UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

PR-REITORIA DE PESQUISA E PS-GRADUAO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA

RELATRIO TCNICO - CIENTFICO

Perodo: agosto / 2014 a julho / 2015

( ) PARCIAL
( X ) FINAL

IDENTIFICAO DO PROJETO

Ttulo do Projeto de Pesquisa (ao qual est vinculado o Plano de Trabalho):

Anlise funcional de elementos cis-regulatrios do celacanto (Latimeria
chalumnae) para o estudo da regulao de genes hoxd e evoluo do
autopdio em tetrpodes.

Nome do Orientador: Igor Schneider

Titulao do Orientador: DOUTOR

Faculdade: FACULDADE DE BIOTECNOLOGIA

Unidade: ICB

Laboratrio: LABORATRIO DE EVOLUO E DESENVOLVIMENTO DE

VERTEBRADOS (LEDVERT)

Ttulo do Plano de Trabalho: Estabelecimento de protocolo de Fertilizao in

vitro e descrio dos estdios de desenvolvimento embrionrio do peixe
sarcoptergio Lepidosiren paradoxa.

Nome do Bolsista: RODRIGO NOBRE MOREIRA

Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq

( ) PIBIC/UFPA
( ) PIBIC/INTERIOR
( ) PIBIC/FAPESPA
( ) PARD
( ) PARD - renovao
( ) PIBIC/PIAD
( ) PIBIC/AF
( ) PADRC
INTRODUO

A manipulao ambiental e hormonal da ovulao em peixes de muita

importncia, principalmente por resolver os problemas de assincronia na
desova das matrizes (Crim, L.W. e B.D. Glebe, 1984) e poder acelerar ou
desacelerar a gametognese para obteno de ovos de alta qualidade (Lam,
T.J, 1983). O uso de hormnios exgenos uma maneira efetiva de induzir a
maturao reprodutiva e produzir ovos fertilizados (Mylonas, C.C., A. Fostier
and S. Zanuy, 2009).

Originalmente culturistas utilizavam extrato de hipfise de carpa para

induzir a reproduo de peixes, e ainda hoje esse extrato ainda bastante
utilizado (Park, I.S., H.B. Kim., et al, 1994). Outro hormnio muito utilizado na
reproduo de varias espcies de peixes o HCG (gonadotrofina corinica
humana) (Kelly, A.M. and C.C. Kohler, 1994).

A utilizao dos hormnios liberadores de gonadotrofinas (GnRH) para a

induo a desova de peixes vem sendo utilizada com sucesso desde 1975
(Donaldson e Hunter, 1983). Esses hormnios so muito semelhantes entre os
vertebrados superiores e inferiores, havendo pequenas alteraes na estrutura
molecular do decapeptdeo. Por essa razo, o hormnio liberador de
gonadotrofina de mamfero e os seus anlogos so efetivos para induzir a
desova de vrias espcies de peixes. Como se trata de uma molcula pequena
e simples, a sntese desse hormnio foi possvel, abrindo possibilidade para
alterao da estrutura molecular e a sntese de anlogos, possibilitando a
produo de hormnios 50 a 100 vezes mais potentes (Harvey e Carolsfeld,
1993).

Trs grandes vantagens destes hormnios liberadores so verificadas

sobre a gonadotrofina na induo a maturao final e desova dos peixes. A
primeira que atuam no incio da cadeia hormonal e estimulam o peixe a
sintetizar a sua prpria gonadotrofina, eliminando assim os problemas
relacionados a utilizao de gonadotrofina de outras espcies. A segunda
que a molcula no altamente espcie-especfica. Por ltimo, so estruturas
simples e facilmente fabricadas, apresentam grande estabilidade estrutural, so
efetivas com pequenas dosagens de aplicao e o seu uso economicamente
vantajoso (Harvey e Carolsfeld, 1993).

J foi possvel a reproduo em cativeiro de varias espcies de peixes

em que imitar o seu ambiente natural quase impossvel.

A piramboia (Lepidosiren paradoxa), peixe pulmonado sul americano,

encontrado no rio Amazonas e nos sistemas do rio Paran-Paraguai. Vive em
aguas calmas como pntanos ou lagos que esto associados a vegetao e
condies de pouco oxignio (Lowe-McConnell, R.H, 1987).
 A piramboia possui reproduo externa e se reproduz sazonalmente
durante a poca chuvosa. Pouco se sabe sobre os hbitos reprodutivos desse
peixe alm de que os machos cavam ninhos na lama e cuidam dos ovos e dos
juvenis (Kerr, 1900).

A piramboia no apresenta nenhum valor comercial, entretanto, possui

um valor inestimvel para a cincia. Analises filogenticas e em geral a maioria
das evidncias moleculares e morfolgicas mostra que os peixes pulmonados
so o grupo vivo mais prximo dos tetrpodes (Meyer; Zardoia, 2003). Sendo
assim um dos mais importantes vertebrados vivos para se estudar a transio
evolucionaria da gua para terra (Almeida-Val; Nozawa, 2010).

JUSTIFICATIVA

O estudo comparativo do desenvolvimento de nadadeiras de peixes e

membros de tetrpodes seria grandemente beneficiado pela existncia de
recursos genticos e embriolgicos de um organismo modelo de peixe
sarcoptergio, que representa o grupo irmo dos tetrpodes. Neste projeto,
propomos estabelecer um protocolo de produo de embries do peixe
sarcoptergio Lepidosiren paradoxa, popularmente conhecido como piramboia,
a fim de viabilizar o estudo da gentica do desenvolvimento embrionrio deste
peixe, que pode ajudar no entendimento da evoluo de importantes
adaptaes vida terrestre como pulmes e membros.

OBJETIVOS

Objetivo Geral

Produo de embries de Lepidosiren paradoxa

Objetivos Especficos

Estabelecimento de protocolo de fertilizao in vitro.

Descrio dos estgios de desenvolvimento.

MATERIAS E MTODOS

COLETA DE ESPCIMES

O local da coleta foi na cidade de Breves na ilha do Maraj que fica 12

horas de navio saindo de Belm. A coleta foi feita nas pocas chuvosas, e nas
pocas de seca. Os animais foram capturados utilizando anzol e linha nos
alagados que ficam embaixo da casa dos moradores da rua bagre. As
piramboias ficaram mantidas em tanques de 300 litros e foram alimentadas
com pedaos de peixe, moluscos e camaro.
ANESTSICO

O anestsico utilizado foi a tricana metano sulfonato, onde foi diludo 3

gramas de tricana em 3 litros de agua para que fique na concentrao de 1g/L.
A anestesia foi utilizada na hora da injeo do hormnio e da extruso, para
evitar causar muito estresse no animal.

HORMNIO

Ovaprim

Anlogos de GnRH junto com antagonistas de dopamina so opes

mais seguras pois apresentam custo reduzido e estimulam uma menor
resposta imune nos reprodutores. O produto usado ser o Ovaprim (Syndel
Laboratories Ltd) que contm um anlogo de GnRH de salmo (sGnRHa) e um
inibidor de dopamina (Doparimedona). O GnRH no Ovaprim induz a liberao
dos hormnios gonadotrficos armazenados na hipfise. O inibidor de
dopamina serve para remover qualquer outra inibio da liberao e efeito do
GnRH. O resultado de usar Ovaprim uma alta liberao de hormnios da
hipfise que induz a maturao final dos gametas por meio dos hormnios
esteroides gonadais.

A aplicao foi intraperitoneal nas concentraes de 1 ml/kg tanto nos

machos quanto nas fmeas. .

EXTRUSO

Aps as aplicaes do hormnio as fmeas foram levadas para uma

bacia com uma esponja para evitar que elas se machuquem. Assim foi
pressionado o abdmen da fmea no sentido do orifcio genital. Os ovcitos
seriam amparados por uma bacia menor. O mesmo procedimento feito com
os machos, e o esperma cai por cima dos ovcitos.

FERTILIZAO

Ovcitos e espermatozoides seriam retirados dos peixes, sem contato

com a gua, misturados e somente depois adicionada a soluo de ativao
para que ocorra a ativao dos espermatozoides. Este procedimento
chamado de fertilizao a seco, pois os gametas so misturados antes da
adio da soluo de ativao. Ele possibilita a vantagem de ampliar o tempo
para o manejo dos gametas, permitindo assim, a separao e a quantificao
da desova nas pores a serem estocadas em distintas incubadoras, alm de
aumentar a taxa de fertilizao (Zaniboni Filho e Weingartner, 2007).

Seriam testados volumes de soluo de ativao entre trs a cinco

vezes o volume de ovcitos. Decorridos 30 a 40 segundos do inicio da mistura
seria adicionado um volume aproximado de cinco vezes o volume inicial para
garantir uma elevada taxa de fecundao (Weingartner e Zaniboni Filho, 2005).

MEIO MMR (MARCS MODIFIED RINGERS)

O meio MMR utilizado para evitar a ativao precoce dos gametas em

peixes e sapos. Pode ser utilizado tambm em uma concentrao menor para
melhorar as taxas de fertilizao.

MMR (10X, pH 7,4): para 1 l;

NaCl: 58,440g;
KCL: 1,49g;
MgSO4: 1,204g;
CaCl2: 2,940g;

HEPES: 11,915g;

RESULTADOS E DISCUSSO

Foram feitos dois experimentos utilizando o Ovaprim para induo

hormonal nas piramboias coletadas na poca de seca no ms de Outubro, fora
do seu perodo reprodutivo natural. Os experimentos foram feitos uma semana
aps a coleta.

As piramboias foram divididas em dois grupos, onde um grupo de

piramboias ficou em tanques separados e outro grupo em casais, onde cada
casal ficava em um tanque, para testar se pode existir alguma diferena na
ao do Ovaprim. A distino entre macho e fmea para formao dos casais
devido os machos apresentarem filamentos nas nadadeiras plvicas, que so
ausentes nas fmeas.

Foram testados dois tempos de extruso no grupo I, um tempo de 24h e

48h aps a aplicao do Ovaprim, sincronizado com o tempo das fmeas de
72h.

No grupo II o tempo de extruso foi de 48h para os machos e 72h para

as fmeas.

No grupo I foram injetadas oito piramboias, sendo cinco machos e trs

fmeas em tanques separados (tabela 1). Ao fim do experimento, no houve
liberao de gametas quando realizada a extruso nos machos e nas fmeas.
 Tabela 1: Dados do grupo I.
Animal Sexo Peso Quantidade Tempo de Concentrao
(Kg) (ml) Extruso (h) de Ovaprim
(ml/kg)
LP-15 M 1,980 1,98 24 1
LP-12 M 1,465 1,47 24 1
LP-13 M 1,765 1,77 24 1
LP-14 M 2,420 2,42 48 1
LP-16 M 2,155 2,16 48 1
LP-21 F 5,140 5,14 72 1
LP-06 F 2,730 2,73 72 1
LP-08 F 2,175 2,18 72 1

No grupo II foram formados trs casais e colocados um casal em cada

tanque (tabela 2)

Tabela 2: Dados do grupo II.

Animal Sexo Casal Peso Quantidade Tempo de Concentrao
(Kg) (ml) Extruso (h) de Ovaprim
(ml/kg)
LP-03 F 1 2,500 2,5 72 1
LP-05 M 1 2,020 2 48 1
LP-02 F 2 2,550 2,5 72 1
LP-07 M 2 1,487 1,5 48 1
LP-20 F 3 2,300 2,3 72 1
LP-17 M 3 1,889 1,9 48 1

Assim como no grupo I, no houve liberao de gametas quando feita a

extruso tanto nos machos quanto nas fmeas.

As piramboias coletadas no perodo chuvoso foram divididas em dois

grupos, onde um grupo ficou em tanques separados e o outro foi colocado em
4 piscinas de 1000L, cada uma contendo 1 casal.

O tempo de extruso foi de 72h para as fmeas e 48h para os machos,

sincronizado como tempo da extruso das fmeas.

No grupo com piramboias em tanques separados, foi utilizado 4

piramboias 2 machos e 2 fmeas (tabela 3).
 Tabela 3: Dados do grupo em tanques individuais.

Animal Sexo Peso Quantidade Tempo de Concentrao

(Kg) (ml) Extruso (h) de Ovaprim
(ml/kg)
LP-22 F 2,000 2 72 1
LP-23 M 1,830 1,83 48 1
LP-24 F 2,425 2,45 72 1
LP-25 M 1,529 1,5 48 1

No grupo que foi colocado nas piscinas foram utilizados 8 piramboias

(tabela 4).

Tabela 4: Dados do grupo em casais.

Animal Sexo Casal Peso Quantidade Tempo de Concentrao

(Kg) (ml) Extruso (h) de Ovaprim
(ml/kg)
LP-26 F 1 2,300 2,3 72 1
LP-27 M 1 2,000 2 48 1
LP-28 F 2 2,600 2,6 72 1
LP-29 M 2 1,684 1,7 48 1
LP-30 F 3 1,745 1,7 72 1
LP-31 M 3 1,435 1,4 48 1
LP-32 F 4 2,115 2,1 72 1
LP-33 M 4 1,620 1,6 48 1

Em nenhum dos grupos houve a liberao dos gametas esperada,

apenas uma piramboia (LP-24) do experimento com animais coletados na
poca chuvosa que estava em um tanque individual liberou uma pequena
quantidade de ovcitos na agua antes da extruso (Fig. 1), foi tentada a
extruso aps, mas sem sucesso.

Quatro piramboias (2 machos e 2 fmeas) previamente injetadas com

Ovaprim, foram sacrificadas para uma tentativa de coletar os gametas e
colocar em meio MMR (1X) para evitar a ativao dos espermatozoides ou dos
ovcitos ate o momento de serem colocados juntos. Os gametas foram
colocados juntos em meio MMR (0,1X) e ficaram em uma estufa h 28C.
Entretanto no houve fertilizao.
Figura 1: Ovos coletados do tanque da piramboia LP-24.

Os tempos de extruso (24h e 48h para os machos e 72h para fme) e a

quantidade de Ovaprim injetada (1ml/kg em machos e fmeas) nesses
experimentos foram baseados em trabalhos passados onde eu testei diferentes
concentraes e tempos de extruso e obtive resultados melhores com esses
parmetros. Foi possvel obter ovcitos e espermatozoides como mostrado nas
figuras 2 e 3. Entretanto o numero de animais utilizados foi pequeno para
afirmar os efeitos do Ovaprim.

Fig. 2: Ovcitos coletados do tanque.

 Fig. 3: Espermatozoides de piramboia do smen coletado vistos no microscpio.

Outros hormnios como HCG e Hipofise de Carpa foram injetados nas

piramboias, esses hormnios so muito comuns de serem usados na
piscicultura, entretanto nas piramboias ele causou uma resposta imune muito
forte.

Outro ponto que pode ter influenciado que logo aps a vitelognese a
atividade ovariana se torna mais reduzida e permanece em sintonia com a
adequao das condies ambientais, garantindo assim, que a liberao dos
ovcitos coincida com o perodo em que as caractersticas ambientais estejam
mais adequadas, isso chamado perodo de dormncia. Esse perodo muito
afetado pelas condies em que os reprodutores so mantidos, tais como:
qualidade de gua, alimentao e a frequncia de manejo. Caso as condies
ambientais no tenham desencadeado a maturao final e a desova posterior,
tem incio o processo de atresia folicular ou reabsoro celular, seguido pelo
rearranjo gonadal (Vazzoler, 1996). O estresse da captura e do transporte pode
ter desencadeado esse processo fazendo com que Ovaprim no tivesse mais
efeito.

CONCLUSO

A aquisio de gametas por induo hormonal da desova e espermiao

com Ovaprim no surtiu efeito esperado tanto no grupo que estava com os
animais separados quanto no grupo que estava com os animais em casais nos
perodos de seca e chuvoso. Novos hormnios sero explorados em
experimentos futuros na tentativa de obteno de embries.
 O Ovaprim aparenta ter um efeito na maturao e liberao dos
gametas, porem necessrio mais testes com doses e tempos diferentes alm
de para encontrar os valores corretos que levem a uma induo mais potente.
Outro ponto so os corretos parmetros da agua dos reprodutores e a
diminuio do estresse causado nos animais para evitar atresia folicular.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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ZANIBONI FILHO E WEINGARTNER. Tcnicas de induo da reproduo de

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373.

DIFICULDADES
A principal dificuldade a obteno dos animais.

PARECER DO ORIENTADOR:

Este foi um projeto exploratrio de considervel risco de insucesso. O progresso obtido pode
ser considerado satisfatrio, tendo em vista que muito pouco se sabe sobre a reproduo deste
peixe. O aluno desenvolveu o projeto com independncia e iniciativa e os resultados obtidos
refletem o empenho da aluna neste projeto.

INFORMAES ADICIONAIS:

DATA: ______/_________/________
 _________________________________________

ASSINATURA DO ORIENTADOR

____________________________________________

ASSINATURA DO ALUNO