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APOPTOSE Culturas de Células Citometria de Fluxo 2009 PDF
APOPTOSE Culturas de Células Citometria de Fluxo 2009 PDF
Julho de 2009
Agradecimentos
Este relatrio tem por objectivos expor em os princpios gerais de cultura de clulas e da
citometria de fluxo para anlise dos efeitos da radiao ionizante em culturas de clulas. Assim,
conceitos relacionados com culturas de clulas, incluindo tipos de culturas e vantagens e
desvantagens, so expostos no presente relatrio. Adicionalmente, o princpio da tcnica de
citometria de fluxo, bem como, o seu uso em estudos dos efeitos da radiao ionizante em
culturas de clulas, so igualmente apresentados.
Summary:
This report aims to explain in the basic principles of cells culture and flow citometry for the study
of ionizing radiation effects on cells culture. Thus, subjects such as cells culture type and
advantages/disadvantages of cells culture are explained. Additionally, basic principles of flow
citometry, as well as, its applicability for the study of ionizing radiation effects on cell culture are
also presented.
ndice
Captulo I. Princpios Gerais de Culturas de Clulas ..................................................................... 1
1.1 Introduo ................................................................................................................................ 2
1.2 Tipos de Culturas ..................................................................................................................... 3
1.3 Morfologia e Caractersticas Funcionais .................................................................................. 5
1.4 Meios de Cultura ...................................................................................................................... 7
1.5 Avaliao e Contaminao da Cultura ..................................................................................... 9
1.6 Sumrio ................................................................................................................................. 14
Captulo II. Citometria de Fluxo e Avaliao dos Efeitos da Radiao em Culturas de Clulas .. 15
2.1 Introduo .............................................................................................................................. 16
2.2 Citmetro de Fluxo: Principais Caractersticas ...................................................................... 17
2.3 Vantagens e Desvantagens da Citometria de Fluxo .............................................................. 19
2.4 Citometria de Fluxo para Avaliao dos Efeitos da Radiao em Culturas de Clulas.......... 21
2.5 Sumrio ................................................................................................................................. 24
Captulo III. Concluso................................................................................................................. 26
Bibliografia ................................................................................................................................... 28
Captulo I. Princpios Gerais de Culturas de Clulas
Princpios Gerais de Culturas de Clulas e Citometria de Fluxo para Avaliao dos Efeitos da Radiao Ionizante
1.1 Introduo
A cultura de clulas tem vindo a afirmar-se como uma ferramenta muito til em mltiplas
reas de investigao das cincias da sade.
O termo cultura tecidular refere-se ao processo de extraco de tecidos ou rgos de um
animal ou planta, com consequente colocao num ambiente artificial capaz de sustentar e
proporcionar o crescimento destes. Este ambiente , geralmente, criado num receptculo de
plstico ou vidro com um meio de cultura lquido ou semi-slido capaz de fornecer nutrientes
essenciais para a sobrevivncia e crescimento do tecido ou rgo. Quando se removem clulas
de fragmentos de rgos antes ou durante a cultura, com concomitante separao das clulas
vizinhas, diz-se que se est a realizar uma cultura de clulas.
Apesar das culturas de clulas animais terem sido realizadas com sucesso por Ross
Harrison em 1907, s na dcada de 40 e 50 do sculo XX, e aps vrios desenvolvimentos,
que ocorrem as primeiras culturas de clulas amplamente disponveis como ferramenta de
pesquisa para os cientistas, (Ryan 2008). As principias razes para isso incluem: primeiro, o
desenvolvimento de antibiticos, que facilitaram o processo de cultura celular e evitaram muitos
dos problemas inerentes a contaminaes da cultura celular; segundo, verificou-se a melhoria
das tcnicas, nomeadamente, aquelas relacionadas com o uso de tripsina para remoo de
clulas dos vasos de cultura e fundamentais para a obteno de linhas celulares em crescimento
contnuo (tais como, clulas HeLa); finalmente, como terceira razo, surgem as linhas de
culturas de clulas padronizadas, com meios de cultura quimicamente definidos, o que facilitou o
trabalho padronizado entre diferentes grupos de cientistas, bem como, facilitou o processo de
cultura celular, tornando-o mais gil, (Ryan 2008).
O presente captulo tem como principais objectivos abordar os principais conceitos de
culturas de clulas; nomeadamente, o conceito de linha celular, meio de cultura, avaliao da
cultura e morfologia celular. Para tal, estruturou-se o mesmo da seguinte forma: primeiro,
aborda-se os principais tipos de clulas; depois, algumas das caractersticas funcionais e
morfolgicas das culturas; de seguida, expe-se tcnicas para avaliao da cultura; e finalmente,
apresenta-se um sumrio.
Remover tecidos
Separar tecidos
Digesto com
enzimas
proteolticas
organismo de origem. Existem basicamente dois grandes grupos de culturas celulares: culturas
primrias, as quais so obtidas directamente de tecidos, so heterogneas, mantm-se pouco
tempo em cultura e so mais propcias ao desenvolvimento de contaminaes; e linhas
celulares, que so obtidas a partir de culturas primrias, podem ser clulas imortalizadas (devido
a alteraes genticas), apresentam crescimento rpido e contnuo e proliferao ilimitada ou
limitada a um nmero elevado de divises celulares, Figura 1.2, (Coimbra 2008).
Figura 1.2. Clulas de culturas primrias ( esquerda) e linhas celulares ( direita) (retirado de (Coimbra
2008)).
clulas derivadas de tecidos slidos (como por exemplo: pulmo e rim) tendem a crescer em
monocamadas aderentes, (SIGMA 2008).
As culturas celulares podem ser descritas com base na sua morfologia (forma e aspecto)
ou com base nas suas caractersticas funcionais. Assim, podem ser dividias em trs grandes
grupos, (Ryan 2008):
Epiteliais: clulas que aderem ao substrato e apresentam forma achatada e
poligonal;
Linfoblsticas: clulas que, normalmente, no aderem ao substrato, permanecendo
em suspenso com uma forma esfrica;
Fibroblsticas: clulas que esto aderidas ao substrato e apresentam-se alongadas,
bipolares e frequentemente formam remoinhos.
O uso de tcnicas de fuso tornou possvel o desenvolvimento de clulas hbridas pela
juno de dois tipos de clulas diferente. Estas podem exibir caractersticas de uma das clulas
me ou das duas. Esta tcnica foi utilizada em 1975 para criar clulas capazes de produzir
anticorpos monoclonais especficos, (Ryan 2008). As referidas clulas, denominadas hibridomas,
so formadas pelo uso de duas clulas diferentes, mas relacionadas entre si. A primeira um
linfcito derivado do bao com capacidades de produzir o anticorpo desejado; enquanto, a
segunda uma clula de melanoma com grande capacidade de proliferao, a qual
programada para produzir grandes quantidades de anticorpos, mas no para produzir o
anticorpo.
As caractersticas das culturas de clulas resultam da relao entre a sua origem e a
forma de adaptao destas s condies da cultura celular. Marcadores bioqumicos podem ser
utilizados para determinar se as clulas continuam a desempenhar funes especializadas, da
mesma forma que enquanto presentes nos tecidos in vivo. Marcadores morfolgicos e
ultraestruturais podem tambm ser examinados. Frequentemente, estas caractersticas so
perdidas ou alteradas como resultado do processo de colocao no ambiente artificial da cultura
de clulas. Algumas linhas celulares podem, eventualmente, parar a sua diviso celular,
demonstrando sinais de envelhecimento contnuos. Estas clulas so denominadas finitas.
Outras linhas, ditas imortais continuam a dividir indefinidamente, sendo denominadas linhas
celulares contnuas. Quando uma linha celular dita normal se transforma numa linha imortal,
realizando deste modo, uma alterao irreversvel ou transformao, quer intencionalmente (pela
utilizao de frmacos, radiao ou vrus) quer de forma espontnea, diz-se que so clulas
transformadas. Como caractersticas principais, estas clulas apresentam um crescimento,
geralmente, mais fcil e rpido; contudo, apresentam, frequentemente, cromossomas anormais e
Um meio de cultura consiste numa soluo base definida, normalmente constituda por
sais, acares e aminocidos, bem como, alguns suplementos misturados, dependendo do tipo
de clulas, (Hartung 2002).
Para muitos investigadores, um ambiente saudvel para a sobrevivncia das clulas em
cultura deve ser aquele que permita, pelo menos, um aumento do nmero de clulas devido
diviso celular (mitose). Adicionalmente, quando as condies do meio de cultura so as ideais,
as clulas podem apresentar funes fisiolgicas e bioqumicas similares s que apresentam in
vivo, tais como, contraco muscular ou secreo de enzimas ou hormonas. Para alcanar este
meio de cultura ideal importante considerar a temperatura, o substrato para adeso da camada
de clulas e o meio de cultura.
A temperatura do meio , geralmente, colocada temperatura corporal do dador de
onde foram retiradas as clulas; atendendo a que, vertebrados de sangue frio apresentam
temperaturas entre 18 e 25 C, enquanto os mamferos exibem uma temperatura entre 36 e 37
C. A manuteno da temperatura na cultura de clulas conseguida pelo uso de incubadoras
bem calibradas e ajustadas.
Para clulas que necessitam de um substrato para suporte este deve ser capaz de
fornecer capacidade de suporte, mas tambm crescimento. Os substratos mais comuns so o
vidro e alguns tipos de plstico tratados. Para alm disso, devem ser adicionados factores de
adeso, tais como, o colagnio, gelatina, fibronectina e laminina, que melhoraro o crescimento
e funo normal de clulas derivadas do crebro, vasos sanguneos, rins, fgado, pele e muitos
outros. Muitas vezes, as clulas que aderem podem funcionar melhor quando a superfcie de
adeso permevel ou porosa, pois deste modo podem polarizar de forma similar ao que
sucede no interior do corpo.
Como referido, o meio de cultura um factor importante e complexo em termos de
controlo para alcanar um meio de cultura desejado pois, para alm dos requisitos nutricionais, o
meio de cultura necessita de factores de crescimento, regulao do pH e osmolalidade e
fornecimento de gases essenciais (como oxignio e dixido de carbono). Os nutrientes
Subcultura
e sedimentao Prxima
Subcultura
Densidade de
Saturao
Clulas/cm-2
Clulas/ml
Tempo
Duplicao
Figura 1.3. Curvas de crescimento celular: (a) Aumento do nmero de clulas numa escala logartmica
em funo dos dias decorridas aps subcultura; (b) Parmetros cinticos que podem ser derivados da
curva (a) (adaptado de (Freshney 2006)).
(a) (b)
Figura 1.4. Hemocitmetro e determinao do nmero de clulas ((a) adaptado de (Mather 1998;
Coimbra 2008) e (b) de (Mather 1998)).
As contaminaes biolgicas detectveis a olho nu podem, por isso, ser controladas com
rigor atravs de uma observao diria da cultura de clulas ao microscpio; contudo, no caso
de infeco da cultura de clulas por micoplasmas ou vrus, as alteraes podem passar
despercebidas, mas podem por outro lado incluir: reduo da taxa de crescimento, alteraes
morfolgicas, aberraes dos cromossomas e alteraes do metabolismo dos aminocidos e
cidos nucleicos, (SIGMA 2008).
A investigao utilizando culturas de clulas ou os bancos de clulas deve apresentar as
mesmas livres de contaminaes e em estado saudvel. O uso continuado de antibiticos e
agentes anti-fungicos pode, por vezes, mascarar a presena destes organismos, conduzindo ao
desenvolvimento de estirpes mais resistentes e, portanto, mais difceis de eliminar. Por este
motivo, importante avaliar periodicamente a presena de contaminao da cultura de clulas.
O primeiro passo para detectar contaminao bacteriana ou fngica consiste na
observao macroscpica e microscpica. Uma vez detectada a contaminao, todos os
reagentes e soros utilizados na cultura de clulas, bem como, a prpria cultura tm que ser
destrudos com hipoclorito de sdio e, posteriormente, descartados.
Dado que se utiliza soro e tripsina natural como suplementos aos meios de cultura, bem
como, para a realizao de subculturas, o risco de contaminao por estes agentes deve ser
sempre considerada. Para alm disso, a contaminao por vrus pode surgir de outras fontes,
tais como, o tecido ou rgo do dador ou factores de crescimento contaminados por outras
culturas infectadas. A eliminao das contaminaes por vrus difcil e no existe um teste
universal para identificao deste tipo de contaminantes, pelo que, os vrus podem ser
identificados utilizando um vasto leque de testes moleculares e imunolgicos. Estes testes
incluem, usualmente, os patogenes potencialmente perigosos para os humanos, como por
exemplo, o HIV. A monitorizao de vrus deve ser realizada cada 3 a 4 meses.
O micoplasma um organismo sub-microscpico que atravessa os filtros de 0.22 m
utilizados para a filtrao estril dos reagentes e soros utilizados nas culturas celulares. Ao
contrrio das infeces por bactrias comuns, as provocadas pelo micoplasma no resultam em
alteraes visveis da cultura. Actualmente, tm surgido testes dedicados ao teste de
micoplasma em culturas de clulas, sendo que, estes devem ser realizados cada dois meses,
(Besta 2004).
1.6 Sumrio
2.1 Introduo
Dois modelos distintos de morte celular, necrose e apoptose, distinguem-se com base
nas diferenas morfolgicas, bioqumicas e alteraes moleculares que ocorrem nas clulas
aquando do seu processo de morte, (Hanon E. 1996). A necessidade de obter informao dos
processos biolgicos, nomeadamente processos de morte celular, tem conduzido ao
aparecimento e utilizao de mltiplos equipamentos e tcnicas para o efeito, (Silva 2004). Uma
das tcnicas utilizadas para avaliar tais processos biolgicos a citometria de fluxo.
Sabe-se que, a radiao ionizante um agente potencialmente danificador do ADN, quer
seja por efeitos directos, quer seja por efeitos indirectos sobre as clulas irradiadas. A induo
de aberraes cromossmicas, bem como, de alteraes no ciclo celular, mitose aberrante ou
morte celular podem aumentar com o aumento da dose de irradiao, (Baatout 2004).
Frequentemente, para que se possam estudar os efeitos da radiao em termos de
biologia celular, particularmente, induo de apoptose, usa-se a citometria de fluxo. Esta uma
ferramenta muito til e de fcil utilizao, sendo capaz de fornecer informaes sobre clulas em
fases iniciais de apoptose, clulas em fase final de apoptose, clulas necrticas, entre outras
informaes.
A citometria de fluxo uma tcnica quantitativa de anlise celular, tendo-se desenvolvido
o primeiro citmetro de fluxo em 1970 e, a partir da, este tem-se tornado um instrumento
essencial nas cincias biolgicas. De entre as suas mltiplas aplicaes salientam-se aquelas
relacionadas com hematologia, enumerao reticulcita, anlise da funo celular, cintica do
ciclo celular, gentica, biologia molecular e microbiologia, (Riley 2005; Nolla 2008).
No presente captulo pretende-se expor alguns dos conceitos chave para a
compreenso da citometria de fluxo, designadamente, pela enumerao de algumas
caractersticas do citmetro de fluxo e pela comparao desta tcnica com a microscopia
tradicional. Para alm disso, pretende-se ainda expor a utilidade da citometria de fluxo na
avaliao dos efeitos da radiao em culturas de clulas. Assim, o captulo foi organizado por
temas, comeando pelo citmetro de fluxo, vantagens e desvantagens da citometria de fluxo e
sua utilidade na avaliao dos efeitos da radiao em clulas.
Filtros Dicrticos
Fluxo Clulas
Tubos
Fotomultiplicadores
Figura 2.1. Esquema da constituio interna de um citmetro de fluxo; deve-se notar o sistema de lentes
(adaptado de (Caprioglio 2008)).
Amostra clulas
Sheat Fluid
Cmara de Fluxo
Lente do Laser
Figura 2.2. Representao de uma cmara de fluxo; a passagem individual das clulas (eventos)
conseguida pela focagem hidrodinmica do fluxo de amostra no seio da soluo salina (sheat fluid)
(adaptado de (Nolla 2008)).
luz depende da estrutura interna da clula, do seu tamanho e forma. As substncia fluorescentes
absorvem luz com um dado comprimento de onda e re-emitem diferentes comprimentos de
onda. Finalmente, a luz e/ou sinais desviados fluorescentes so detectados por uma srie de
fotododos, sendo posteriormente amplificados. Alguns filtros pticos presentes so essenciais
para bloquear luz indesejada, permitindo que apenas a luz com o comprimento de onda
desejado atinja o fotodetector, (Riley 2005).
A informao que se pode retirar dos ensaios de viabilidade clssicos, sobre os estados
fisiolgicos das clulas, limitada a dois nveis extremos de actividade metablica: o saudvel,
presente em clulas viveis com capacidade para se dividirem, e o correspondente morte
celular. Contudo, por vezes, as clulas encontram-se num estado fisiolgico intermdio entre o
metabolicamente activo e a morte celular, sendo que, o mtodo tradicional no contabiliza essas
clulas.
A vantagem da citometria de fluxo em analisar clulas individualmente consiste na
deteco de uma variedade de estados fisiolgicos celulares intermdios que realmente existem
numa determinada populao, descobrindo assim uma heterogeneidade populacional. Para alm
disso, os dados obtidos atravs das tcnicas clssicas so relativos cultura como um todo, ou
seja, uma amostra representativa da cultura apresenta um nico valor, referente mdia dos
valores de um determinado parmetro, de todas as clulas. Contudo, numa populao celular, as
clulas no se encontram todas no mesmo estado metablico e fisiolgico, pelo que se torna
necessrio detectar e descrever as vrias subpopulaes de forma diferenciada. Mais uma vez,
a citometria de fluxo permite a avaliao da heterogeneidade de culturas, escala da clula
individual. Desta forma, dados discretos representando subpopulaes diferentes podem
fornecer uma imagem mais detalhada e real da complexidade e heterogeneidade que ocorre
num determinado bioprocesso. Por estes motivos, a citometria de fluxo tem tido, cada vez mais,
impacto na comunidade cientfica.
A combinao de vrios fluorocromos em citometria de fluxo permite a diferenciao de
diferentes subpopulaes numa determinada populao, correspondentes a diferentes nveis de
funcionalidade das clulas. Esta diferenciao levou introduo do termo vivel, mas no
culturvel, aplicado a clulas que no estando metabolicamente activas, tambm no esto
mortas e, evidentemente, no so reveladas atravs dos ensaios de viabilidade celular. A
Para alm das mltiplas vantagens da citometria de fluxo previamente explicadas, esta
permite ainda, uma rpida anlise do ADN, da expresso fenotpica e da funo celular. A
avaliao quantitativa desta tcnica tem sido muito utilizada na avaliao do transporte de
frmacos, fluxo do clcio, proliferao e apoptose celular. Sabendo destas potencialidades da
citometria de fluxo, e de muitas outras, alguns investigadores passaram a utilizar a citometria de
fluxo para monitorizar os efeitos da radiao na distribuio de ADN pelo ciclo celular em clulas
de mamferos.
O contedo de ADN de cada clula pode ser medido, podendo ser utilizado para estimar
a distribuio celular no ciclo celular. O ciclo celular divide-se em vrias fases: fase G1/G0, fase S
(sntese ADN), fase G2 e fase M (mitose). O contedo de distribuio de ADN numa populao
celular tpica em crescimento celular caracteriza-se por dois picos em G1/G0 e G2/M e um vale na
fase S. As clulas na fase G2/M apresentam o dobro da quantidade de ADN que a fase G1/G0,
sendo que a fase S apresenta variaes da quantidade de ADN entre as fases G1 e G2, Figura
2.3. A monitorizao do ciclo celular, bem como a sua regulao, fundamental para
compreenso dos efeitos da radiao na clula.
G1/G0
N clulas
Fase S
G2/M
Contedo de ADN
Figura 2.3. Representao do ciclo celular medido por citometria de fluxo com uso de iodeto de propdio
(adaptado de (Baatout 2004)).
Nmero de Clulas
Contedo de ADN
Figura 2.4. Representao grfica obtida com citometria de fluxo em clulas controlo e clulas irradiadas,
de notar o atraso na fase G2; resultados obtidos com uso de iodeto de propdio (adaptado de (Baatout
2004)).
Pico G0/G1
Sub-pico
Nmero de Clulas
G0/G1
Clulas
apotticas
Contedo de ADN
Figura 2.5. Deteco de apoptose em linfcitos humanos irradiados, utilizando o iodeto de propdio
(adaptado de (Baatout 2004)).
Clulas mortas
Clulas apoptticas
Clulas vivas
Figura 2.6. Avaliao da integridade da membrana de leuccitos com anexina V; verifica-se um aumento
do nmero de clulas apopttica com o aumento da dose (adaptado de (Baatout 2004)).
Anexina V
Apoptose
Externalizao da
fosfatidilserina
Membrana
Plasmtica
Citoplasma Citoplasma
2.5 Sumrio
Do presente captulo pode-se concluir que a citometria de fluxo uma tcnica superior
microscopia clssica, particularmente no que respeita determinao de clulas apoptticas,
necrticas e viveis, pois apresenta como principais vantagens a possibilidade de analisar
milhares a milhes de clulas, com uma taxa de 2000 a 5000 clulas por segundo, o que se
traduz numa elevada sensibilidade de deteco e ainda a possibilidade de avaliar
individualmente cada clula. Por outro lado, verifica-se que a citometria de fluxo uma tcnica
vlida para o estudo das alteraes celulares em culturas de clulas (por exemplo, apoptose,
necrose e viabilidade celular), nomeadamente aquelas relacionadas com os efeitos da radiao
ionizante.