Apostila Pratica de Processos Bioquimico PDF

Universidade do Estado do Rio de
Janeiro
FACULDADE DE TECNOLOGIA
ENGENHARIA DE PRODUO
DEPARTAMENTO DE QUMICA E AMBIENTAL
PROCESSOS BIOQUMICOS
MANUAL DE PRTICAS DE
PROCESSOS BIOQUMICOS
APOSTILA DAS AULAS PRTICAS
Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues

Telma Temteo dos Santos
Agosto de 2011
ndice
1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRO .............................................................2
2. QUANTIFICAO DE MICRO-ORGANISMOS ................................................................6
2.1 Roteiro da Prtica 1 Quantificao de Micro-organismos...................................................8
2.1.1. Preparo da Suspenso de Clulas..................................................................................8
2.1.2 Determinao do peso seco de clulas (%p/v)................................................................8
2.1.3. Turbidimetria ...............................................................................................................8
2.1.4. Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER ........................................................9
2.1.5. Determinao do volume do centrifugado (% v/v) ......................................................10
2.1.6. Estudo Dirigido..........................................................................................................10
2.1.7. Relatrio da Prtica 1 .................................................................................................11
3. DOSAGEM DE ACARES ..................................................................................................12
3.1 Mtodo do DNS (3,5 dinitro salicilato)...............................................................................13
3.2 Roteiro da Prtica 2 - Curva Padro do Mtodo DNS .........................................................14
3.2.1. Preparo da Soluo Padro de Glicose: 5 mols/mL ..................................................14
3.2.2. Construo da Curva Padro ......................................................................................14
3.2.3. Estudo Dirigido..........................................................................................................15
4. ACCARES REDUTORES (AR) E ACARES REDUTORES TOTAIS (ART) ..................17
4.1 Roteiro da Prtica 3 - Determinao de Acares Redutores (AR) e Acares Redutores
Totais (ART) ...........................................................................................................................20
4.1.1. Determinao de Acares Redutores (AR)................................................................20
4.1.2. Determinao de Acares Redutores Totais (ART) ...................................................20
4.1.3. Dosagem de acares pelo mtodo do DNS................................................................21
4.1.4 Relatrio da Prtica 3..................................................................................................22
5. Grau Brix.................................................................................................................................23
5.1 Roteiro da Prtica 4 - Determinao do BRIX ....................................................................24
5.1.1. Procedimento.............................................................................................................24
5. Cintica do Crescimento Microbiano........................................................................................26
5.1 Roteiro da Prtica 5 - Cintica do Crescimento de Clulas de Leveduras ............................29
5.1.1. Preparo da soluo de YED 2% e inoculao das clulas ............................................29
5.1.2. Determinao da concentrao de biomassa (X) .........................................................29
5.1.3. Relatrio DA Prtica 5 ...............................................................................................30
6. Produo de Etanol ..................................................................................................................31
6.1 Roteiro da Prtica 6 - Produo de Etanol em caldo de cana-de-acar ...............................32
6.1.1. Fermentao ..............................................................................................................32
6.1.2. Inibio da fermentao por NaF (inibidor da enolase) ...............................................32
6.2 Roteiro da Prtica 7 - Produo de Etanol em YED a 2% ...................................................34
6.2.1. Preparo da soluo de YED 2%..................................................................................34
6.2.2. Produo de clulas e de etanol e consumo de glicose ................................................34
6.2.3. Determinao do lcool pelo mtodo do dicromato.....................................................35
7. Acidez de vinhos......................................................................................................................37
7.1. Roteiro da Prtica 8 - Determinao da acidez total de vinhos ...........................................38
7.1.1. Procedimento.............................................................................................................38
7.1.2.Relatrio da Prtica 8..................................................................................................39
8. Preparo de Solues e Indicadores............................................................................................40
Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos
1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRO
O termo espectro foi utilizado inicialmente por Newton, quando este descobriu que a luz
branca, ao atravessar um prisma, dividida em vrias cores. Atualmente, sabe-se que o espectro
visvel apenas uma pequena parte do espectro eletromagntico. A luz , portanto, definida
como uma forma de energia eletromagntica, formada por ondas que apresentam comprimentos
diferentes. O comprimento de onda medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10 -9m. A tabela 1.1
mostra as regies do espectro em relao ao comprimento de onda.
Tabela 1. 1: Regies do espectro em funo do comprimento de onda

Regio Comprimento de onda (nm)
Raios X 0,1 a 100
Ultravioleta 100 a 400
Visvel 400 a 800
Infravermelho 800 a 5.000
Mico-onda 5.000 a 30.000
A capacidade que as diversas substncias qumicas tm de absorverem luz em

determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinao quantitativa e
qualitativa, uma vez que o espectro de absoro caracterstico para uma determinada substncia
e a quantidade de absoro (intensidade) dependente da concentrao do composto.
Os mtodos instrumentais esto sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as

mais diversas anlises nas inmeras reas de atuao na industria qumica destacando-se os
mtodos espectrofotomtricos.
A espectrofotometria medida de absoro ou transmisso de luz uma das mais

valiosas tcnicas analticas amplamente utilizadas em laboratrios de rea bsica, bem como em
anlises clnicas e biolgicas. Alguns exemplos de aplicao incluem: determinao de atividade
enzimtica ou nas dosagens de compostos orgnicos em fluidos biolgicos, como glicose, uria,
protenas, etc, em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de uma reao qumica, ou
um produto incolor que absorva na regio do UV ou do IV.
A tcnica baseia-se no fato de que quando um feixe de luz monocromtica atravessa uma
soluo com molculas absorventes, parte da luz absorvida pela soluo e o restante
transmitido. A absoro de luz depende basicamente da concentrao das molculas absorventes
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 2

e da espessura da soluo caminho ptico (Figura 1.1). Deve-se utilizar um feixe de luz
monocromtica de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado.
Beer em 1852 observou a relao existente entre a transmisso e a concentrao do meio

onde passa o feixe de luz. Uma determinada soluo absorve a luz proporcionalmente
concentrao molecular do soluto, isto , " A intensidade de um feixe de luz monocromtico
decresce exponencialmente medida que a concentrao da substncia absorvente aumenta
aritmeticamente ".
Figura 1. 1: Esquema de Absoro da Luz

Fonte: http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html
A anlise quantitativa em espectrofotometria realizada atravs da medida da

absorbncia, a qual se relaciona linearmente com a concentrao dentro de uma faixa de
concentrao, seguindo a lei de Lambert- beer. Para medidas de absoro de luz visvel e
ultravioleta na pesquisa bioqumica a indstria especializada fabrica vrios tipos de aparelhos,
comumente chamados de espectrofotmetros (Figura 1.2).
Nos espectrofotmetros a luz, fornecida por uma lmpada, fracionada pelo prisma ou
rede de difrao (monocromador) nos comprimentos de onda que a compem (luzes
monocromticas). O comprimento de onda selecionado dirigido para a soluo contida em um
recipiente transparente (cubeta). Parte da luz absorvida e parte transmitida. A reduo da
intensidade luminosa medida pelo detector (clula fotoeltrica) porque o sinal eltrico de sada
do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal eltrico amplificado e
visualizado no galvanmetro em nmeros lido como uma absorbncia e proporcional
concentrao da substncia absorvente existente na cubeta.

Figura 1. 2: Esquema ptico dos principais componentes do espectrofotmetro. As letras representam: (a)
fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difrao, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de
amostras com cubeta contendo soluo, (f) clula foteltrica, (g) amplificador.
Se houver proporcionalidade entre a absorbncia e a concentrao da substncia, pode-se

determinar a concentrao da substncia em amostras de concentrao no conhecida com base
numa curva de calibrao, que relaciona absorbncia e concentrao. Na Figura 1.3
apresentada uma curva de calibrao, que corresponde relao grfica entre os valores de
absorbncia e os de concentrao.
Figura 1. 3: Curva de Calibrao: Absorbncia em funo da Concentrao
Para se plotar uma curva padro necessria a leitura de pelo menos quatro pontos, se
esta estiver na faixa de linearidade ou de dez pontos, caso no esteja. Alm disso, preciso
trabalhar, ao menos em triplicata para cada ponto. A curva obtida a partir da insero de uma
linha de tendncia que passe pelos pontos experimentais. No exemplo da Figura 1.3 observa-se
que o ajuste dos pontos experimentais foi feito com uma reta. A qualidade do ajuste avaliada
pelo valor do R2, no mostrado neste exemplo.

Com base na anlise grfica da Figura 1.3 possvel verificar a linearidade da reao e
calcular um fator de converso de valores de absorbncia em concentrao.
FC = Mdia (Cp/Ap)
C = A.FC
Onde:
FC - fator de converso ou fator da curva
Ap - absorbncia do padro
Cp - concentrao do padro
C - concentrao da amostra
A - absorbncia da amostra
Observao:
Pode-se trabalhar com a Absorbncia (A), como mostrado no texto, ou com a

Transmitncia (T).
Na prtica, a transmitncia, que medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o
branco na passagem da luz), pouco utilizada, pois substituda pelo valor de densidade ptica
(D.O.) ou absorvncia, termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso
da transmitncia:
A = log 1/T
Referncias:
BRACHT, A; ISHII-IWAMOTO, E. L. Mtodos de Laboratrio em Bioqumica. So

Paulo: Manole, 2003.
http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html

2. QUANTIFICAO DE MICRO-ORGANISMOS
Os micro-organismos possuem a capacidade de ocupar e modificar um determinado

ambiente de forma rpida. A partir da proliferao, os micro-organismos tambm excretam
enzimas que modificam reagentes para a formao de novos produtos. Diante disso, a
quantificao microbiana um importante acompanhamento em processos industriais que
envolvam micro-organismos diretamente, exemplo da fermentao alcolica, ou para se verificar
a minimizao dos mesmos quando estes no so desejveis, como o caso das salas de preparo
de injetveis nas indstrias farmacuticas.
Como exemplo de quantificao microbiana na industria tm-se a Portaria n 518/04, que

estabelece que a quantidade de bactrias heterotrficas presentes na gua no pode ultrapassar
500 UFC/ml seno h a necessidade de reteste,inspeo da fonte ou outras providncias cabveis.
Uma situao oposta, ao se considerar alimentos com atividade prbitica, a contagem mnima
deve ser de 108 a 10 9 UFC na dose diria recomendada ou a empresa deve comprovar a eficcia
do produto como probitico.
O crescimento dos micro-organismos pode ser mensurado por diferentes tcnicas, tais
como pelo acompanhamento da variao no nmero ou peso de clulas, por exemplo. A escolha
do mtodo funo do Micro-organismo e das caractersticas do meio de fermentao (cor,
slidos presentes, etc.).
No existe um mtodo absoluto para a quantificao microbiana ou determinao da
viabilidade celular de uma populao de clulas. Para estimar a proporo de clulas viveis em
uma cultura ou processo fermentativo, mtodos baseados no plaqueamento ou observao
microscpica tm sido utilizados. Os mtodos de contagem direta so rpidos e simples,
exigindo um mnimo de equipamento, permitindo que seja observada, simultaneamente, a
morfologia celular.
Outros mtodos amplamente empregados so densidade tica (ou absorbncia), peso seco
de clulas, volume de centrifugado, nmero mais provvel, dentre outros. Alguns destes mtodos
sero vistos na prtica 1.

Referncias:
Brasil, Portaria n 518, de 25 de maro de 2004. Estabelece os procedimentos e

responsabilidades relativos ao controle e vigilncia da qualidade da gua para consumo
humano e seu padro de potabilidade, e d outras providncias. D.O.U. - Dirio Oficial da
Unio; Poder Executivo, de 26 de maro de 2004. Disponvel online em: <http://e-
legis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=22322&word=>. Acesso em: 31/07/2008.
FDA, Bacteriological Analytical Methods, 2001. Disponvel online em:
<http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html>. Ultimo acesso em: 29/07/2008.

2.1 Roteiro da Prtica 1 Quantificao de Micro-organismos
Material Equipamentos Reagentes

1 balo volumtrico de 100 mL estufa Fermento
6 bales volumtricos de 250 mL espectrofotmetro UV-Visvel Biolgico
2 bales volumtricos de 1000 mL centrfuga gua
1 Becher de 100 mL balana
1 Basto de vidro dessecador
1 tubo de centrfuga cmara de Neubauer
pipetas volumtricas de 2, 3, 5, 10 e 15 mL microscpio
1 pesa-filtro
Objetivo: Determinar a concentrao de clulas de levedura em uma suspenso, usando 4

diferentes tcnicas de quantificao.
2.1.1. Preparo da Suspenso de Clulas
Pesar cerca de 1 g de fermento biolgico em um becher de 100 mL

Dissolver em gua destilada e diluir em balo volumtrico de 100 mL
2.1.2 Determinao do peso seco de clulas (%p/v)
Pipetar 10 mL da suspenso de clulas recm preparada, previamente agitada e

transferir para pesa-filtro de tara conhecida.
Secar em estufa entre 100 e 120C at peso constante.
Determinar, por diferena de massa, o peso seco de clulas e expressar o resultado em
termos de massa seca de clulas (g) / 100 mL de suspenso.
2.1.3. Turbidimetria
Diluir alquotas de 2, 3 e 5 mL da suspenso de clulas em bales volumtricos de 250

mL e alquota de 15 mL em balo volumtrico de 1.000 mL (fazer em duplicata).
Ler a absorbncia das suspenses diludas em espectrofotmetro (=570 nm), usando
gua destilada como branco.

2.1.4. Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER
Diluir a suspenso 50 vezes.

Gotejar a suspenso diluda em cmara de NEUBAUER e cobrir com a lamnula.
Efetuar a contagem de 5 dos 25 quadrados da cmara (Figura 2.1). Expressar o
resultado em termos do nmero de clulas / mL da suspenso original, com base no
seguinte clculo:
( 5 quadrados) x (5x10 4) x diluio
Figura 2. 1: Cmara de Neubauer. A. O crculo indica a rea aproximada coberta pelo aumento de 100 vezes
ao microscpio (10X ocular e 10X objetiva) de uma cmara de contagem padro. B. Aspecto de um quadrado
integrante do quadrado mdio, mostrando que devem ser contadas as clulas que tocam as linhas do topo e
da esquerda do quadrado, desprezando aquelas que tocam a linha de baixo e da direita do quadrado.

2.1.5. Determinao do volume do centrifugado (% v/v)
Pipetar 10 mL da suspenso de clulas recm preparada, previamente agitada e

transferir para tubo de centrfuga graduado.
Centrifugar por 15 minutos. Anotar o volume de clulas.
Expressar o resultado em termos de volume de clulas / 100 mL da suspenso.
2.1.6. Estudo Dirigido
1) Pesquisar outras metodologias para quantificao de micro-organismos e para controle de

qualidade.
2) Quais as possveis fontes de erro das tcnicas utilizadas nesta prtica?
3) Discutir a aplicabilidade de cada tcnica utilizada nesta prtica.

2.1.7. Relatrio da Prtica 1
Componentes do Grupo:
1) Preencher os espaos abaixo, efetuando os clculos necessrios:
- Determinao do volume do - Determinao do peso seco de clulas (%p/v)

centrifugado (% v/v) volume da suspenso: __________
volume da suspenso: __________ tara do pesa-filtro: __________
volume de clulas: __________ pesa-filtro + clulas secas: __________
% v/v: __________ peso das clulas secas: __________
Peso seco (g/100 mL): __________
- Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER

Contagem quadrados: A = _____ , B = _____, C = _____, D = _____, E = _____
5 quadrados (A+B+C+D+E) = _______
[clulas] da suspenso diluda 50 vezes = ( 5 quadrados) x (5x104) x (diluio)
[clulas] da suspenso original = _______ (n clulas / mL)
- Turbidimetria
Diluio Vol. Susp. Vol. balo ABS ABS mdia N clulas Peso seco
(mL) (mL) 570nm clulas/mL (g/100 mL)
2) Construir os seguintes grficos, determinando a reta de calibrao e o fator da curva:

Absorbncia 570 nm x peso seco das suspenses diludas
Absorbncia 570 nm x n clulas/mL das suspenses diludas

3. DOSAGEM DE ACARES
Os carboidratos, ou acares, com frmula emprica (CH2O)n so um dos maiores grupos
de compostos orgnicos conhecidos na natureza, e juntamente com as protenas formam os
principais constituintes dos organismos vivos. Os carboidratos simples mais abundantes so as
pentoses e hexoses. Os acares possuem um ou mais tomos assimtricos de carbono, portanto
podem existir na forma de estereoismeros.
Os carboidratos tm diversas classificaes, de acordo com seu tamanho, com o grupo

funcional que derivado, entre outras. As classificaes podem ser: monossacardeos,
oligossacardeos e polissacardeos.
Os monossacardios so carboidratos simples que no podem ser hidrolisados a acares

de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdedos) e cetoses
(poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o
nmero de carbonos na cadeia.
Os oligossacardios so polmeros compostos de resduos de monossacrdios unidos por

ligaes hemiacetlicas, neste caso denominadas ligaes glicosdicas, em nmero que variam de
duas, at, aproximadamente, dez unidades. So compostos importantes na determinao de
estruturas de polissacardios.
Na indstria existem diversas reaes tanto de degradao como de formao de aucares

que so determinantes no controle de qualidade dos produtos produzidos.
Um acar redutor um acar no qual o carbono da carbonila no est envolvido em

uma ligao glicosdica e, portanto, pode sofrer oxidao.
Os monossacardeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais
como os ons frrico e cprico. O carbono do grupo carbonila oxidado a cido carboxlico.
Todos os monossacardeos so potencialmente redutores, devido a presena da carbonila. Outros
carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores.

3.1 Mtodo do DNS (3,5 dinitro salicilato)
Um dos mtodos empregados na quantificao de acares redutores o mtodo do DNS.

um mtodo rpido e prtico na determinao de acares redutores, e tem grande
aplicabilidade industrial. Como exemplo de aplicao temos: controle de qualidade na
caracterizao das matrias primas para fins de processamento, e verificao se determinado
produto est dentro dos parmetros e padres exigidos pela legislao; indstria aucareira, no
acompanhamento do processo de fermentao, que permite verificar as taxas de consumo de
acar pelo micro-organismo.
A determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS baseia-se na reduo, em

meio alcalino, do 3.5-dinitrosalicilato (colorao amarela). O produto formado estvel, com
colorao laranja-avermelhado (3-amino 5-nitro salicilato) na proporo estequiomtrica e
mxima absoro da luz visvel no comprimento de onda de 535 nm. Neste mtodo ocorre a
seguinte reao de oxidao (Figura 3.1):
Figura 3. 1: Reao de oxidao da carbonila pelo reagente DNS.
Para se aplicar o mtodo necessrio se fazer inicialmente uma curva-padro do acar

que se deseja quantificar, como ser realizado na prtica 2 deste manual.
Referncias:
MILLER, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar,
Anal. Chem., n. 31, p.426, 1959.
WANG, Nam Sun. Glucose assay by dinitrosalicylic colorimetric method. Disponvel em:
http://terpconnect.umd.edu/~nsw/ench485/lab4a.htm. Acesso em: 10 ago 2011.

3.2 Roteiro da Prtica 2 - Curva Padro do Mtodo DNS

1 balo volumtrico de 100 mL espectrofotmetro UV-Vis Glicose
1 Becher de 50 e de 100 mL balana Reagente DNS
1 Basto de vidro termmetro
Buretas de 10 e 50 mL banho-maria
7 tubos de ensaio com tampa de rosca
Pipeta volumtrica de 1 mL
Objetivo: Construir uma curva padro para determinao de acares redutores pelo mtodo do
DNS, empregando a glicose como padro.
Sensibilidade do mtodo: 1-20 mols glicose
3.2.1. Preparo da Soluo Padro de Glicose: 5 mols/mL
Pesar, em um becher de 100 mL, 90 mg glicose. Anotar a massa para realizar os

clculos.
Solubilizar com gua destilada e transferir para balo volumtrico de 100 mL.
Avolumar o balo.
3.2.2. Construo da Curva Padro
Em tubos de ensaio com tampa, e com auxlio da bureta de 10 mL, preparar os

seguintes pontos da curva, em duplicata com exceo do branco:
gua destilada Soluo Padro
(mL) (mL)
branco 1,0 -
1 0,8 0,2 mL
2 0,6 0,4 mL
3 0,4 0,6 mL
4 0,2 0,8 mL
5 - 1,0 mL
Adicionar 1 mL de DNS em cada tubo. Agitar e aquecer 100C em banho-Maria

durante 5 min.
Resfriar e acrescentar 13 mL de gua destilada em cada tubo, com auxlio da bureta de
50 mL. Tampar os tubos e homogeneizar (volume final = 15 mL).

Proceder a leitura da absorbncia em espectrofotmetro em: = 540 nm.
3.2.3. Estudo Dirigido
1) Pesquisar outras metodologias para quantificao de acares.

2) Ler o artigo Comparao de Mtodos para Determinao de Acares Redutores e
Totais em Mel, disponvel na pasta da Disciplina de Processos Bioqumicos ou no link
http://www.scielo.br/pdf/cta/v23n3/18834.pdf
3) Quais as possveis fontes de erro na prtica em questo?

1) Preencher os espaos abaixo, efetuando os clculos necessrios:
Tubo ABS (540 nm) ABS mdia [glicose] (g/mL)

1
2) Construir a curva padro de glicose: Abs x [glicose] g/mL, determinando o coeficiente

angular e o fator da reta obtida.

4. ACCARES REDUTORES (AR) E ACARES REDUTORES

TOTAIS (ART)
A qualidade da cana-de-acar era determinada exclusivamente pela sacarose aparente
(POL). Atualmente, englobam-se caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas dessa
matria-prima, que podem afetar, significativamente, a recuperao deste acar na fbrica e a
qualidade do produto final.
Dois tipos de fatores afetam a qualidade da matria-prima destinada indstria:
fatores intrnsecos: relacionados composio da cana (teores de sacarose, acares

redutores, fibras, compostos fenlicos, amido, cido acontico e minerais), sendo estes
afetados de acordo com a variedade da cana, variaes de clima (temperatura, umidade
relativa do ar, chuva), solo e tratos culturais;
fatores extrnsecos: relacionados a materiais estranhos ao colmo (terra, pedra, restos de

cultura, plantas invasoras) ou compostos produzidos por microrganismos devido sua
ao sobre os acares do colmo.
Desta forma, existem indicadores que permitem avaliar tanto a riqueza da cana como a
qualidade da mesma para a recuperao dos acares. A Figura 4.1 ilustra a coleta de amostras
de cana para avaliao da sua qualidade. A Tabela 4.1 apresenta os principais indicadores da
qualidade da cana.
Figura 4. 1: Coleta de amostras de cana no caminho na entrada da empresa.

Fonte: http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-de-cucar/arvore/
CONTAG01_138_22122006154842.html

Tabela 4. 1: Indicadores da qualidade e valores recomendados para a cana-de-acar.
Fonte: Ripoli e Ripoli (2004).
Abaixo, seguem as definies de alguns destes indicadores:
POL: teor de sacarose aparente na cana. Para a indstria canavieira, quanto mais elevados os
teores de sacarose, melhor.
Pureza: determinada pela relao POL/Brix x 100. Quanto maior a pureza da cana, melhor a
qualidade da matria-prima para se recuperar acar. Todas as substncias que apresentam
atividade ptica podem interferir na POL, como acares redutores (glicose e frutose),
polissacardeos e algumas protenas.
ATR ou ART (Acares Redutores Totais): indicador que representa a quantidade total de
acares da cana (sacarose, glicose e frutose). O ART determinado pela relao POL/0,95 mais
o teor de acares redutores. A concentrao de acares na cana varia, em geral, dentro da faixa
de 13 a 17,5%. Entretanto, importante lembrar que canas muito ricas e com baixa percentagem
de fibras esto mais sujeitas a danos fsicos e ataque de pragas e microrganismos. Os estudos
mostram que nas primeiras 14 horas de deteriorao da cana, 93% das perdas de sacarose foram

devidas ao de microrganismos, 5,7% por reaes enzimticas e 1,3% por reaes qumicas,
resultantes da acidez.
Acares redutores: a quantidade de glicose e de frutose presentes na cana, que afetam

diretamente a sua pureza, j que refletem em uma menor eficincia na recuperao da sacarose
pela fbrica.
A determinao de acares redutores pode ser realizada pelo mtodo de DNS,

utilizando-se como padro a glicose. Na determinao de acares redutores totais, promove-se
preliminarmente a hidrlise da sacarose com cido clordrico quente, como ser realizado na
prtica 3.
Referncias:
RIPOLI, T. C. C.; RIPOLI, M. L. C. Biomassa de cana-de-acar: colheita, energia e
ambiente. Piracicaba: Barros & Marques Ed. Eletrnica, 2004. 302 p.
VIAN, Carlos Eduardo Freitas. Qualidade de matria-prima. Disponvel em:

http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-de-
acucar/arvore/CONTAG01_138_22122006154842.html. Acesso em: 10 Jul 2011.

4.1 Roteiro da Prtica 3 - Determinao de Acares Redutores (AR) e
Acares Redutores Totais (ART)
balo volumtrico de 500 mL espectrofotmetro UV- 100 mL de Caldo de cana
6 bales volumtricos de 100 mL Vis HCl 1:1
pipetas volumtricas de 1, 2, 5, 10, 25 e banho-maria NaOH 0,1 mol/L
50 mL termmetro Reagente DNS
provetas de 25 e 100 mL Padro de glicose (aula
8 tubos de ensaio com tampa de rosca anterior)
Buretas de 10 e 50 mL
Becher de 100 mL
Objetivo: Determinar a concentrao de sacarose, glicose e frutose presentes no caldo de cana.
4.1.1. Determinao de Acares Redutores (AR)
Diluir 1, 5 e 10 mL de caldo de cana in natura, ou melao, em bales volumtricos de

100 mL.
Pipetar 1 mL do caldo de cana, ou melao, diludo e transferir para tubo de ensaio com
tampa, devidamente identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.
4.1.2. Determinao de Acares Redutores Totais (ART)
Diluir 50,00 mL de caldo de cana in natura, ou melao, em balo volumtrico de 500

mL.
Adicionar a seguir 70 mL de gua destilada. Inserir um termmetro no balo e levar o
conjunto para banho-maria (~70C)
Quando a temperatura da soluo atingir 65C, retirar o balo do banho-maria e
adicionar imediatamente 25 mL de HCl 1:1. Homogenizar e deixar em repouso,
temperatura ambiente, por 30 minutos.
Aps este tempo, avolumar o balo at volume final.
Transferir 2, 10 e 25 mL do hidrolisado diludo para bales volumtricos de 100 mL.
Adicionar NaOH 0,1 mol/L at completar o volume do balo.
Pipetar 1 mL de cada soluo acima para tubo de ensaio com tampa, devidamente
identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.

4.1.3. Dosagem de acares pelo mtodo do DNS
Preparar um padro de glicose, como na prtica anterior, para ler a absorbncia junto
com as amostras.
Proceder a dosagem de acares redutores (amostras do item 4.1) e redutores totais
(amostras do item 4.2) pelo mtodo do DNS: adicionar 1 mL de DNS s amostras j
colocadas nos tubos e levar ao banho-maria por 5 min. Deixar esfriar e completar com
13 mL de gua destilada.
Preparar amostra em branco (1 mL de gua + 1 mL de DNS).
Proceder a leitura da absorbncia em espectrofotmetro em: = 540 nm.
Se a absorbncia da amostra estiver fora da curva de calibrao, repetir o procedimento
variando a diluio do hidrolisado.

4.1.4 Relatrio da Prtica 3
1) Dados obtidos na Prtica:

Diluio (AR) ABS (AR) Diliuo (ART) ABS (ART)
Concentrao do Padro de Glicose (g/mL) = _____

ABS do padro de glicose = _____
2) Calcular o teor de sacarose e de acares redutores no caldo de cana (g/100mL) usando

as seguintes equaes:
% AR = (C x B x F x 10-4) / P ________ (g/100 mL)
-4
% ART = (A x B x F x 10 ) / P ________ (g/100 mL)
% sacarose = [%ART - %AR] x 0,95 ________ (g/100 mL)
onde:
A = absorbncia da amostra processada conforme item 2.
B = concentrao do padro de glicose em g/mL (ponto da curva de calibrao)
C = absorbncia da amostra processada conforme item 1.
P = absorbncia do padro de glicose (ponto da curva de calibrao)
F = fator de diluio

5. Grau Brix
Uma das variveis agroindustriais mais facilmente determinadas em laboratrio ou

mesmo em campo, o Brix. Quando se trata de cana madura existe estreita relao entre essa
porcentagem e o contedo de sacarose na soluo. A cana considerada madura com Brix mnimo
de 18 entre outros fatores. Por consenso, admite-se o Brix como sendo a porcentagem de slidos
solveis contidos em uma soluo aucarada, ou seja:
1 BRIX corresponde a 1 g de slidos dissolvidos em 100 g de soluo 20C
Sendo a sacarose um dos slidos do caldo (80-90%), o aumento do seu contedo acaba
por resultar em aumento do Brix do caldo. Portanto, em solues com alto teor de acares,
como por exemplo o melao, o valor do Brix uma medida aproximada do teor de acares
presentes no meio.
A medida do Brix pode ser feita atravs de refratmetro ou pelo Sacarmetro de Brix, que
que ser utilizado na prtica 4. A escala do Sacarmetro de Brix varia de 0 a 90 Brix com
divises de 0,1 / 0,2 / 0,5 e 1 Brix.
Referncias:
DOUMER, M. E.; MARTINS, G. A.; MOREIRA, A. da S.; SILVA, S. D. dos A..

Avaliao de graus brix de cana-de-acar (Saccharum spp.) da parte inferior e
superior de colmos. Disponvel em:
http://www.ucpel.tche.br/cic/cdcic2009/pdfs/1464.pdf Acessado em: mai 2011.
INCOTERM. Instrues de Uso do sacarmetro de Brix. Disponvel em:

http://www.incoterm.com.br/download_anexo/5733_MANUAL.pdf. Acesso em mai
2011.

5.1 Roteiro da Prtica 4 - Determinao do BRIX

proveta de 500 mL sacarmetro de Brix 500 mL de Caldo de cana
termmetro
Objetivo: Determinar o teor de slidos dissolvidos em uma soluo, atravs da medida da

densidade utilizando o sacarmetro de BRIX.
5.1.1. Procedimento
Transferir o caldo de cana ou melao para a proveta de 500 mL

Mergulhar o sacarmetro de BRIX cuidadosamente, de modo a no umedecer a haste
acima do lquido. Deixar o instrumento flutuar livremente e no deixar tocar nas
paredes ou no fundo da proveta. Aguardar 5 minutos.
Proceder a leitura olhando em nvel com a superfcie da soluo, anotando o valor do
BRIX.
Verificar a temperatura da soluo.
Efetuar as correes, utilizando a tabela 5.1. A correo aditiva quando a temperatura
da soluo for maior do que a temperatura padro (20C) e subtrativa quando a
temperatura da soluo for menor do que a temperatura padro.

Leitura no sacarmetro (BRIX): _____ B temperatura padro 20C

Temperatura da soluo: _____C
Fator de correo: ______
BRIX = leitura no sacarmetro +/- fator de correo: ______ B
Tabela 5. 1: Tabela de Correo para Grau Brix

5. Cintica do Crescimento Microbiano

Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do nmero de clulas e
no ao aumento das dimenses celulares. Quando se estuda a cintica de crescimento a escolha
da tcnica de quantificao microbiana um parmetro importante, pois dela depende os
clculos que sero realizados. importante tambm se determinar a taxa de crescimento
microbiano e o tempo de gerao do micro-organismo em estudo, nas condies de processo
utilizadas.
A Taxa de crescimento (velocidade especfica de crescimento) a variao no nmero
ou massa de microrganismos por unidade de tempo.
Define-se Tempo de gerao como o intervalo de tempo necessrio para que uma clula
se duplique. O tempo de gerao varivel para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a
20 minutos at dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas.
O tempo de gerao no corresponde a um parmetro absoluto, uma vez que dependente de
fatores genticos e nutricionais, indicando o estado fisiolgico da cultura.
O conhecimento da cintica de um processo ou da cintica de crescimento microbiano
importante industrialmente, pois permite a anlise de perigos e pontos crticos do processo
(APPCC); previso de eventos fora do processo; determinao de vida-de-prateleira; anlise de
Risco.
Na Figura 5.1 mostrada uma curva tpica de crescimento microbiano. O crescimento
microbiano pode apresentar quatro fases distintas, a saber:
Fase Lag ou de Adaptao - fase de adaptao metablica ao novo ambiente, onde
ocorre rearranjo do sistema enzimtico (sntese de enzimas), traumas fsicos (choque
trmico, radiao, entre outros) e traumas qumicos (produtos txicos, meio de cultura).
O nmero de indivduos no aumenta nesta fase, podendo at mesmo decrescer. A
durao dessa fase depende das condies ambientais nas quais as clulas se encontravam
anteriormente.
Fase Log ou Exponencial - Nesta etapa, as clulas esto plenamente adaptadas,
absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Fase
na qual o nmero de clulas da populao dobra a cada gerao. A taxa de
crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo em

questo. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Esta taxa de
crescimento no pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Aps um
determinado perodo de crescimento exponencial, as condies ambientais tornam-se
desfavorveis pela escassez de nutrientes essenciais, acmulo de metablitos txicos e
limitao de espao. A taxa de crescimento da populao diminui e segue-se a fase
estacionria.
Fase Estacionria - Fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente
devido s condies limitantes do meio. As clulas continuam metabolizando e se
dividindo, mas parte das clulas torna-se invivel e a taxa de diviso celular muito
prxima da taxa de morte celular, o que mantm constante o nmero de clulas viveis
na populao. A curva de crescimento atinge um plat. A durao da fase estacionria
depende do balano entre a taxa de diviso celular e o nmero de clulas que vo se
tornando inviveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido s condies
ambientais tornarem-se progressivamente desfavorveis. na fase estacionria que so
sintetizados vrios metablitos secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas.
Nesta etapa ocorre tambm a esporulao das bactrias.
Fase de Declnio ou de Morte - Fase de declnio exponencial do nmero de clulas
viveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de diviso. O nmero de clulas
viveis entra em declnio progressivo at a completa extino da populao.
Figura 5. 1: Curva caracterstica do crescimento celular de um micro-organismo

Leitura Complementar:
STREMEL, D. S., VIDAURRE, T.C., SILVA, F.S., KELLER, L.E. Estudo da cintica
de crescimento microbiano do Bacillus subtilis em meio alternativo na produo de
Biocontrolador de fungos fitopatognicos. XVIII Congresso Regional De Iniciao
Cientfica e Tecnolgica.

5.1 Roteiro da Prtica 5 - Cintica do Crescimento de Clulas de

Leveduras

pipetas volumtricas de 1, 2, 3, 5 mL espectrofotmetro UV-Vis fermento biolgico
pipetas graduadas de 5, 10 e 25 mL agitador tipo shaker extrato de lvedo
proveta de 100 mL balana glicose
5 Becher de 50 ou 100 mL KH2PO 4
8 tubos com tampa de rosca (NH2)2SO4
1 Erlenmeyer de 250 mL
Basto de vidro
Objetivo: Determinar a taxa especfica de crescimento de clulas de levedura em meio sinttico

(YED 2%).
5.1.1. Preparo da soluo de YED 2% e inoculao das clulas
Preparar a soluo de YED em erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lvedo, 2 g de

glicose, 0,2 g de KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de gua destilada
e solubilizar todos os reagentes.
Pesar entre 90 e 100 mg de fermento biolgico. Anotar a massa.
Inocular o meio sinttico transferindo o fermento para a soluo de YED 2%, com o
auxlio da prpria soluo.
Colocar o erlenmeyer em agitador tipo shaker e iniciar agitao contnua.
5.1.2. Determinao da concentrao de biomassa (X)
Aps inocular as clulas, retirar uma alquota de 3 mL.

Transferir um pouco da amostra para a cubeta e proceder a determinao de biomassa
em 570 nm, utilizando a curva de quantificao de micro-organismos.
Se a absorbncia for maior do que o ltimo ponto da curva, proceder diluio da
mesma.
Repetir o procedimento, retirando alquotas a intervalos de 30 min, aumentando a
diluio, se necessrio.

5.1.3. Relatrio DA Prtica 5
1) Determinao da concentrao de biomassa (X)

Tempo Absorbncia diluio [biomassa]
(h) (570 nm) (g/ mL)
0
1
2
3
4
2) Construir a curva de crescimento: (i) [biomassa] x tempo, (ii) Ln [biomassa] x tempo.
3) Determinar a taxa especfica de crescimento (X) das clulas de levedura em meio YED.

6. Produo de Etanol
O lcool (etanol) pode ser obtido de diversas formas de biomassa, sendo a canade-acar
a realidade econmica atual. Investimentos portentosos esto sendo efetuados para viabilizar a
produo de lcool a partir de celulose, sendo estimado que, em 2020, cerca de 30 bilhes de
litros de lcool poderiam ser obtidos desta fonte, apenas nos EUA. O benefcio ambiental
associado ao uso de lcool enorme, pois cerca de 2,3 t de CO2 deixam de ser emitidas para cada
tonelada de lcool combustvel utilizado, sem considerar outras emisses, como o SO2.
A cana-de-acar a segunda maior fonte de energia renovvel do Brasil com 12,6% de
participao na matriz energtica atual, considerando-se o lcool combustvel e a co-gerao de
eletricidade, a partir do bagao. Dos 6 milhes de hectares, cerca de 85% da cana-de-acar
produzida no Brasil est na Regio Centro-Sul (concentrada em So Paulo, com 60% da
produo) e os 15% restantes na regio Norte-Nordeste.
Na safra 2004, das cerca de 380 milhes de toneladas modas, aproximadamente 48%
foram destinadas produo de etanol. O bagao remanescente da moagem queimado nas
caldeiras das usinas, tornando-as auto-suficientes em energia e, em muitos casos, superavitrias
em energia eltrica que pode ser comercializada. No total foram produzidos 15,2 bilhes de litros
de etanol e uma gerao de energia eltrica superior a 4 GWh durante a safra, o que representa
aproximadamente 3% da nossa gerao anual.
O etanol um produto da fermentao do acar, mais freqente entre os micro-
organismos. As principais produtoras de lcool so as leveduras principalmente linhagens de
Saccharomyces cerevisae. As leveduras so, como na maioria dos fungos, organismos aerbicos.
No entanto, sob condies de anaerobiose fermentam carboidratos etano e gs carbnico.
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2
A fermentao da glicose etanol e gs carbnico pela levedura Saccharomyces
cerevisae segue o caminho da frutose bifosfato. A transformao de piruvato etanol resume-se
em duas etapas. Primeiro, o piruvato descarboxilado a acetaldedo sob ao da piruvato-
descarboxilase (e cooperao da tiaminopirofosfato). O acetaldedo , em seguida, reduzido a
etanol pela lcool-desidrogenase com NADH2.
Referncias:
http://www.biodieselbr.com/energia/alcool/etanol.htm
6.1 Roteiro da Prtica 6 - Produo de Etanol em caldo de cana-de-

acar

2 Erlenmeyer de 500 mL balana 350 mL de Caldo de cana
Proveta de 200 mL 60 g de fermento biolgico
2 Becher de 50 mL NaF
Becher de 100 mL
Basto de vidro
Fermentmetro
Objetivo: Produzir etanol utilizando caldo de cana como matria prima e observar as fases da
fermentao alcolica.
6.1.1. Fermentao
Pesar cerca de 25 g de fermento biolgico em becher.

Transferir 150 mL de caldo de cana para o erlenmeyer de 500 mL.
Acrescentar o fermento biolgico previamente pesado e adaptar o fermentmetro.
Anotar a massa total do conjunto (m).
Deixar que a fermentao se processe, pesando e anotando a massa do conjunto a cada
30 min.
6.1.2. Inibio da fermentao por NaF (inibidor da enolase)
Repetir o procedimento do item 6.1, acrescentando-se ao caldo de cana 0,315 g de NaF.

1) Para os procedimentos 6.1 e 6.2, responda:

a) Qual a quantidade de gs carbnico produzido?
b) Qual a quantidade de etanol produzido?
c) Qual a quantidade de glicose consumida?
2) Calcule o grau de inibio provocado pelo NaF.
3) Calcule o rendimento e a eficincia da fermentao. Dado: rendimento terico = 0,511
4) Construa o grfico SCO2 x t, Setanol x t.
5) Pesquise a funo da enzima enolase.

6.2 Roteiro da Prtica 7 - Produo de Etanol em YED a 2%

Parte 1: Parte 1: Parte 1:
Erlenmeyer de 250 mL Balana 60 g de fermento
Provetas de 50 e 100 mL Espectrofotmetro biolgico
Pipeta volumtrica de 1 mL Destilador Glicose
2 Becher de 50 e 100 mL centrfuga Padro de glicose de
10 tubos com tampa de rosca 10 mol/mL
3 tubos de centrfuga DNS
4 bales volumtricos de 250 mL Extrato de lvedo
2 bales volumtricos de 100 mL KH2PO4
Basto de vidro (NH4)2SO4
Pipeta graduada de 5 mL NaOH 0,1 N
Bureta de 25 mL
Parte 2:
Parte 2: Padro de dicromato de
Pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL potssio
3 Erlenmeyer com tampa de borracha H2SO4 concentrado
Proveta de 200 ou 250 mL H3PO4 85 %
Proveta de 25 mL ou pipeta graduada de Indicador
20 mL Sulfato ferroso amoniacal
Bureta de 25 mL
Objetivo: Calcular a eficincia de uma fermentao de glicose por clulas de leveduras atravs
da medida da produo de etanol e do consumo de glicose.
6.2.1. Preparo da soluo de YED 2%
Colocar em um erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lvedo, 2 g de glicose, 0,2 g de

KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de gua destilada e solubilizar todos
os reagentes.
Retirar uma alquota de 3 mL para a dosagem de acar pelo mtodo do DNS.
6.2.2. Produo de clulas e de etanol e consumo de glicose
Inocular o erlenmeyer de 250 ml, contendo YED com 20 % (pu/v) de clulas. Agitar e
imediatamente retirar uma alquota de 1,0 ml (tempo 0) e verter para balo volumtrico
de 250 mL, completando com gua destilada. Fazer a leitura da ABS a 570 nm (dosagem
de clulas).
Manter o mosto inoculado agitando periodicamente por 1 h.

Aps 1 h de fermentao, retirar alquota de 3 ml para determinao da concentrao
celular. Diluir a amostra 1:250 e ler a ABS a 570 nm.
Centrifugar cerca de 30 ml do meio fermentado. Recolher o sobrenadante (tempo 1 h).
Do sobrenadante, guardar 5 ml para determinao do teor de acar e colocar 10 ml no
compartimento do destilador.
No destilador, adicionar em seguida 10 ml de H2O e 0,5 ml de NaOH 0,1 N. Fechar o
sistema e recolher os 8 ml iniciais do destilado. Completar este volume a 10 ml com
exatido. Congelar a amostra para posterior determinao do teor de etanol pelo mtodo
do dicromato.
Diluir 100 vezes uma alquota dos sobrenadantes (tempos 0 e 1 h) e determinar a
quantidade de glicose pelo mtodo do DNS.
6.2.3. Determinao do lcool pelo mtodo do dicromato
Colocar 10 ml de soluo de dicromato em 3 frascos cnicos e adicionar, em seguida,

5 ml de H2SO4 concentrado, resfriando-se em gua da torneira.
Colocar em cada frasco 5,0, 2,5 e 1,0 ml do destilado e completar o volume a 5,0 ml de
gua, quando for o caso.
Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 min para o etanol ser quantitativamente levado
a cido actico.
Aps 15 min, adicionar 165 ml de gua destilada, 18 ml de cido fosfrico e 0,5 ml de
indicador.
Titular com sulfato ferroso amoniacal at a cor da soluo mudar de prpura para verde e
anotar o volume consumido (n).
Para o ensaio em branco adicionar 5 ml de gua destilada no lugar da amostra e repetir o
procedimento. Anotar o volume consumido (N).
Clculos:
Alquota de 5 ml do destilado A = 2 (1 n/N)

Alquota de 2,5 ml do destilado A = 4 (1 n/N)
Alquota de 5 ml do destilado A = 10 (1 n/N)
Onde A = concentrao de etanol na amostra original (%)

1) Calcular as concentraes de glicose e de clulas para os tempos 0 e 1 h.
2) Calcular a massa de etanol formado.
3) Calcular o rendimento e a eficincia da fermentao a partir dos resultados.

7. Acidez de vinhos
Sabe-se que a acidez dos vinhos se deve a presena de cidos como o tartrico, mlico e
ctrico, entre os mais importantes. Estes cidos garantem a conservao do vinho bem como
outras caractersticas de suma importncia. O grau de acidez est tambm relacionado com a
acidez total titulvel, o pH, a quantidade de cidos dissociados e no dissociados, e a quantidade
relativa de cada um dos cidos presentes.
Dentro dos padres comerciais, a acidez do sumo fica no intervalo de 0,6 a 0,9 %
(expresso como a quantidade de cido tartrico por 100ml de sumo ou vinho). Os vinhos doces
tm acidez no intervalo de 0,4 a 0,65%. Na fabricao do vinho importante saber a acidez
titulvel do mostro para poder determinar a quantidade correta de dixido de enxofre que ser
adicionada e tambm decidir se ou no necessria uma correo da acidez.
A acidez titulvel do vinho normalmente expressa em cido tartrico % (m/v); massa

molar do C2H4O2(COOH)2 = 150,09g/mol. Lembrar que o cido tartrico tem dois hidrognios
titulveis ate a viragem da fenolftalena.
cido tartrico ( g/100mL) = (Vb).(C NaOH).( 150,09).(100)

(1000).2.(Vam)
onde:
Vb o volume, em mL, da soluo de NaOH usada na titulao.
C NaOH a concentrao da soluo de NaOH, em mol/L.
Vam o volume, em mL, da amostra titulada.
Esta determinao est sujeita interferncia do CO2 dissolvido. Este erro pode ser
minimizado diluindo o vinho com gua quente, prximo da fervura, e depois deixando esfriar at
a temperatura ambiente antes de titular. Geralmente esse erro pequeno.

7.1. Roteiro da Prtica 8 - Determinao da acidez total de vinhos
Material Reagentes
2 Erlenmeyers de 250 mL Vinhos branco e tinto secos

1 Becher de 100 mL gua destilada
Pipeta volumtrica de 25 mL Soluo alcolica de fenolftalena a 1%
NaOH 0,1 M
Objetivo: determinar a acidez titulvel do vinho branco e tinto. O cido tartrico expressa a
acidez titulvel do vinho. Esta expresso pode ser obtida por meio de uma equao que
determina a concentrao do cido tartrico em g/mL.
7.1.1. Procedimento
Transferir 25 mL de vinho branco seco para um erlenmeyer de 250 mL.

Adicionar 100 mL de gua deionizada e 5 gotas de soluo alcolica de fenolftalena a
1%.
Titular com uma soluo padro de NaOH 0,1M.
O ponto final indicado pela permanncia de uma leve cor rsea por mais de 30
segundos.
Repetir o procedimento acima para o vinho tinto, com o cuidado de que o ponto final
evidenciado pelo aparecimento de uma cor cinza-esverdeada.

7.1.2.Relatrio da Prtica 8
1) Calcule a acidez do vinho analisado.
2) Determine o erro da anlise, comparando o valor obtido com o contido no rtulo.
3) Compare com os valores comerciais.

8. Preparo de Solues e Indicadores

Reagente DNS
Preparar separadamente, por dissoluo quente e a agitao, as solues abaixo:
- 10g cido 3,5-dinitro saliclico em 200 mL NaOH 2 mol/L (fica uma massa pastosa)
- 300 g tartarato duplo de sdio e potssio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL gua destilada
Misturar as duas solues e completar o volume a 1000 mL com gua destilada aquecida.
Meio sinttico YED 2%

Solubilizar em gua destilada o extrato de lvedo (1%), glicose (2%), KH2PO4 (0,2%) e
(NH4)2SO4 (0,2%)
Indicador: 0,25 g de sal de brio do cido 4-difenilalanina-sulfnico dissolvido, com

leve aquecimento, em 50 ml de gua. Filtrar em papel de filtro faixa azul. Lquido
sobrenadante usado.
Soluo padro de dicromato de potssio: 8,454 g K2Cr2O7 dissolvidos em gua,

completado a 250 mL.
Soluo de sulfato ferroso amoniacal: 67,55 de FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, dissolvido em

300 mL de gua e 10 mL de H2SO4 concentrado. Filtrar em papel faixa azul para balo de
500 mL e completar o volume com gua destilada.

Apostila Pratica de Processos Bioquimico PDF

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Apostila Pratica de Processos Bioquimico PDF

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Universidade do Estado do Rio de

APOSTILA DAS AULAS PRTICAS

Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues

Tabela 1. 1: Regies do espectro em funo do comprimento de onda

A capacidade que as diversas substncias qumicas tm de absorverem luz em

Os mtodos instrumentais esto sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as

A espectrofotometria medida de absoro ou transmisso de luz uma das mais

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 2

Beer em 1852 observou a relao existente entre a transmisso e a concentrao do meio

Figura 1. 1: Esquema de Absoro da Luz

A anlise quantitativa em espectrofotometria realizada atravs da medida da

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 3

Se houver proporcionalidade entre a absorbncia e a concentrao da substncia, pode-se

Figura 1. 3: Curva de Calibrao: Absorbncia em funo da Concentrao

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 4

Pode-se trabalhar com a Absorbncia (A), como mostrado no texto, ou com a

BRACHT, A; ISHII-IWAMOTO, E. L. Mtodos de Laboratrio em Bioqumica. So

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 5

Os micro-organismos possuem a capacidade de ocupar e modificar um determinado

Como exemplo de quantificao microbiana na industria tm-se a Portaria n 518/04, que

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 6

Brasil, Portaria n 518, de 25 de maro de 2004. Estabelece os procedimentos e

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 7

2.1 Roteiro da Prtica 1 Quantificao de Micro-organismos

Material Equipamentos Reagentes

Objetivo: Determinar a concentrao de clulas de levedura em uma suspenso, usando 4

2.1.1. Preparo da Suspenso de Clulas

Pesar cerca de 1 g de fermento biolgico em um becher de 100 mL

2.1.2 Determinao do peso seco de clulas (%p/v)

Pipetar 10 mL da suspenso de clulas recm preparada, previamente agitada e

Diluir alquotas de 2, 3 e 5 mL da suspenso de clulas em bales volumtricos de 250

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 8

2.1.4. Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER

Diluir a suspenso 50 vezes.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 9

Pipetar 10 mL da suspenso de clulas recm preparada, previamente agitada e

2.1.6. Estudo Dirigido

1) Pesquisar outras metodologias para quantificao de micro-organismos e para controle de

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 10

1) Preencher os espaos abaixo, efetuando os clculos necessrios:

- Determinao do volume do - Determinao do peso seco de clulas (%p/v)

- Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER

2) Construir os seguintes grficos, determinando a reta de calibrao e o fator da curva:

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 11

Os carboidratos tm diversas classificaes, de acordo com seu tamanho, com o grupo

Os monossacardios so carboidratos simples que no podem ser hidrolisados a acares

Os oligossacardios so polmeros compostos de resduos de monossacrdios unidos por

Na indstria existem diversas reaes tanto de degradao como de formao de aucares

Um acar redutor um acar no qual o carbono da carbonila no est envolvido em

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 12

Um dos mtodos empregados na quantificao de acares redutores o mtodo do DNS.

A determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS baseia-se na reduo, em

Figura 3. 1: Reao de oxidao da carbonila pelo reagente DNS.

Para se aplicar o mtodo necessrio se fazer inicialmente uma curva-padro do acar

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 13

Material Equipamentos Reagentes

Sensibilidade do mtodo: 1-20 mols glicose

3.2.1. Preparo da Soluo Padro de Glicose: 5 mols/mL

Pesar, em um becher de 100 mL, 90 mg glicose. Anotar a massa para realizar os

3.2.2. Construo da Curva Padro

Em tubos de ensaio com tampa, e com auxlio da bureta de 10 mL, preparar os

Adicionar 1 mL de DNS em cada tubo. Agitar e aquecer 100C em banho-Maria

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 14