HPLC - Cromatografia lquida de alta eficincia

Qumica Analtica / JCM

HPLC
 High Performance (pressure) Liquid Chromatography
nas colunas de enchimemto o fluxo baixo mesmo para granulometrias elevadas (150-200 m)
 < granulometria < HEPT - exige presses muito elevadas
mistura de nucleosidos - 1967 - 60 min / 10-20 psig
1969 - 24 min / 400 psig
1 psig = 108 kPa
1970 - 1,25 min / 5000 psig
 Condies actuais:
colunas de 5 a 25 cm com enchimento de 3 a 10 m
5000 - 10 000 psig / 40 000 - 100 000 pratos / m

HPLC - tipo de cromatoografia que emprega uma fase mvel lquida e uma fase estacionria finamente dividida e que,
para ter um fluxo razovel, opera a presses elevadas

Constituntes

Sistema de Aquisio e
Bombas Injector Coluna Detector
solventes trat. de dados
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Enviar at 11.04.07 para: marques@uma.pt

Validao

Num laboratrio de cromatografia com dois analistas foram realizados vrios

testes para verificar se o mtodo em uso para a determinao por GC de etanol
em hiclato de doxiciclina (valor terico: 4,5%) poderia ser considerado vlido.
Foram obtidos os seguintes resultados:
 tempos de reteno relativos: metanol: 0,3 / acetona : 0,6 / etanol 1,0
Metanol e acetona so possveis impurezas
 soluo amostra: 12345 / 12450 / 11950 / 12456 / 12100
 Solues de etanol a: 20%: 3120 / 40%: 4980 / 60%: 7305 / 80%: 9850 / 100%: 12300 /
 120%: 14650
 soluo amostra (repetio): 12245 / 12650 / 12405 / 12158 / 12250
 soluo amostra (outro dia /analista): 11900 / 13070 / 12347 / 11250 / 12440
Nota: as percentagens indicadas dizem respeito ao valor terico: 4,5%.

O mtodo selectivo?

Qual o valor obtido?

Que concluses poder tirar quanto validade do mtodo e destreza dos
analistas envolvidos na determinao?

Que sugeria para melhorar a confiana no resultado?
Qumica Analtica / JCM
Qumica Analtica / JCM
 Resoluo

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Desconhecendo a resoluo dificilmente se pode dizer se um mtodo selectivo

Se 4,5 % a percentagem terica, corresponde soluo a 100%!!
 Por isso se indicam solues acima e abaixo deste valor
 No se pode confundir o significado dos 4,5% e da % das solues padro

A maioria dos alunos retirou a soluo a 20% que neste caso no seria preciso
 A rea foi mudada de 3500 para 3120

Claramente um dos analistas tem falta de formao

 Nota: os resultados de ambos os analistas so exactos mas um deles pouco preciso
 A repetibilidade pode ser boa mas no a reproductibilidade
 A soluo no colocar o bom analista a fazer sempre o mtodo mas dar formao ao outro
analista

Resultado
 Quando se indica que o valor terico de 4,5 % significa que se admite que o erro esteja no 5!
No tem valor indicar um resultado com 3 algarismos significativos
Seria diferente se o valor terico fosse de 4,50 %
 HPLC

Qumica Analtica / JCM

Sistema de solventes
 desgaseificao / vcuo - hlio (sparging)
 Bombas
bombas de duplo pisto
vlvulas proporcionais
cmara de mistura
 eluio isocrtica - composio da FM constante
 eluio de gradiente - composio da FM varia ao longo
do cromatograma
Bombas isocrticas
Bombas binrias
Bombas quaternrias
 Bombas

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Bombas
 presso elevada (> 6000 psig) - riscos de fugas
 sada contnua (sem pulsao) / pisto
 fluxos de 0,1 a 10 ml/min
 reproductibilidade de fluxo de 0,5% !!
 Injector

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Injector
 o uso de septum limitado a cerca de 1500 psig
 injeco em loop de volume fixo ( 5 - 500 l)
tpico 20 l
 Autoinjector
Capacidade de preparao de amostras
 HPLC - colunas

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colunas
colunasde
deao
aocom
com1010aa30
30cmcmde
decomprimento
comprimentoee44aa10 10mm
mmdededimetro
dimetrointerno
interno
enchimento de 5 a 10 m / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos /
enchimento de 5 a 10 m / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos / m m

Micro: 3 a 7,5 cm de comprimento / DI = 1 a 4,6 mm / <10 000 psig / 3 ou 5 m / at 100 000 pratos / m
Vantagens: velocidade elevada e baixo consumo de solventes

Enchimento
 slica (aglomerao de partculas altamente regulares
eventualm. cobertas por filme orgnico
 alumina / polmeros porosos / resinas permutadoras de ies

3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System

HPLC Columns
 HPLC - enchimentos

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A cromatografia de partio representa a maioria das aplicaes

 lquido-lquido: fase estacionria um solvente adsorvido no suporte (apenas usado
ocasionalmente)
 fase ligada: fase estacionria orgnica est ligada superfcie do suporte por ligaes
covalentes (> estabilidade - > uso)

Enchimentos de fase ligada
/ / CH3 / / CH3
- Si -- OH + Cl - Si -- R --Si -- O -- Si -- R ; R = octil (C(8) / octadecil (C18)
\ \ CH3 \ \ CH3

 outros grupos funcionais: aminas alifticas / teres / nitrilos / hidroc. aromticos

 maior estabilidade / apresenta alguma limitao na capacidade de amostra

Cromatografia de fase normal
 fase estacionria polar / fase mvel no polar - o soluto menos polar elui primeiro
gua; trietilenoglicol; CN / hexano, ter isoproplico

Cromatografia em fase reversa (+ de 75 % das aplicaes)
 fase estacionria no polar / fase mvel polar / soluto mais polar elue primeiro
C8; C18 / solues aquosas de metanol, acetonitrilo, THF; solues tamponadas
 Pr-colunas + forno

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Pr-colunas
 aumento da vida das colunas
mesma (similar) composio da fase estacionria / maior granulometria
remoo de partculas e contaminantes dos solventes
saturao da fase mvel com a fase estacionria

Forno de colunas
 TA - 150 C (temperatura ambiente - ou ligeiramente acima - na maioria das
aplicaes)
Maior a temperatura menores os tempos de reteno
Maiores temperaturas causam maior degradao da coluna
 para a quantificao a termostatizao essencial ( 0,1 C)
A identificao essencialmente feita com base nos tempos de reteno
 HPLC

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Detectores HPLC

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 Espectro electromagntico

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A espectroscopia - estudo da interaco da radiao electromagntica com a matria

Espectro - representao bidimensional da fora da interaco vs. energia

raios raios gama raios x UV VIS IV micro ondas ondas rdio

Espectro
csmicos electromagntico
transies e- internos excitao vibrao rotao molecular
nucleares electrnica molecular spin electrnico RMN

, cm

Espectroscopia / espectrometria - informao geral / informao

quantitativa
 a espectroscopia est na base do grande desenvolvimento da cincia actual,
desde a qumica astronomia
 Fenmenos associados absoro da luz

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R - Relaxao vibracional

A - Absoro

F - Fluorescncia (mesmo spin)

P - Fosforescncia (spins dif.)

IC - Converso Interna (mesmo spin)

ISC - converso intersistema (spins
dif.)

P aparece sempre a maiores

comprimentos de onda (< E) que F
 Ambos os fenmenos so raros devido
aos tempos de vida muito curtos
 HPLC - detectores

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Os detectores de absoro (UV + Vis) so

usados na maioria das aplicaes
 clulas analticas
 detector de foto-diodos (diode array)

Sensitivity (toluene) 5x 10-8 g/ml

Sensitivity 1 x 10-7g/ml
Linear Dynamic Range 5x 10-8 to 5 x 10-4 g/ml Linear Dynamic Range 5 x 10-7 to 5 x 10-4 g/ml
Response Index 0.98 - 1.02 Response Index 0.97 - 1.03
UV comprimento de onda 360nm

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 DAD

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Comparao de espectros UV

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Fluorescncia vs. UV

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 HPLC

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Critrios de escolha
 uma boa separao representa sempre um balano entre as foras intramoleculares que se
estabelecem entre amostra e fases estacionria e mvel
 usar uma fase estacionria com polaridade semelhante amostra e uma fase mvel de
polaridade muito diferente
o contrrio possvel mas menos eficaz (tr geralmente muito curtos)
polaridades idnticas (amostra e fase estacionria) pode levar a tr muito longos
 alterar a polaridade do solvente (mistura) de forma a melhorar a separao

Aspectos experimentais
 temperatura estvel para trr reproductveis
 desgaseificao dos solventes
 2-3 rplicas e solues padro
limite de deteco - menor concentrao detectvel (3x acima do rudo de fundo)
limite de quantificao - menor concentrao determinada sem ambiguidade (10x vezes o rudo de
fundo)
Tailing - arrastamento do pico (coeficientes de partilha no lineares)

Cs Cs Cs

Cm Cm Cm
 Trabalho

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Descreva de forma breve o funcionamento de um detector ELSD

 Entregar por mail at 11 de Maio
 Tratamento de amostras

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Amostras puras
 apenas necessitam do solvente apropriado (solubilizao seguida de filtrao)
o solvente dever ser semelhante ou mais fraco que o usado na fase mvel
usar THF ou metanol em fase reversa (gua) pode provocar perdas de resoluo
a escolha do solvente pode ser condicionada pelo detector utilizado

Amostras compostas
 a presena de impurezas no dissolvidas exige, no mnimo, uma filtrao
 extrao da matriz (excipientes)
necessidade de determinar a % de recuperao
 uso de solventes diferentes do usado na injeco exige reconstituio da amostra
extrao / concentrao / reconstituio
 pr-colunas / separao de componentes de diferentes polaridades (Sep-Pak)

Amostras biolgicas
 caracterizadas por concentraes muito baixas
 precipitao das protenas (acetonitrilo + centrifugao) / concentrao / reconstituio
 SPE

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 LLE

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 Derivatizao

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Aminocidos
Reagente:6-aminoquinolyl-N-hydrozysuccinimidyl
carbamate
 Liberta: N-hydroxysuccinimide (NHS)
Reaco completa num minuto
Derivados estveis (+ de 1 semana)
Fluorescem a 395 nm

AccQTag column 3.9 x 150mm (waters)

Fluorescence detection with 250 nm excitation, 395 nm
emission
UV detection at 248 nm

A 140mM NaAC, 6.9mM Triethylamine, EDTA (1ml of a

1mg/ml solution per liter) pH to 5.8 w / 5 - 10%
phosphoric acid solution
B Acetonitrile
C Water
Cromatografia preparativa

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 Aquisio e tratamento de dados

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Automao
 o uso de computadores veio aumentar a capacidade de utilizao dos aparelhos
 preparao da amostra / injeco / controlo / aquisio / tratamento de dados
sistemas de optimizao de separaes cromatogrficas

Aquisio de dados
 20 - 200 Hz ( > 8 pontos por pico)
para definir um pico so precisos pelo menos
3 pontos a subir e 3 a descer
 armazenagem (identificao)

Tratamento de dados
 acumulao / smoothing / integrao / derivatizao
 determinao de tempos (tr) e intensidades (reas / alturas)
integrao - definio do princpio e fim do pico
picos mal definidos (falta de resoluo e tailing)
 correo da linha de base
 tratamento posteriori
utilizando novos parmetros (threshold / integrao)
 no melhora a separao!!