Coloração

Corantes já são utilizados em áreas da anatomia desde meados do século XV.

Acredita-se que Jacopo Berengario da Carpi foi um dos primeiros indivíduos a usar
corantes em estudo de tecidos, ao injetar tais substâncias na luz de vasos sanguíneos
de corpos entre 1521 e 1523. Em 1567 Antonius Mizaldus fez o primeiro relato da
coloração de tecidos através de rúbia. Daí em diante vários outros tipos de colorações
foram surgindo. Com o avanço da tecnologia e advento do microscópio óptico foi
então descoberta a possibilidade da utilização dessas substâncias para observação de
amostras teciduais extremamente finas. Em 1719, Antoni Van Leeuwenhoeck ao
colorir músculo estriado de vacas, peixes e outros animais com uma solução de
assafrão verdadeiro e observa-los em um microscópio simples foi a primeira pessoa a
utilizar essas substâncias nesse intuito.

Os cortes de tecido provenientes da microtomia são extremamente finos e

translúcidos, portanto não são visíveis em microscopia óptica. Para as estruturas
tissulares serem visualizadas de melhor forma é necessário o uso de corantes, que
podem ser vitais ou não vitais. No primeiro caso o tecido está vivo e o corante não
destrói as células ou mesmo altera seu metabolismo. Já os corantes não vitais são
usados em tecidos que foram previamente fixados, ou seja, em tecidos não mais vivos.

Para entender a coloração é preciso saber o que é um corante e como ele age
sobre os elementos teciduais. Basicamente um corante é um composto químico,
orgânico, aromático e ionizável, fundamentalmente baseado na estrutura do benzeno,
porém esses são incolores. Os ganham cor pela adição de um grupamento de átomos à
sua estrutura, o cromóforo. A coloração em sí que podemos visualizar se dá porque
suas moléculas absorvem quantidades definidas de energia eletromagnética e emitem
parte da energia em forma de luz visível. Tal fenômeno quântico é devido ao rearranjo
energético e posicional (ressonância) dos elétrons presentes na estrutura química do
cromóforo em associação com os anéis aromáticos da estrutura do corante. Os
cromóforos são átomos associados entre si, como a função cetona (C=O), o grupo
nitroso (-N=O) e o grupo nitro (-NO2), entre outros. O cromógeno é a designação dada
àunião entre o corante e o cromóforo, e quanto maior a quantidade de cromóforos
presentes em um corante maior a intensidade da cor.

Para que o cromógeno, se ligue especificadamente aos elementos tissulares é

necessária sua combinação com um grupo auxiliar chamado auxocromo. Esse
auxocromo determina a acidez ou basicidade do corante, e portanto, sua interação
com os compostos biológicos. Os corantes básicos possuem auxocromos com carga
positiva e reagem com moléculas basófilas negativas por meio de interações intra e
intermoleculares, como o núcleo celular, uma estrutura ácida; enquanto os corantes
ácidos possuem carga negativae reagem com moléculas acidófilas, como o citoplasma
e a matriz extracelular que são básicas.

Os corantes podem ser naturais, se forem derivados de plantas e rochas (como

a hematoxilina por exemplo), ou sintéticos se são derivados do benzeno (como a
eosina).

As colorações podem ser classificadas segundo a ação do corante, o tempo de

coloração e sua cromatização. Duas definições são importantes para entender tal
caracterização, o mordente e a diferenciação. O mordente é um elemento metálico, ou
íon de metal, que se liga covalentemente ao corante facilitando a ação no tecido. Este
é empregado para reforçar a ação dos corantes e torna-las mais seletivas, podendo ser
usado antes da coloração, durante (adicionado junto ao corante), ou após. Um
exemplo de corante que necessita essencialmente de mordente para sua correta
utilização é a Hematoxilina. A diferenciação se refere a remoção do excesso de um
corante no tecido, removendo seletivamente a coloração de determinadas estruturas
e melhorando assim sua visualização.

Na classificação pela ação, a coloração é dita direta quando o corante penetra

nos tecidos sem auxílio do mordente, e indireta quando quando ocorre com o auxílio.

Na classificação relacionada ao tempo, a coloração é definida como regressiva

quando se utiliza a diferenciação, caso a utilização não ocorra essa é denominada
progressiva.

Já a classificação relacionada a cromatização depende essencialmente da

quantidade de corante utilizado durante a execução da técnica. Sendo que a coloração
pode ser designada monocrômica (uma cor), bicrômica (duas cores), tricrômica (três
cores) ou policrômica (quatro ou mais cores).

Algumas considerações importantes estão no fato de determinadas estruturas

teciduais poderem ser visualizadas na mesmo cor ou muito semelhante ao tom do
corante utilizado (fenômeno conhecido como ortocromasia), e em outros casos
visualizadas com coloração diferente do corante utilizado (fenômeno conhecido como
metacromasia).

Apesar das técnicas histológicas aplicadas aos diversos tecidos serem muitas,
existe um método geral que é base para praticamente todas essas. Esse método geral
é delineado pela seguinte sequência de eventos. Inicialmente deve-se preparar a
solução corante seguindo um protocolo específico para cada tipo de corante. Um
exemplo é a coloração por Hematoxilina de Mayer, a solução corante é composta por:
1g de Hematoxilina; 1L de água; 0,2g de iodato de sódio; 50g de alúmen de amônia ou
potássio; 1g de ácido cítrico; 50g de hidrato de cloral. Após a preparação do corante,
dá-se início à desparafinização, que consiste na retirada da parafina dos cortes
realizados pela técnica de microtomia com auxílio de Xilol, um solvente orgânico. A
seguir vem a hidratação realizada por banhos em sequência de concentrações
decrescentes de álcool etílico (100%, 95%, 80% e70%) até água destilada, com intuito
de possibilitar a solubilidade do corante ao meio, uma vez que praticamente toda água
foi retirada no processo de inclusão em parafina. No caso de corantes alcoólicos deve-
se interromper a hidratação em álcool 70%. Por conseguinte, inicia-se a coloração em
si, através da imersão das amostras nas soluções colorantes. Tal amostra deve então
ser novamente desidratada, através de banhos em sequência, desta vez de
concentrações crescentes de álcool etílico (70%, 80%, 95% e 100%) com intuito de
retirar a água do tecido e possibilitar a utilização dos meios de selagem, que são
insolúveis em água. O passo seguinte é a clarificação com a utilização de xilol, um
líquido intermediário entre o álcool e o meio de selagem. A etapa final é a montagem
ou selagem das lâminas, a qual tem por finalidade cobrir a amostra já corada por uma
lamínula de vidro com uma substância específica, e possibilitar sua observação, por
tempo prolongado, em microscópio óptico.

Exemplos de corantes para a observação de determinados elementos são:

Evidencia Corantes
Tricomática de Masson, Reticulina de
Tecido conjuntivo
Gomori, Goldner
Tecido adiposo Sudan Black
Giemsa, May-Grunwald (usados na
Tecido linfoide e mieloide
prática),reticulina de Gomori
Colorações tricromáticas, azul de
Tecido muscular
toluidina
Núcleo e citoplasma HE, Fulgen, Papanicolau, Giemsa