Precipitao cida:
Soluo diluda de protenas.

13
 Tubo 7 (tubo de centrfuga): colocar 1 mL de TCA
10% (P/V). + 1 mL da soluo diluda de protenas;
Agitar e observar;
Centrifugar (por 10 minutos), separando as fraes
sobrenadante e precipitado;
Colocar 0,5ml do sobrenadante no Tubo 8;
Adicionar 1mL do reativo do biureto ao Tubo 8;
Adicionar tampo ao precipitado do Tubo 7. Agitar;
Comparar os resultados.
4.5. Efeito da adio de sais:
Tubo 9: Colocar 2 mL da soluo diluda de
protenas + 2 mL da soluo saturada de sulfato de
amnio. Agitar. Centrifugar 3000rpm por 10
minutos, separar as fraes sobrenadante
precipitado;
Colocar o sobrenadante no tubo 10. Adicionar igual
volume de TCA 10% (P/V)., agitar e centrifugar
novamente. Se aparecer algum precipitado, tentar
dissolv-lo com 1 mL de tampo;
Adicionar 1 mL de tampo ao precipitado do tubo 10
e agitar. Verificar o que acontece.
4.6. Efeito da adio de solventes orgnicos:
Tubo 11: colocar 1mL da soluo de protenas +
2mL de etanol gelado (lentamente at
aparecimento de uma ligeira turvao).
4.7. Cromatografia em peneira molecular:
Montagem da coluna: numa coluna de vidro (aprox. 30
x 1,5 cm), colocar o gel suspenso em tampo pH 7,0,
deixando a extremidade inferior da coluna aberta, at
que o gel se acame. Cuidado para no deixar secar o gel,
adicionando sempre tampo, at que o gel esteja
equilibrado e acamado.
Aplicao da amostra: aplicar 1mL da amostra sobre a
superfcie da coluna, que dever estar com cerca de 2
cm de tampo sobre o gel. Como a amostra est mais
densa, devido presena da sacarose, esta se depositar
sobre o gel.
Continuar adicionando o tampo e acompanhar o
fracionamento dos componentes da amostra, anotando
os resultados.
5. Questes para discusso:
5.1- Explique o que ocorreu em cada etapa executada.
5.2- Pelos resultados obtidos no item 4.5, podemos
afirmar que a soluo de sulfato de amnio saturado
precipita todas as protenas? Por qu? Como podemos
saber se esta precipitao reversvel ou no?
5.3.- Pelos resultados obtidos no item 4.6, podemos
afirmar que o etanol gelado precipita todas as protenas?
e Por qu? Como poderamos comprovar isto? O
precipitado obtido (aps centrifugao) seria
redissolvido em tampo? Por qu?
5.4 - Qual foi a ordem de eluio das amostras na coluna
(item 4.7)? Por qu?
6 - Exerccios complementares:
6.1- Voc dispe num laboratrio de dois frascos
idnticos, porm, no rotulados. Um deles contm
soluo de aminocidos e, o outro, contm uma soluo
de protenas. Qual seria o seu procedimento para
identificar as duas solues e rotular os frascos?
o
6.2- Descrever um mtodo que permita separar a
protena no 6 de uma mistura que contenha seis
protenas, sabendo-se que: a) as protenas de no 1, 3 e 5
precipitam pelo sulfato de amnio a 40% de saturao;
b) as protenas de no 1, 2, 4 e 6 precipitam pelo etanol
gelado; c) as protenas de no 1, 3, 5 e 6 precipitam pelo
sulfato de amnio a 75% de saturao; d) os pontos
isoeltricos das protenas 1 e 3 so iguais a 6,5 ; o da
protena 2 7,2; o das protenas 4 e 6 se igualam a 6,3 e
o da protena 5 6,8.
14
6.3- Num extrato biolgico existem hormnios proticos
e isoenzimas, que devem ser isolados da maneira mais
pura possvel para uso posterior. Voc dispe de sulfato
de amnio, TCA, etanol, resinas cromatogrficas,
equipamentos cromatogrficos e de eletroforese. Que
mtodos voc poderia utilizar? Explique o seu princpio
e como execut-lo. Que mtodos no poderiam ser
utilizados?
6.4- Uma soluo a 1% de hormnio anti-diurtico
(nonapeptdio) foi submetida aos tratamentos abaixo
com os seguintes resultados: a) reao fortemente
positiva para o biureto e fracamente positiva para
ninhidrina; b) a adio de cido forte gelado e posterior
neutralizao do pH, no alteraram os resultados do
item anterior; c) Com a adio de cido forte quente
(100oC por 2 h) e posterior resfriamento e neutralizao
do pH , a reao da ninhidrina foi positiva (fortemente
positiva). Interprete e explique estes resultados.
15
 PRTICA No 4 - CINTICA ENZIMTICA

1. Introduo meio reacional so determinantes para a velocidade

Enzimas so catalisadores biolgicos: aceleram a reacional.
velocidade das reaes qumicas, diminuindo a energia A velocidade de uma reao catalisada pode ser
de ativao. Possuem, em geral, estrutura protica, determinada, em instantes iniciais, atravs da
sendo que foram descritas algumas molculas de RNA determinao do produto formado por unidade de tempo
com atividade cataltica. As enzimas no alteram a (caso mais comum) ou atravs da mensurao do
constante de equilbrio nem a variao de energia livre substrato consumido por unidade de tempo. O produto
das reaes, sendo regeneradas, sob a forma original, ao formado pode ser medido diretamente atravs de alguma
final da catlise. As molculas reagentes so propriedade fsico-qumica caracterstica, ou ento fazer
denominadas substratos (S) e produtos (P) so formados uma reao qumica com este produto produzindo um
ao final. As enzimas so, geralmente, bastante outro que possua propriedades apropriadas para medida.
especficas com relao aos substratos, formando um Uma propriedade freqentemente usada para tal fim a
complexo com estes durante a catlise: capacidade do produto a ser quantificado de absorver
E + S ES E + P determinados comprimentos de onda de radiaes
Algumas teorias procuram explicar esta luminosas (o que no deve, em princpio, acontecer com
especificidade: 1- teoria de Fischer (chave-fechadura) qualquer outra substncia encontrada no meio
, onde enzima e substrato seriam complementares; 2- reacional), aplicando-se os princpios da fotometria.
teoria de Koshland do encaixe induzido, ou seja, o Os ensaios de atividade enzimtica
substrato durante a catlise se encaixa na enzima; 3- desenvolvidos na aula prtica sero realizados com a
teoria que prope o perfeito encaixe no estado de enzima FOSFATASE, presente no extrato aquoso da
transio, estado onde a barreira energtica (energia de batata inglesa. No ensaio, a enzima catalisar a reao
ativao) foi vencida. de desfosforilao do para-nitrofenil fosfato, resultando
Diversos so os fatores que influenciam a na formao de um composto de cor amarelada em meio
velocidade de uma reao enzimtica. Por terem alcalino, o para-nitrofenol. Portanto, a atividade
estrutura protica, alteraes no pH, na temperatura, na enzimtica ser detectada pelo aparecimento da
fora inica do meio reacional podem modific-las (s colorao amarela no meio reacional.
vezes, at a estrutura dos substratos alterada),
modificando, assim, a velocidade das reaes. Como
esperado, a concentrao de substrato e de enzima no

2. Objetivos
Avaliar o efeito de alguns fatores que interferem na atividade enzimtica, tais como, o tempo de reao, a
concentrao de substrato e a concentrao de enzima.

16
3. Reagentes IMPORTANTE: O homogeneizado deve ser usado

Uma batata inglesa mdia (cerca de 110g). no prazo mximo de 30 minutos.

Substrato: para-nitrofenilfosfato de sdio 1mM
(soluo fresca). 5. Procedimentos
NaOH 0,02N. Enumerar os tubos de ensaio que seu grupo vai usar;
Liquidificador. Colocar sempre os reagentes na mesma ordem em
todos os tubos;
4. Preparo de frao com atividade de fosfatase
O HOMOGENEIZADO DEVER SER
alcalina
ADICIONADA SEMPRE POR LTIMO.
Descascar a batata;
Aps adicionar o homogeneizado, agite a mistura
Homogeneizar a batata descascada em 200mL de
suavemente;
gua, usando um liquidificador;
A incubao ser realizada temperatura ambiente.
Filtrar o homogeneizado em algodo.

5.1. INFLUNCIA DO TEMPO DE REAO

SUBSTRATO GUA HOMOGENEIZADO Tempo aps a adio de 2mL de
TUBO
(mL) (mL) (mL) NaOH 0,02N (min)
1 3,0 2,0 0,5* 0
2 3,0 2,0 0,5 2
3 3,0 2,0 0,5 5
4 3,0 2,0 0,5 10
5 3,0 2,0 0,5 20
6 3,0 2,0 0,5 30

*Adicionar 2mL de NaOH 0,02N antes da adio do homogeneizado (SOMENTE NO TUBO 1)

Observe a cor desenvolvida em todos os tubos.

Anote os resultados.

5.2. INFLUNCIA DA CONCENTRAO DA ENZIMA

GUA HOMOGENEIZADO
TUBO SUBSTRATO (mL)
(mL) (mL)
7 3,0 1,0 0,0
8 3,0 0,9 0,1
9 3,0 0,5 0,5
10 3,0 0,0 1,0

Aps 5 minutos de reao, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo.

Observe a cor desenvolvida nos tubos (7-10). Anote os resultados.

17
5.3. INFLUNCIA DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO. (curva [S]] x velocidade da reao)

SUBSTRATO SUBSTRATO GUA

TUBO HOMOGENEIZADO (mL)
M (mL) (mL)
11 0,0 0,0 5,0 0,5
12 54,5 0,3 4,7 0,5
13 163,0 0,9 4,1 0,5
14 272,0 1,5 3,5 0,5
15 545,0 3,0 2,0 0,5
16 909,0 5,0 0,0 0,5

Aps 10 minutos de reao, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo.

Observe a cor desenvolvida nos tubos (11-16). Anote os resultados.

6. Questes para discusso:

TUBO ENZIMA
6.1- Por que a enzima (homogeneizado) s deve ser (mL)
adicionada por ltimo? 1 0,2
2 0,4
6.2- Como so fixadas as condies de dosagem de uma 3 0,6
determinada enzima em condies timas? 4 0,8
5 0,8
6.3- Explique os resultados de cada item.
7.2 - Ao estudar-se in vitro a cintica da reao onde a
formao do produto P (fumarato), a partir do substrato
7. Exerccios complementares
S (succinato) catalisada pela enzima E (succinato
7.1- A variao da velocidade de reao de uma enzima
desidrogenase) verificou-se que:
em funo de sua concentrao foi analisada em 5 tubos
I) no sendo possvel obter-se a enzima pura, usou-se,
conforme o indicado na tabela abaixo. Cada tubo
sempre, um mesmo volume do mesmo extrato celular;
recebeu 0,8 mL de uma soluo de substrato 0,01mM. A
II) a quantidade de substrato inicial estava em ligeiro
enzima usada (E) estava contida num homogeneizado
excesso; III) o pH tinha sido previamente estudado e
heptico a 10g% e na tabela abaixo esto indicados os
escolheu-se aquele que proporcionava o mximo de
volumes deste homogeneizado adicionado a cada tubo.
atividade enzimtica; IV) a formao de produto cresceu
O volume final em cada tubo foi o mesmo, ajustado com
entre o instante zero (incio da reao) at 20 minutos da
tampo apropriado. Ao final de 30 minutos de reao a
reao; V) a partir do 20o minuto de incubao, a
quantidade de produto formado foi igual em todos os
velocidade de reao medida pela quantidade de
tubos, exceto no tubo 5 que foi mantido a 0oC durante
produto formado por minuto, diminuiu.
toda a experincia. Com estas informaes, discuta:
VI) todas as observaes acima foram obtidas em
a) o fato de ter sido obtida a mesma quantidade de
temperatura tima de reao.
produto nos quatro primeiros tubos;
Pede-se: discutir os fatores, dentre aqueles
b) sem alterar o tempo de reao, como seria possvel
analisados, que poderiam acarretar a diminuio da
aumentar a quantidade de produto formado nesses
velocidade a partir do 20o minuto de incubao.
quatro tubos?
c) o que teria acontecido no tubo 5?

18

PRTICA N 5 URINLISE
1. Introduo
Os rins desempenham suas funes mais
importantes ao filtrarem o plasma sangneo e
removerem as substncias do filtrado em quantidades
variveis, dependendo das necessidades do corpo. Alm
disso, eles depuram as substncias indesejveis do
filtrado (e, portanto, do sangue), ao excret-las na urina,
enquanto devolvem ao sangue as
indispensveis ao metabolismo. A intensidade de
excreo de diferentes substncias na urina representa a
soma de trs processos renais: filtrao glomerular,
reabsoro de substncias dos tbulos renais para o
sangue e secreo de substncias do sangue para os
tbulos renais.
A urina normal essencialmente composta de
gua, tem colorao varivel entre o incolor e o amarelo
(dependente da dieta, atividades fsicas e principalmente
da ingesto de gua), e carreia substncias de excreo,
resultantes do metabolismo do organismo. Todo sangue,
ao passar pelos rins, filtrado ou depurado, eliminando
seus catablitos, que so veiculados pela gua.
Entretanto, podem aparecer na urina
anormais, como: albumina, glicose e altas quantidades
de corpos cetnicos, sais e pigmentos biliares
(urobilinognio e urobilina). A anlise da urina fornece
valiosas informaes no diagnstico de doenas renais,
das vias urinrias, do trato genital e at de doenas
sistmicas.
Esta prtica refere-se a dois dos exames de rotina
de urina, atravs dos quais possvel observar o
metabolismo anormal envolvendo algumas substncias
como a glicose e os corpos cetnicos.
Em condies normais, no aparece glicose na
urina em quantidade detectvel pelos
convencionais, visto que, praticamente, toda a glicose
o
filtrada reabsorvida pelos rins. Entretanto, quando a
carga filtrada excede a capacidade de reabsoro da
glicose, a sua excreo urinria se d em nvel
detectvel. Um grande aumento da concentrao
plasmtica de glicose, capaz de elevar a carga de
filtrao renal acima de 320 mg/minuto, ocasiona a
excreo do excesso de glicose na urina. A glicose
substncias
plasmtica no indivduo sadio quase nunca fica elevada
o suficiente para causar a sua excreo pela urina. A
glicosria (presena de glicose na urina) pode estar
relacionada a vrias causas, como, por exemplo: fatores
endcrinos, hepticos, neurolgicos e alimentares. No
diabetes mellitus no-controlado, o nvel plasmtico de
glicose pode atingir valores elevados, com conseqente
excreo urinria desta ose. A presena de glicose na
urina pode ser evidenciada atravs da reduo alcalina
pelo cobre. Portanto, utiliza-se para a pesquisa de
glicose na urina o reagente de Benedict, que consiste de
uma soluo de sulfato de cobre em um meio alcalino.
Os chamados corpos cetnicos (acetoacetato,
cido -hidroxibutrico e acetona), quando presentes em
elementos
nveis elevados na urina, indicam um quadro de jejum
severo e prolongado ou diabetes mellitus no tratado.
Em condies normais, o cido acetoactico e o cido
-hidroxibutrico que entram na corrente sangnea so
transportados, to rapidamente, para os tecidos, que suas
concentraes plasmticas, combinadas, raramente se
elevam acima de 3 mg/dL. Os corpos cetnicos so
liberados do fgado e transportados at as clulas.
Todavia, as clulas so limitadas, quanto quantidade
de corpos cetnicos que podem oxidar, devido a vrias
razes, dentre as quais pode-se destacar a quantidade de
oxaloacetato que necessrio para iniciar a oxidao de
reagentes Acetil-CoA no ciclo do cido ctrico. Os corpos
cetnicos no sangue e na urina podem atingir nveis
19
extraordinariamente altos, provocando uma condio verde (qualquer tom) com positivo +
conhecida como: cetonemia e cetonria, precipitado amarelo
castanho ou marrom positivo ++
respectivamente. A pesquisa de corpos cetnicos na
vermelho tijolo positivo +++
urina realizada atravs do reagente de Imbert. Este
reativo de uma soluo de nitroprussiato de sdio em
4.2. Pesquisa de Corpos Cetnicos
cido actico glacial.
colocar 8 ml de urina em um tubo de ensaio;
adicionar 12 gotas do Reativo de Imbert e misturar;
2. Objetivo
inclinar o tubo e com o auxlio de uma pipeta, deixar
Analisar amostras de urina, quanto presena ou
escorrer pelas paredes do tubo aproximadamente 3
ausncia de glicose e de corpos cetnicos.
ml de NH4OH 10%, lentamente, de tal maneira que
os dois lquidos no se misturem;
3. Reagentes observar a superfcie de contato entre os dois
8,5 mL de urina. lquidos.
2,5 mL de Reativo de Benedict ( CuSO4; citrato de
sdio e Na2CO3).
RESULTADOS
1 mL de Reativo de Imbert ( nitroprussiato de sdio
e cido actico glacial). Nenhuma alterao ocorrida negativo

3 mL de NH4OH 10% (p/v).

Presena de um anel violeta positivo
4. Procedimentos

4.1. Pesquisa de Glicose

5- Questes para Discusso
colocar 2,5 ml do Reativo de Benedict em um tubo
de ensaio; 5.1- Comente (sucintamente) a participao dos

depositar 4 gotas de urina lmpida; hormnios: adrenalina, cortisol, glucagon e insulina no

misturar e levar ao banho-maria at entrar em controle da glicemia, envolvendo as vias metablicas e

ebulio; os seus mecanismos de ao.

deixar esfriar espontaneamente (aproximadamente 5.2- Por que em condies de jejum severo e
15 minutos); prolongado ou o diabete melito no compensado pode
observar a colorao do lquido. acarretar uma cetonemia e conseqente cetonria?

5.3- Conceitue e diferencie (metabolicamente):

RESULTADOS diabetes insipidus e diabetes mellitus e diabetes
cor inalterada (azul) negativo renallis.
verde-azulado ou verde traos

20
 PRTICA No 6 - ISOLAMENTO DE DNA DE CLULAS DE CEBOLA

1. Introduo utilizando-se uma soluo de clorofrmio/lcool

Nos organismos eucariontes e procariontes a
isoamlico, que desnatura as protenas e, aps
informao gentica est localizada nas molculas de
centrifugao, estas so retiradas da soluo de DNA.
cido desoxirribonuclico (DNA), que so polmeros de
nucleotdeos, nos quais o acar a desoxirribose. O
2. Objetivo
DNA est localizado principalmente no ncleo dos
Isolar DNA de clulas de cebola.
eucariontes, associado com protenas (principalmente
histonas) e dentro de organelas como mitocndrias e
3. Material
cloroplastos.
Cebola.
Os mtodos utilizados para a deteco e
Soluo salina-EDTA:
dosagem do DNA celular nuclear de eucariontes (pois o
NaCl 0,15 M
de cloroplastos e mitocndrias no em geral, detectado
EDTA 0,1 M (pH=8,0).
pelas tcnicas rotineiras) implicam no rompimento das
SDS 2% (P/V).
membranas citoplasmtica e nuclear. Neste experimento,
Etanol absoluto 95%.
o rompimento das membranas plasmtica e nuclear ser
Soluo Tris-EDTA (TE)*
realizado com o tratamento do detergente aninico
10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA - pH 7,5.
duodecil sulfato de sdio (SDS). Os tratamentos com
Obs:
detergentes, inicos ou no, so largamente utilizados na
*Esta soluo mantm a fora inica, dissolvendo o
solubilizao de protenas e lipdeos de membrana.
DNA, alm de quelar ons divalentes, necessrios para a
Nestes processos de solubilizao por detergentes, so
ao da DNase.
formadas micelas, que consistem de protenas, lipdios e
detergentes. O tratamento das clulas com uma
4. Procedimentos
concentrao relativamente alta de SDS resulta no
Cortar 5 g de cebola (fatia fina e bem picotada);
rompimento das membranas celulares com a
Colocar a cebola picada em um tubo Falcon de 15
conseqente liberao das nucleoprotenas. A atividade
mL;
da enzima digestiva (DNAase) ser inibida pela ao do
Adicionar 2.5 mL de soluo salina EDTA;
EDTA em meio alcalino que altera pH e quela os ons
Adicionar 1.0 mL de SDS 2%;
divalentes necessrios ao da DNAase. A adio de
Macerar a cebola com ajuda de um basto de vidro
etanol sobre a fase aquosa, contendo os cidos nuclicos
durante 5 minutos;
dissolvidos, resultar na precipitao destes, uma vez
Filtrar a soluo com gaze para retirar os fragmentos
que o etanol diminui a constante dieltrica da gua,
de cebola;
promovendo uma menor solubilizao das molculas de
Colocar o filtrado em um tubo de vidro;
DNA.
Adicionar, lentamente, com pipeta, 4 mL de lcool
Nas tcnicas de biologia molecular, o DNA
etlico 95% de modo que os dois lquidos no se
deve estar livre de protenas, para isto, estas devem ser
extradas. Normalmente, esse procedimento realizado

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 misturem. Notar que na interface, forma-se um
material insolvel filamentoso, o DNA;
Introduzir um basto at a regio de interface.
Imprimir-lhe um movimento circular e verificar que
o material filamentoso ir aderir ao mesmo;
Retirar o basto e dissolver o precipitado a ele
aderido em 2 mL da soluo de Tris-EDTA.

SOLUO DE
DNA

A camada superior (aquosa) contm os dois tipos de

cidos nuclicos (DNA e RNA) que devem
coletados para posterior utilizao.

5. Questes para discusso:

5.1 - Qual a funo da soluo de SDS?

5.2 - Ao romper a clula e, tambm, suas organelas, pela

Desproteinizao (No realizada durante a aula tcnica descrita acima, o DNA no seria degradado por
prtica):
enzimas lisossomais?
Aps a dissoluo do DNA, adicione igual volume
(2 mL) da mistura de clorofrmio:lcool isoamlico
24:1 (V/V), e agite vigorosamente por 30 minutos;
Centrifugue a emulso resultante a 3000 rpm durante
10 minutos;
A emulso ser separada em 3 camadas;

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