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Clorofila PDF
Clorofila PDF
306
3 Edio
Fev/2014
14pginas
Title in English:
Determination of chlorophyll-a and pheophytin-a: spectrophotometric method
Resumo:
A clorofila a um pigmento encontrado em todos os grupos de vegetais e outros organismos
auttrofos sendo frequentemente, utilizada como indicadora da biomassa fitoplanctnica em
ambientes aquticos. A determinao da concentrao de clorofila a e feofitina a uma ferramenta til
em estudos de produtividade primria, na interpretao de resultados de anlises fsicas e qumicas,
como indicadora do estado fisiolgico do fitoplncton e na avaliao do grau de eutrofizao de um
ambiente aqutico. Esta Norma descreve os procedimentos para a determinao da concentrao de
clorofila a e feofitina a pelo mtodo espectrofotomtrico monocromtico.
CETESB 2014
CETESB / (L5.306 / fev/2014)
Primeira Edio
Com o ttulo de: Determinao de pigmentos fotossintetizantes - clorofila-A, B e C e feofitina-A: mtodo
de ensaio.
Dezembro/1978, homologada pela Deciso de Diretoria D.D. 002/77/DDPET, de 02/01/1978.
Segunda Edio
Com o ttulo de: Determinao de pigmentos fotossintetizantes - clorofila-A, B e C e feofitina-A: Mtodo
de ensaio.
Dezembro/1990, homologada pela Deciso de Diretoria D.D. 067/1991/P/N, de 20/05/1991.
Terceira Edio
Com o ttulo de: Determinao de Clorofila a, e Feofitina a: mtodo espectrofotomtrico:
Fevereiro/2014, homologada pela Deciso de Diretoria D.D. 093/2014/E, de 08/04/2014. Publicada
no Dirio Oficial do Estado de So Paulo Caderno Executivo I, v.124 (71) de 15/04/14, Poder
Executivo, Seo I, p. 53 a 55.
CETESB 2014
permitida a reproduo total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte. Direitos
reservados de distribuio.
Sumrio pgina
1 Introduo 2
2 Objetivo 4
3 Documentos complementares 4
4 Definies 4
5 Materiais, equipamentos, reagentes e solues 4
6 Execuo do ensaio 7
7 Resultados 9
8 Registro de dados e apresentao dos resultados 10
9 Referncias 10
Anexo A - Modelo de envelope 12
Anexo B -Exemplo de formulrio de registro dos resultados da anlise 13
Anexo C - Exemplo de boletim da anlise de clorofila a e feofitina a .14
1 Introduo
A clorofila (a, b, c e d) um dos grupos de pigmentos, alm dos carotenides (carotenos e xantofilas) e
ficobilinas, responsveis pelo processo fotossinttico (pigmentos fotossintetizantes). A clorofila a
encontrada em todos os grupos de algas e cianobactrias, j as clorofilas b, c e d, em alguns grupos
especficos, sendo que a ltima encontrada apenas nas rodofceas marinhas (Tabela 1).
A clorofila a frequentemente utilizada como indicadora da biomassa fitoplanctnica, ou seja, um
indicador do crescimento de algas e cianobactrias devido ao enriquecimento por nutrientes,
principalmente nitrognio e fsforo, fenmeno este denominado eutrofizao.
A clorofila a pode corresponder, dependendo das espcies presentes, de 1 a 2% do peso seco das
algas planctnicas (APHA, 2014). Assim, a clorofila a pode ser considerada uma importante varivel
indicadora do estado trfico de ambientes aquticos e uma ferramenta til na avaliao de impacto de
contaminantes orgnicos e inorgnicos e outros distrbios.
A Resoluo CONAMA 357/2005 estabeleceu padres de qualidade para clorofila a para guas doces,
classes especial, 1, 2 e 3, existindo, assim limites legais para a sua concentrao nesses ambientes
aquticos (BRASIL, 2005).
Tabela 1 Distribuio dos pigmentos que intervm na fotossntese nos diversos grupos de
algas e cianobactrias
Cianobactrias
Dinoflagelados
Diatomceas
GRUPOS
Criptofceas
Rodofceas
Clorofceas
Crisofceas
Euglenales
Feofceas
Clorofila a x x x x x x x x x
Clorofila b - - - - - - - x x
Clorofila c - - x x x x x - -
Clorofila d - x - - - - - - -
X presena - ausncia
Fonte: APUD CETESB (2014), modificado.
Entretanto, as molculas de clorofila no so estveis; dependendo das condies do meio, tais como
mudanas do pH, temperatura ou luminosidade excessiva, elas podem sofrer degradao, originando
produtos conhecidos como feopigmentos. A feofitina a, produto da degradao da clorofila a, pode
interferir grandemente nas medidas deste pigmento, por absorver luz na mesma regio do espectro que
a clorofila a.
Em 1967, Lorenzen props um mtodo eficiente para estimar as concentraes de clorofila a e feofitina
a, por meio de leituras espectrofotomtricas antes e aps acidificao da amostra; e um estudo
detalhado das metodologias foi apresentado pela UNESCO (1966). Por esse mtodo, o resultado de
clorofila a pode ser corrigido excluindo, portanto a concentrao de feofitina a encontrada na amostra.
e) como indicador do estado fisiolgico do fitoplncton, por meio da relao clorofila a / feofitina a;
2 Objetivo
3 Documentos complementares
Os documentos relacionados a seguir contm disposies que constituem fundamento para este
procedimento. As edies indicadas estavam em vigor no momento desta publicao. Como toda norma
est sujeita a revises e alteraes, aqueles que realizam procedimentos com base nesta, devem
verificar a existncia de legislao superveniente aplicvel ou de edies mais recentes das normas e
publicaes citadas.
APHA; AWWA; WEF. Standard methods for the examination of water and wastewater: online.
Washington, DC, c2006. Disponvel em: <http://www.standardmethods.org/store>. Acesso em: fev. 2014
BRANDO, C. J. et al. (Org.). Guia nacional de coleta e preservao de amostras: gua, sedimento,
comunidades aquticas e efluentes lquidos. So Paulo: CETESB; Braslia: ANA, 2011.
325 p. Disponvel em:
<http://arquivos.ana.gov.br/institucional/sge/CEDOC/Catalogo/2012/GuiaNacionalDeColeta.pdf>.
Acesso em: fev. 2014.
4 Definies
f) Eutrfico: Corpos de gua com alta produtividade primria em relao s condies naturais, de
baixa transparncia, em geral afetados por atividades antrpicas, em que ocorrem alteraes
indesejveis na qualidade da gua e interferncias nos seus mltiplos usos.
Para a execuo deste mtodo so listados abaixo os materiais, equipamentos, reagentes e solues
necessrias.
Para o planejamento amostral e detalhamento dos equipamentos e materiais, consultar o Guia Nacional
de Coleta e Preservao de Amostras (BRANDO et al., 2011), considerando sempre os objetivos do
estudo e o tipo de anlise que ser realizada.
e) membranas filtrantes ou filtro de fibra de vidro de 47 mm de dimetro, com porosidade entre 0,45
e 1,0 m;
g) gua destilada;
i) provetas graduadas;
j) bequeres de vidro;
c) acetona 90%;
g) refrigerador.
Cod.014-verso 01 28/02/2002 5/14
CETESB / (L5.306 / fev/2014)
a) balana de equilbrio;
b) acetona P.A (para soluo acetona 90% - para extrao e acetona 70% - para lavagem);
Preparo da acetona 90%: Elevar a 1 litro, com gua destilada, 900 mL de acetona P.A.
Preparo da acetona 70%: Elevar a 1 litro, com gua destilada, 700 mL de acetona P.A.
e) padro de clorofila a;
Materiais:
1 ampola de 1 mg do padro de clorofila a (espinafre),
1 balo de 100 mL com tampa esmerilhada (calibrado),
1 erlenmeyer 250 mL,
1 pipeta 10 mL,
1 funil pequeno,
acetona 90%,
frascos de vidro mbar com tampa rosquevel (vial),
pelcula de vedao.
Preparo da soluo: quebrar a ampola, com a pipeta lavar com pequena quantidade de acetona
90% para diluir o padro transferindo com o funil para o balo. Continuar o procedimento lavando
bem a ampola at no observar nenhuma colorao (lavar tambm a ponta da ampola). Completar
o volume para 100 mL com acetona 90%. Homogeneizar e verificar o volume, caso seja necessrio
acertar o volume. Distribuir cerca de 3,0 mL da soluo padro em frascos de vidro mbar (vial),
fechar imediatamente com tampa rosquevel, numerar cada frasco. Cobrir a tampa dos frascos
com pelcula de vedao. Manter os frascos em freezer em temperatura igual ou inferior a -20 C e
superior a -30 C.
6 Execuo do ensaio
6.2 Amostragem
Para o planejamento amostral e detalhamento dos procedimentos de coleta, consultar o Guia Nacional
de Coleta e Preservao de Amostras (BRANDO et al., 2011), considerando sempre os objetivos do
estudo e o tipo de anlise que ser realizada.
Este procedimento deve ser realizado minimizando-se a luminosidade incidida sobre a amostra.
a) preparar envelope de papel pardo, contendo informaes como: n da amostra, local, pH, data
da coleta e de filtragem,
c) Terminada a filtrao da amostra, lavar o porta-filtro com gua destilada contida em pissete,
deixar secar o filtro por alguns segundos, e retir-lo cuidadosamente com uma pina, evitando o
contato com as mos. Dobrar o filtro ao meio, de modo que o material filtrado fique para o lado
interno da dobra, ainda com a pina, guardar o filtro no envelope de papel pardo previamente
identificado,
e) se a amostra no puder ser filtrada em campo, deve ser filtrada o mais rapidamente possvel
aps a sua chegada ao laboratrio. A realizao da filtrao no deve exceder o prazo de 48 horas
aps a coleta;
f) o frasco contendo os envelopes com os filtros utilizados deve ser mantido no freezer em
temperatura igual ou inferior a -20 C e superior a -30 C por no mximo 28 dias;
g) aps a filtragem, devem ser registrados (formulrios em papel ou sistema eletrnico) o volume
filtrado e informaes relevantes da amostra como n da amostra, data e local de coleta, pH e data
da filtragem (mesmas informaes do envelope).
6.4 Extrao
Este procedimento deve ser realizado minimizando-se a luminosidade. Montar um lote de amostras a
serem analisadas, selecionando pela data de coleta, ou seja, as amostras filtradas mais antigas, bem
como as de pH menor que 7.
b) retirar o filtro do envelope, com a pina de inox, e coloc-lo dentro do tubo, conforme identificao
correspondente, e acrescentar a cada tubo 5 ml de acetona 90%;
d) lavar cuidadosamente o pistilo do macerador com acetona 70% antes de processar a amostra
seguinte, descartando a acetona utilizada para lavagem;
Este procedimento deve ser realizado o mais rpido possvel, evitando exposio prolongada luz,
bem como elevao da temperatura:
Observaes:
i. Para guas lmpidas, oligotrficas, cubetas de 5 cm de caminho ptico podem ser usadas para
aumentar a sensibilidade de leitura.
ii. importante que a leitura aps a acidificao seja feita em pelo menos um minuto, mas no mais
que dois minutos, aps a adio do cido.
iii. O espectrofotmetro deve ser verificado antes do uso utilizando-se uma soluo padro, cuja
concentrao de clorofila a conhecida. Coloca-se esta soluo na cubeta e realizam-se as leituras
7 Resultados
As leituras a 750 nm, antes e depois da acidificao, medem apenas a turbidez da amostra. Estas
leituras devem ser subtradas das densidades pticas lidas a 664 nm antes da acidificao, e 665 nm
depois da acidificao, obtendo-se assim as leituras corrigidas.
As concentraes de clorofila a e feofitina a podem ser obtidas a partir das seguintes equaes
monocromticas:
v
Clorofila a (g/L)= 26,73 x (D664c - D665c) x (V x L) (1)
v
Feofitina a (g/L)= 26,73 x [(1,7 x D665c) D664c] x (V x L) (2)
Onde:
Exemplo
Foram filtrados 700 mL de gua para extrao dos pigmentos.
Foi utilizada uma cubeta espectrofotomtrica de 1 cm de caminho ptico.
Foram utilizados 10 mL de acetona 90% na extrao.
As leituras em absorbncia obtidas antes da acidificao foram:
D750b = 0,002
D664 = 0,106
Correo da turbidez:
D664 - D750 = D664 corrigido = 0,106 0,002 = 0,104 (antes da acidificao)
v
Clorofila a (g/L)= 26,73 x (D664c-D665c) x (V x L) (1)
10
Clorofila a (g/L)= 26,73 x (0,104 0,075) x (0,7 x 1) (1)
v
Feofitina a (g/L) = 26,73 x [(1,7 x D665c) D664c] x (V x L) (2)
10
Feofitina a (g/L) = 26,73 x [(1,7 x 0,075) 0,104] x (0,7 x 1) (2)
9 Referncias
APHA; AWWA; WEF. Standard methods for the examination of water and wastewater: online.
Washington, DC, c2006. Disponvel em: <http://www.standardmethods.org/store>. Acesso em: fev.
2014.
BRANDO, C. J. et al. (Org.). Guia nacional de coleta e preservao de amostras: gua, sedimento,
comunidades aquticas e efluentes lquidos. So Paulo: CETESB; Braslia: ANA, 2011.
325 p. Disponvel em:
<http://arquivos.ana.gov.br/institucional/sge/CEDOC/Catalogo/2012/GuiaNacionalDeColeta.pdf>.
Acesso em: fev. 2014.
.../Anexo A
Anexo A - Envelope de papel kraft pardo (6,5 x 8,5 cm) para o acondicionamento do filtro.
------------------------------------
Amostra..........................................
Ponto..............................................
Volume...........................................
pH...................................................
Data de Coleta...............................
Data de Filtragem..........................
Obs.:...............................................
.../Anexo B
.../Anexo C
BOLETIM DE ANLISES
-------------------
N. XXXXX/2009
DADOS GERAIS
Amostra: 12222333
Emisso do Boletim: 31/01/2009
DADOS DA COLETA
Ponto: AAAAAA123
Local: XXX
Coletor(es): Jos
Data da coleta: 01/01/2009 Hora da coleta: 10:00
Tipo: gua bruta
RESULTADOS ANALTICOS
Volume filtrado: 600 mL
Resultado Unidade Data do ensaio
Clorofila-a 62,82 g/L 10/01/2009
Feofitina-a 7,66 g/L 10/01/2009
MTODO
Determinao pelo mtodo espectrofotomtrico conforme o procedimento XXX, baseado em:
(MTODO/NORMA BASE edio mais recente disponvel)
Profissional responsvel..................
Registro no Conselho .......................
Endereo da empresa, e-mail e telefone para contato, dados cadastrais,
Este Boletim de Anlise s pode ser reproduzido por inteiro e sem nenhuma alterao.
Os resultados desta anlise referem-se to somente amostra encaminhada.