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http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/immuno-port-chapter7.htm

IMUNOLOGIA CAPTULO SETE

REAES ANTIGENO-ANTICORPO E TESTES
SELECIONADOS
Dr Gene Mayer

Traduo: PhD. Myres Hopkins

EM INGLS

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SHQIP - ALBANIAN

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DR MYRES HOPKINS

ESCOLA DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DA CAROLINA DO SUL

LEITURA

(EM INGLS)
Male et al. Immunology
7th edio pp 67-74

OBJETIVOS
Descrever a natureza das reaes Ag-Ac
Comparar e diferenciar afinidade e avidez de anticorpos

Delienar a base para a especificidade e reatividade cruzada de anticorpos

Discutir os princpios dos testes cumumente usados em reaes antgeno/anticorpo

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Figura 1

I. NATUREZA DAS REAES ANTGENO-ANTICORPO

A. Conceito de Chave e Fechadura

O stio de combinao de um anticorpo localizado na poro Fab da molcula e construdo
a partir de regies hipervariveis de cadeias pesadas e leves. Estudos de cristalografia por
raios X das interaes antgeno-anticorpo mostram que o determinante antignico se aninha
em uma fenda formada pelo stio de combinao do anticorpo como ilustrado na Figura 1.
Dessa forma, nosso conceito de reaes antgeno-anticorpo o de uma chave (i.e. o antgeno)
que cabe em uma fechadura (i.e. o anticorpo).

B. Ligaes No-covalentes
As ligaes que unem o antgeno ao stio de ligao do anticorpo so todas no-covalentes por
natureza. Elas incluem pontes de hidrognio, ligaes eletrostticas, foras de Van der Waals e
hidrofbicas. Ligaes mltiplas entre o antgeno e o anticorpo garantem que o antgeno ser
ligado fortemente ao anticorpo.

C. Reversibilidade
Uma vez que as reaes antgeno-anticorpo ocorrem via ligaes no-covalentes, elas so por
natureza reversveis.

PALAVRAS CHAVE

Affinity
Avidez
Especificidade
Reatividade cruzada
Aglutinao
Hemaglutinao
Aglutinina
Titragem
Pro-zona
Hemaglutinao passiva
Teste de Coombs Direto
Teste de Coombs Indireto
Inibio de hemaglutinao
Ponto de equivalncia
Excesso de anticorpo
Excesso de antgeno
Imunodifuso radial
Imunoeletroforese
Contraimunoeletroforese
Radioimunoensaio
Ensaio Imunoadsorvente Ligado Enzima
RIA/ELISA Competitivo
RIA/ELISA No Competitivo
Imunofluorescncia
Citometria de fluxo
Fixao do complemento
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Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

II. AFINIDADE E AVIDEZ

A. Afinidade
Afinidade de um anticorpo a fora da reao entre um nico determinante antignico e um
nico stio de combinao no anticorpo. a soma das foras de atrao e repulso que
operam entre o determinante antignico e o stio de combinao do anticorpo, como ilustrado
na Figura 2.

Afinidade a constante de equilbrio que descreve a reao antgeno-anticorpo, como ilustrado

na Figura 3. A maioria dos anticorpos tm uma elevada afinidade por seus antgenos.

B. Avidez
Avidez uma medida da fora total de ligao de um antgeno contendo muitos determinantes
antignicos e anticorpos multivalentes. A avidez influenciada tanto pela valncia do anticorpo
como pela valncia do antgeno. Avidez mais que a soma de afinidades individuais. Isto
ilustrado na Figura 4.

Repetindo, afinidade se refere fora de ligao entre um nico determinante antignico e um

stio de combinao de um anticorpo particular, enquanto que avidez se refere fora total de
ligao entre antgenos e anticorpos.

III. ESPECIFICIDADE E REATIVIDADE CRUZADA

A. Especificidade
Especificidade se refere abilidade de um stio de combinao de anticorpo em particular de
reagir com apenas um antgeno. Em geral, h um elevado grau de especificidade nas reaes
antgeno-anticorpo. Anticorpos podem distinguir diferenas em 1) estrutura primria de um
antgeno, 2) formas isomricas de um antgeno, e 3) estrutura secundria e terciria de um
antgeno.

B. Reatividade cruzada
Reatividade cruzada se refere habilidade de um stio de combinao de anticorpo em
particular de reagir com mais de um determinante antignico ou a habilidade de uma populao
de molculas de anticorpos de reagir com mais de um antgeno. A Figura 5 ilustra como
reaes cruzadas podem ocorrer. Reaes cruzadas aparecem porque o antgeno envolvido
na reao cruzada compartilha um mesmo epitopo com o antgeno imunizador ou porque ele
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tem um epitopo que estruturalmente semelhante ao epitopo no antgeno imunizante (multi-

especificidade).

IV. TESTES DE REAO ANTGENO-ANTICORPO

A. Fatores que afetam a medio de reaes antgeno-anticorpo

A nica forma de se saber se uma reao antgeno-anticorpo ocorreu descobrir um jeito de
detectar direta ou indiretamente os complexos formados entre o antgeno e o anticorpo. A
facilidade da escolha sobre qual deles poder detectar as reaes antgeno-anticorpo vai
depender de vrios fatores.

1. Afinidade
Quanto maior a afinidade do anticorpo pelo antgeno, mais estvel ser a interao. Nesse
caso, a facilidade com que se pode detectar a interao maior.

2. Avidez
Reaes entre antgenos multivalentes e anticorpos multivalentes so mais estveis e portanto
mais fceis de detectar.

Figura 6

3. Razo entre antgeno e anticorpo

A razo entre o antgeno e o anticorpo influencia a deteco dos complexos antgeno-
anticorpo porque o tamanho dos complexos est relacionado com a concentrao do
antgeno e do anticorpo. Isto mostrado na Figura 6.

4. Forma fsica do antgeno

A forma fsica do antgeno influencia em como se detecta sua reao com um anticorpo. Se o
antgeno particulado, geralmente se observa a aglutinao do antgeno pelo anticorpo. Se o
antgeno solvel, geralmente se pesquisa a precipitao de um antgeno aps a produo de
grandes complexos antgeno-anticorpo insolveis.

Figura 7

B. Testes de Aglutinao

1. Aglutinao/Hemaglutinao
Quando um antgeno particulado, a reao de um anticorpo com o antgeno pode ser
detectada pela aglutinao (agrupamento) do antgeno. O termo geral aglutinina usado para
descrever anticorpos que aglutinam antgenos particulados. Quando o antgeno um eritrcito
usado o termo hemaglutinao. Todos os anticorpos podem teoricamente aglutinar antgenos
particulados mas IgM, devido sua elevada valncia, particularmente uma boa aglutinina e
se pode s vezes inferir que um anticorpo deve ser da clase IgM se for um bom anticorpo
aglutinador.

a. Teste de aglutinao qualitativo

Testes de aglutinao podem ser usados de maneira qualitativa para investigar a presena de
um antgeno ou um anticorpo. O anticorpo misturado com o antgeno particulado e um teste
positivo indicado pela aglutinao do antgeno particulado. (Figura 7).
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Por exemplo, clulas vermelhas do sangue de um paciente podem ser misturadas com um
anticorpo dirigido a um antgeno de grupo sanguneo para determinar o tipo sanguneo da
pessoa. Em um segundo exemplo, o soro de um paciente misturado com clulas vermelhas
do sangue de um tipo sanguneo conhecido para pesquisar pela presena de anticorpos para
aquele tipo sanguneo no soro do paciente.

Figura 8

b. Teste de aglutinao qualitativo

Testes de aglutinao podem tambm ser usados para medir o nvel de anticorpos para
antgenos particulados. Neste teste, realizada uma diluio seriada de uma amostra a ser
testada para anticorpos e a seguir adicionado um nmero fixo de clulas vermelhas
sanguneas, bactrias ou outro antgeno particulado. Em seguida determinada a diluio
mxima que ainda permite aglutinao. A diluio mxima que ainda permite aglutinao
visvel chamada de ttulo. Os resultados so descritos como a recproca entra a diluio
mxima que ainda permite aglutinao visvel. A Figura 8 ilustra o teste quantitativo de
hemaglutinao.

Efeito prozona Ocasionalmente observado que quando a concentrao do anticorpo

elevada (i.e. diluies menores) no h aglutinao, mas quando a amostra posteriormente
diluida ocorre a aglutinao (Veja Paciente 6 na Figura 8). A ausncia de aglutinao em altas
concentraes de anticorpos chamada de efeito prozona. A ausncia de aglutinao no efeito
prozona devida ao excesso de anticorpos resultando em complexos muito pequenos que no
se aglomeram para produzir aglutinao visvel.

c. Aplicaes dos testes de aglutinao

i. Determinao dos tipos sanguneos ou de anticorpos para antgenos de grupos sanguneos.

ii. Avaliar infeces bacterianas

ex. O aumento em ttulo de um anticorpo dirigido a uma bactria em particular indica uma
infeco por aquele tipo bacteriano. N.B. um quadruplo em aumento do ttulo geralmente
considerado como um aumento significante de ttulo de anticorpos.

d. Consideraes prticas
Embora o teste seja de fcil execuo, apenas semi-quantitativo.

Figura 9

2. Hemaglutinao passiva
Os testes de aglutinao s funcionam com antgenos particulados. Entretanto, possvel se
cobrir eritrcitos com um antgeno solvel (ex. Antgeno viral, um polissacardeo ou hapteno) e
usar as clulas vermelhas sanguneas cobertas em um teste de aglutinao com anticorpos
para o antgeno solvel (Figura 9). Issso chamado de hemaglutinao passiva. O teste
realizado tal como o teste de aglutinao. As aplicaes incluem a deteco de anticorpos para
antgenos solveis e deteco de anticorpos para antgenos virais.

Figura 10

3. Teste de Coombs (Teste de Antiglobulina)

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a. Teste de Cooms Direto

Quando anticorpos se ligam a eritrcitos, eles nem sempre resultam em aglutinao. Isso pode
se dever relao antgeno/anticorpo, em que o antgeno em excesso, o anticorpo em excesso
ou em alguns casos cargas eltricas nas clulas vermelhas sanguneas prejudicam a eficincia
da ligao cruzada entra as clulas. Esses anticorpos que ligam mas no causam aglutinao
das clulas vermelhas sanguneas so s vezes referidos como anticorpos incompletos. Isso
no quer dizer de forma nenhuma que os anticorpos sejam diferentes em sua estrutura,
embora isso seja o que se pensava que fosse o caso. Pelo contrrio, esta uma definio
apenas funcional. Para detectar a presena de anticorpos no-aglutinadores nas clulas
vermelhas sanguneas, simplesmente se adiciona um segundo anticorpo diretamente contra a
imunoglobulina (anticorpo) que cobre as clulas vermelhas. Esta anti-imunoglobulina pode
agora fazer reao cruzada com as clulas vermelhas sanguneas e levar aglutinao. Este
teste ilustrado na Figura 10 e conhecido como teste de Coombs Direto.

Figura 11

b. Teste de Coombs Indireto

Se for necessrio saber se uma amostra de soro tem anticorpos dirigidos contra uma clula
vermelha sangunea em particular e voc quer se assegurar de que tambm vai detectar
anticorpos no-aglutinadores potenciais na amostra, realizado um teste de Coombs Indireto
(Figura 11). Este teste feito incubando as clulas vermelhas sanguneas com a amostra de
soro, lavando-se para retirar quaisquer anticorpos no ligados e depois adicionando um
segundo reagente anti-imunoglobulina para fazer ligao cruzada com as clulas.

c. Aplicaes
Entre estas se incluem a deteco de anticorpos (Rh) anti-fator rhesus . Anticorpos contra o
fator Rh geralmente no aglutinam clulas vermelhas sanguneas. Portanto, clulas vermelhas
+ -
de crianas Rh nascidas de mes Rh , que tm anticorpos anti-Rh, devem estar cobertas por
esses anticorpos. Para verificar isso, realizado um teste de Coombs direto. Para ver se a me
tm anticorpos anti-Rh no seu soro se realiza um teste de Coombs Indireto.

Figura 12

4. Inibio de Hemaglutinao
O teste de aglutinao pode ser modificado para ser usado na medio de antgenos solveis.
Este teste chamado inibio de hemaglutinao. chamado inibio de hemaglutinao
porque medida a habilidade de um antgeno solvel de inibir a aglutinao por anticorpos de
clulas vermelhas sanguneas cobertas por antgenos. Neste teste, uma quantidade fixa de
anticorpos dirigidos ao antgeno em questo misturada com uma quantidade fixa de clulas
vermelhas sanguneas cobertas com o antgeno (veja hemaglutinao passiva acima).
Tambm esto incluidas na mistura diferentes quantidades da amostra a ser analizada para a
presena do antgeno. Se a amostra contm o antgeno, o antgeno solvel ir competir com o
antgeno que cobre as clulas vermelhas sanguneas pela ligao com os anticorpos, inibindo
dessa forma a aglutinao das clulas vermelhas sanguneas, como ilustrado na Figura 12.

Pela diluio seriada da amostra voc pode quantificar o antgeno na sua amostra
desconhecida pelo seu ttulo. Este teste geralmente usado para quantificar antgenos
solveis e sujeito s mesmas consideraes prticas do teste de aglutinao.
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Figura 13

C. Testes de precipitao

1. Imunodifuso Radial (Mancini)

Na imunodifuso radial o anticorpo incorporado no gel de gar quando este for derramado e
diluies diferentes do antgeno so aplicadas nos poos perfurados no agar. medida que o
antgeno se difunde no gel ele reage com o anticorpo e quando o ponto de equivalncia
atingido formado um anel de precipitao, conforme ilustrado na Figura 13.

O dimetro do anel proporcional ao log da concentrao do antgeno, uma vez que a

quantidade de anticorpo constante. Portanto, ao correr diferentes concentraes de um
antgeno padro pode-se gerar uma curva padro a partir da qual se pode quantificar a
quantidade de um antgeno em uma amostra desconhecida. Por essa razo, este um teste
quantitativo. Se aparecerem no teste mais de um anel, ocorreram mais de uma reao
antgeno/anticorpo. Isso pode ser devido mistuda de antgenos ou de anticorpos. Este teste
comumente usado em laboratrio clnico para a determinao dos nveis de imunoglobulina em
amostras de pacientes.

Figura 14

2. Imunoeletroforese
Em imunoeletroforese, uma mistura complexa de antgenos aplicada em um poo perfurado
em um gel de gar e os antgenos so submetidos eletroforese, de forma que os antgenos
so separados de acordo com suas cargas. Aps a eletroforese, um sulco feito no gel e os
anticorpos so adicionados. medida que os anticorpos se difundem no gar so produzidas
linhas de precipitina na zona de equivalncia quando ocorre uma reao antgeno/anticorpo,
conforme ilustrado na Figura 14.

Este teste usado para a anlise qualitativa de misturas complexas de antgenos, embora uma
medida grosseira da quantidade (espessura da linha) pode ser obtida. Este teste comumente
usado para a anlise de componentes no soro de um paciente. O soro colocado no poo e
anticorpos para soro total colocado no sulco. Atravs da comparao com o soro normal,
possvel determinar se h deficincias em um ou mais componentes do soro ou se h uma
super-abundncia de algum dos componentes do soro (espessura da linha). Este teste pode
tambm ser usado para avaliar a pureza das protenas de soro isoladas.

Figura 15

3. Eletroforese contracorrente
Neste teste o antgeno e o anticorpo so colocados em poos perfurados no gel de gar e o
antgeno e o anticorpo so submetidos eletroforese um contra o outro, onde eles formam
uma linha de precipitao como ilustrado na Figura 15. Este teste somente funciona se forem
conseguidas as condies em que em que o antgeno e o anticorpo tenham cargas opostas.
Este teste primariamente qualitativo, embora a partir da espessura da banda voc possa
obter alguma medida da quantidade. Sua maior vantagem a rapidez.
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Figura 16

Figura 17

D. Radioimunoensaio (RIA)/Ensaio Enzimtico de Imunoabsoro (ELISA)

Radioimunoensaios (RIA) so ensaios baseados na medio da radioatividade associada com

complexos imunes. Em um teste particular, o marcador pode ser tanto o antgeno
como anticorpo. Ensaios enzimticos de Imunoabsoro (ELISA) so aqueles que so
baseados na medio de uma reao enzimtica associada com complexos imunes. Em um
teste em particular, a enzima deve esta ligada ao antgeno ou ao anticorpo.

1. RIA/ELISA Competitivo para Deteco de Ac

O mtodo e o princpio do RIA e ELISA para a medio de antgeno mostrado na Figura 16.
Pelo uso de quantidades conhecidas de um antgeno padro no marcado pode-se gerar uma
curva padro, relacionando a radioatividade da enzima ligada versus quantidade do antgeno.
A partir desta curva padro pode-se determinar a quantidade de um antgeno em uma amostra
desconhecida.

O ponto crucial do teste a separao dos complexos imunes do restante dos componentes.
Isso pode ser conseguido em muitas maneiras diferentes que servem como base para o nome
atribuido ao ensaio:

a. Precipitao por sulfato de amnia

Sulfato de amnia (concentrao final 33 - 50%) ir precipitar imunoglobulinas mas no muitos
antgenos. Esta tambm chamada tcnica de Farr.

b. Anticorpo anti-imunoglobulina
A adio de um segundo anticorpo dirigido contra o primeiro anticorpo pode resultar na
precipitao de complexos imunes e consequentemente na separao dos complexos e
antgenos livres.

c. Imobilizao do Anticorpo
O anticorpo pode ser imobilizado na superfcie de uma prola de plstico ou cobrindo a
superfcie de uma placa de plstico e assim os complexos imunes podem facilmente ser
separados dos outros componentes pela simples lavagem das prolas ou da placa (Figura 17).
Este o mtodo mais comumente usado hoje em dia e referido como RIA ou ELISA de fase
Slida. No laboratrio clnico, RIA e ELISA competitivo so comumente usados para quantificar
protenas sricas, hormnios e metablitos de drogas.
TUTORIAL

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TESTE ELISA
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Figura 18

Figura 19

2. RIA/ELISA no-competitivo para Ag ou Ac

RIA e ELISAs no competitivos so tambm usados para a medio de antgenos e anticorpos.
Na Figura 18, a prola coberta pelo antgeno e usada para a deteco de anticorpo na
amostra desconhecida. A quantidade do segundo anticorpo marcado ligado est relacionada
com a quantidade de anticorpo na amostra desconhecida. Este ensaio comumente
empregado para a medio de anticorpos da classe IgE dirigidos contra um alergeno em
particular, pelo uso de um antgeno e anticorpos anti-IgE como reagente marcador. Isto se
chama de teste RAST (teste radio-alergo-absorvente). Na figura 19, a prola est coberta com
anticorpo e usada para medir um antgeno desconhecido. A quantidade do segundo anticorpo
marcado que liga porporcional quantidade do antgeno que se liga ao primeiro anticorpo.

Figura 20

E. Testes para Antgenos Associados a Clulas

1. Imunofluorescncia
Imunofluorescncia a tcnica pela qual um anticorpo marcado com uma molcula
fluorescente (fluorescena, rodamina ou um dos vrios outros corantes fluorescentes) usado
para detectar a presena de um antgeno dentro ou sobre uma clula ou tecido, pela
fluorescncia emitida pelo anticorpo ligado.

a. Imunofluorescncia Direta
Na imunofluorescncia direta, o anticorpo especfico para o antgeno diretamente marcado
com o fluorocromo (Figura 20).

Figura 21

b. Imunofluorescncia Indireta
Na imunofluorescncia indireta, o anticorpo especfico para o antgeno no marcado e um
segundo anticorpo anti-imunoglobulina dirigido ao primeiro anticorpo marcado com o
fluorocromo (Figura 21). Fluorescncia indireta mais sensvel do que a imunofluorescncia
direta, uma vez que h amplificao do sinal.
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Figura 22

c. Citometria de Fluxo
Citometria de fluxo comumente usada em laboratrio clnico para identificar e enumerar
clulas contendo um antgeno particular. As clulas em suspenso so marcadas com um
marcador fluorescente pela imunofluorescncia direta ou indireta. As clulas so ento
analizadas no citmetro de fluxo.

A Figura 22 ilustra o princpio da citometria de fluxo. Em um citmetro de fluxo as clulas saem

de uma clula de fluxo e so iluminadas por um raio laser. A quantidade de raios laser que
dispersa para fora das clulas durante a passagem das mesmas pelo laser pode ser medida, o
que proporciona informao a respeito do tamanho das clulas. Alm disso, o laser pode
excitar o fluorocromo nas clulas e a luz fluorescente emitida pode ser medida por um ou mais
detectores.

Figura 23

O tipo de dado que obtido pela citometria de fluxo mostrado na Figura 23. Em um
histograma mono-paramtrico o aumento da fluorescncia (ex. Fluorescncia verde) plotado
no eixo dos x e o nmero de clulas exibindo aquela quantidade de fluorescncia plotado no
eixo dos y. A frao de clulas que so fluorescentes pode ser determinado pela integrao da
rea sob a curva. Em um histograma bi-paramtrico, o eixo dos x um parmetro (ex.
Fluorescncia vermelha) e o eixo dos y o segundo parmetro (ex. Fluorescncia verde). O
nmero de clulas indicado pelo contrno e pela intensidade da cor.

Figura 24

F. Fixao do Complemento
Complexos antgeno/anticorpo podem tambm ser medidos por suas habilidades de fixar o
complemento porque um complexo antgeno/anticorpo ir consumir o complemento se estiver
presente, enquanto que antgenos livres ou anticorpos no iro. Testes para complexos
antgeno/anticorpo que se baseiam no consumo do complemento so denominados testes de
fixao de complemento e so usados para quantificar reaes antgeno/anticorpo. Este teste
s ir funcionar com anticorpos que fixam complementos (IgG e IgM so os melhores).

O princpio do teste de fixao do complemento est ilustrado na Figura 24. O antgeno

misturado com o soro teste para ser investigado para presena de anticorpos e aguardada a
formao de complexos antgeno/anticorpo. Um tubo controle no qual nenhum antgeno
adicionado tambm preparado. Se nenhum complexo antgeno/anticorpo estiver presente no
tubo, nenhum complemento ser fixado. Entretanto, se complexos antgeno/anticorpo
estiverem presentes eles iro fixar o complemento e consequentemente diminuir a quantidade
de complemento no tubo. Aps se aguardar a fixao do complemento por quaisquer
complexos antgeno/anticorpo, adicionada uma quantidade padro de clulas vermelhas
sanguneas, previamente cobertas com anticorpos anti-eritrcitos. A quantidade de clulas
vermelhas sanguneas cobertas por anticorpos predeterminada para ser suficiente para usar
todo o complemento inicialmente adicionado, se este ainda estivesse l. Se todo o
complemento ainda estivesse presente (i.e., nenhum complexo antgeno/anticorpo se formou
entre o antgeno e o anticorpo em questo), todas as clulas vermelhas sero lisadas. Se
complexos antgeno/anticorpo so formados entre o antgeno e o anticorpo em questo, algum
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complemento ser consumido e, portanto, quando as clulas vermelhas cobertas com

anticorpo so adicionadas nem todas elas ir lisar. Pela simples medio da quantidade de lise
de clulas vermelhas pelos complexos antgeno/anticorpo pela medio da liberao de
hemoglobina no meio, pode-se quantificar indiretamente os complexos antgeno/anticorpo no
tubo. Testes de fixao de complemento so mais comumente utilizados para pesquisa de
anticorpos em uma amostra teste mas eles podem ser modificados para medio do antgeno.