Formulario Relatorio Parcial - IC 2018 Robson Santos v1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
RELATÓRIO PARCIAL PIBIC/PAIC 2018-2019
FORMULÁRIO PARA RELATÓRIO PARCIAL
1. Identificação do Projeto
Título do Projeto PIBIC/PAIC

Avaliação da atividade leishmanicida in vitro de Citrus aurantifolia e Citrus lemon.
Orientador
Janaína Paolucci Sales de Lima
x
Recém-Doutor
Aluno
Robson Lincon Passos dos Santos
2. Informações de Acesso ao Documento
2.1 Este documento é confidencial?

SIM NÃO
X
2.2 Este trabalho ocasionará registro de patente?
SIM NÃO
X
2.3 Este trabalho pode ser liberado para reprodução?

SIM NÃO
X
2.4 Em caso de liberação parcial, quais dados podem ser liberados?

Especifique.
 Resumo (Liberado)
 Sumário (Liberado)
 Introdução (Liberado)
 Justificativa (Liberado)
 Objetivos (geral e especifico) (Liberado)
 Revisão bibliográfica (Liberado)
 Material e métodos (Liberado)

 Resultados parciais e Discussão (Liberado)
 Referências (Liberado)
 Parecer do Comitê de Ética (se houver)
1. Introdução
A Leishmaniose é considerada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) a
segunda doença mais importante causada por protozoários. Ela ocorre nove estados no
Brasil e a região Norte apresenta um total de 34,9% dos casos. Na Amazônia brasileira
ocorrem diferentes espécies do protozoário do gênero Leishmania responsáveis pela
Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). O atual status da LTA baseados nos registros
do Ministério de Saúde e Saneamento revelou uma incidência de 10.45 a 22.9 pessoas a
cada 100,000 habitantes, indicando claramente uma expansão geográfica da doença
(COSTA, 2005; MS, 2011; TELES, 2011).
De acordo com os dados da OMS, 65 a 80% da população nos países em
desenvolvimento dependem exclusivamente das práticas tradicionais de medicamentos
provenientes de plantas medicinais (WHO, 2011). O estudo das plantas medicinais permite
o entendimento das bases racionais para o uso medicinal de algumas espécies vegetais,
desenvolvimento de fitoterápicos a baixo custo e a descoberta de novas drogas
(EMBRAPA, 1994).
Em relação à biodiversidade vegetal a Floresta Amazônica é detentora da maior
reserva de plantas medicinais do mundo, tendo em mãos a oportunidade para estabelecer
um modelo de desenvolvimento próprio e soberano na área de saúde e uso de plantas
medicinais e fitoterápicos, que prime pelo uso sustentável dos componentes da
biodiversidade. Esta Política tem como premissas o respeito aos princípios de segurança e
eficácia na saúde pública e a conciliação de desenvolvimento socioeconômico e
conservação ambiental, tanto no âmbito local como em escala nacional (DIAS, 1995;
AGRIANUAL, 2002; BRASIL, 2006).
O país apresenta um quadro epidemiológico de urgente atenção para que haja
melhoria na média da saúde pública nacional. Embora ainda escassos, os avanços nos
estudos de desenvolvimento de novos tratamentos mais efetivos e seguros contra a
leishmaniose, usando agentes terapêuticos naturais, estão sendo revisados os últimos
anos, o que garante segurança na utilização das mesmas como medicamento (CHAN-
BACAB, 2001; ROCHA et al., 2005). Devido aos efeitos adversos, a toxicidade, a
internação prolongada, e ao alto custo do tratamento atual, há necessidade da busca de
novas drogas, entre elas os fitoterápicos. Alguns estudos indicam que, se a seleção das
plantas é feita baseada no uso tradicional, as possibilidades de sucesso da pesquisa são
maiores (TROTTER et al., 1982; ELISABETSKY, WANNMACHER, 1993).
Seguindo esta vertente algumas espécies vegetais começaram a ser utilizadas
experimentalmente no desenvolvimento de pesquisas para o tratamento de leishmaniose
cutânea (PAULA et al., 2003; NAKAMURA et al., 2006; MONZOTE et al., 2007). Estudos
comprovam que todos os espécimes vegetais apresentam propriedades de resistência. O
metabolismo secundário das plantas apresenta ação biológica direta contra patógenos ou
na indução de resistência de plantas, devido características elicitoras, presente nos
princípios ativos de plantas da flora brasileira. Os óleos essenciais das plantas são
especialmente ricos em metabólitos secundários por isso são largamente utilizados na
medicina tradicional através de diferentes processos de extração (NIERO et al., 2003;
SCHWAN-ESTRADA et al., 2003). Isolados de extratos vegetais, diversos compostos
químicos têm comprovada atividade antileishmania sobre formas promastigotas e/ou
amastigotas de Leishmania em ensaios in vitro. Ainda existem muitas espécies vegetais
com potencial atividade leishmanicida que devem ser avaliadas, apesar dos diversos
estudos nessa área (BEZERRA et al., 2006).
A família Rutaceae apresenta 150 gêneros e 1.500 espécies, distribuídas em regiões
tropicais, subtropicais e temperadas do mundo, sendo mais abundante na América tropical,
Sul da África e Austrália. No Brasil, a família está representada por aproximadamente 29
gêneros e182 espécies, com algumas de importância medicinal, ecológica e econômica. os
óleos cítricos são muito versáteis e são principalmente utilizados como aromatizantes em
bebidas, sabonetes, cosméticos, produtos domésticos entre outros. Esses óleos são
também bastante usados em tratamentos médicos e são conhecidos por exibir
propriedades antimicrobianas, como antifúngica, antibacteriana, antiviral e antiparasitária
(SEVERINO et al., 2015; REHMAN et al., 2007; ESTEVAM et al., 2016).
O potencial leishmanicida de óleos essenciais tem sido bastante estudado e óleos
essenciais das espécies de Citrus, em especial, são muito versáteis pois são utilizados
para diversos fins como: aromatizante em bebibas, sabonetes, cosméticos, produtos
domésticos entre outros. Os óleos também são bastante empregados para tratamentos
médicos e já apresentaram atividades sedativas, hipnóticas, antitumoral, antibiótica,
antibacteriano, antifúngico, antitripanossoma, citotóxico, hemolítico, antioxidantes e
principalmente antileishmanicida (HAMMER et al., 1999; LIMA, 2006; REHMAN, 2007;
ARRUDA et al., 2009; MICHELETTI, BEATRIZ, 2012; YORK et al., 2012; CAMPELO,
2013; . GOMES, 2014; CARNEIRO et al., 2015; ESTEVAM, 2016).
A disponibilidade de acesso a estas espécies, aliada a potencialidade química
farmacológica da família Rutaceae levaram à investigação das espécies Citrus aurantifolia
e Citrus lemon. No presente estudo será realizada avaliação da ação leishmanicida in vitro
das espécies Citrus aurantifolia e Citrus lemon frente a formas promastigotas de L.
amazonensis, que é uma das espécies causadoras de Leishmaniose Tegumentar
Americana (LTA).
2. Justificativa
As doenças tropicais negligenciadas são um grupo de 17 doenças consideradas
infecções crônicas comuns em pessoas mais carentes, de países menos desenvolvidos. A
leishmaniose é uma doença infecciosa não contagiosa, causada por protozoários do
gênero Leishmania e que afeta mais de 12 milhões de pessoas mundialmente.
O tratamento é feito à base de antimoniais pentavalentes, anfotericina B e
pentamidinas, as quais são tóxicas, de custo elevado, difícil administração e podem gerar
resistência do parasito. (BEZERRA et al., 2006; HOTEZ et al., 2016). Muitas plantas dos
biomas brasileiros, tais como o cerrado, a floresta amazônica e a mata atlântica têm sido
utilizadas como fármacos naturais pelas populações locais no tratamento de várias
doenças tropicais, incluindo esquistossomose, leishmaniose, malária, infecções fúngicas e
bacterianas (ALVES et al., 2000; MOREIRA et al., 2002; ROCHA et al., 2005). Porém,
esses tratamentos são empíricos e pouco se sabe sobre sua real eficácia, uma vez que
pode ocorrer a cura espontânea das lesões (MARSDEN, 1994; COSTA et al., 1990).
A utilização da flora com propósito terapêutico é tão antiga quanto o aparecimento da
civilização humana, que procurava no reino vegetal alimentos, abrigos e meios para alívio e
cura de suas dores. Porém, logo após a Segunda Guerra Mundial, houve a difusão do uso
de fármacos sintéticos, o avanço dos antimicrobianos e da vacinação em massa,
ocasionando relativa perda do prestígio e da credibilidade das terapias naturais (FARIA,

1998; OLIVEIRA, AKISUE, 2000).
Os fitoterápicos, os quais são produtos adquiridos por meio do emprego de
matériasprimas ativas vegetais (ANVISA, 2014), apresentam como intuito prevenir, curar ou
reduzir sintomas de doenças, com custo no qual a população e os serviços públicos de
saúde possuam mais acesso, comparativamente a aqueles adquiridos por síntese química,
os quais são, em geral, mais caros, por causa das patentes tecnológicas incluídas
(TOLEDO et al., 2003; ARAÚJO et al., 2007).
Nesse contexto, as espécies de Rutaceae desempenham um importante papel na
medicina popular de muitos países da América Latina. Apesar do aumento do número de
estudos químicos e do potencial biológico das diferentes espécies, existem relativamente
poucos relatos de investigações biológicas sobre as espécies Citrus aurantifolia e Citrus
lemon, envolvendo a atividade leishmanicida na literatura até a presente data. Sendo
assim, os resultados a serem obtidos auxiliam as perspectivas para aprimoramento dos
estudos sobre esta planta.
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
Avaliar a atividade biológica de Citrus aurantifolia e Citrus lemon frente a formas
promastigotas de Leishmania amazonenses, visando contribuir com subsídios científicos
para o desenvolvimento de novos fármacos e/ou como fonte de matérias-primas
farmacêuticas, potencialmente eficazes, no combate à leishmaniose.
3.2. Objetivos específicos
Avaliar o efeito leishmanicida in vitro dos extratos de Citrus aurantifolia e Citrus
lemon em formas promastigotas de L. amazonenses; Identificação da concentração
inibitória do crescimento parasitário (IC50) dos extratos.
4. Revisão Bibliográfica
4.1. Leishimaniose
A leishmaniose é uma doença infecto-parasitária que atinge o homem, sendo
causadas por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania (CROFT E COOMBS,
2003). O gênero Leishmania compreende os protozoários com um ciclo de vida digenético
(heteroxênico), vivendo alternadamente em hospedeiros vertebrados e insetos vetores,

sendo os insetos responsáveis pela transmissão de um mamífero a outro.
Nos hospedeiros mamíferos, representados por várias ordens e espécies, os
parasitas representam a forma amastigora, arredondada e imóvel, que se multiplica
obrigatoriamente dentro de células do sistema monocítico fagocitário. Comporta-se,
geralmente, como uma doença profissional, ocorrendo em áreas de desmatamento para
colonização de novas terras, contrução de estradas e instalação de frentes de trabalho para
o garimpo, mineração e extração de madeira. Mas esta associação pode estar ausente.
Em Manaus, por exemplo, a expansão urbana aproximou a população dos focos
naturais da doença. Nas florestas vicinais, a zoonose, mantida principalmente pelo gambá
(Didelphis marsupialis), passou a atingir tanto adultos como crianças de ambos os
sexos(Arias, 1981). Embira com prevalência mais significativa entre os homens, dada a
maior exposição por meio de atividade de desmatamento (Costa, 1998).
4.2. Extratos vegetais
Os compostos secundários presentes em plantas medicinais, pertencem a várias
classes distintas de substâncias químicas, como alcalóides,terpenos, lignanas, flavonóides,
cumarinas, benzenóides, quinonas, xantonas, lactonas, esteróides, entre outras (DI STASI,
1996). A utilização de extrato bruto ou óleos essenciais visando à atuação destes
compostos secundários sobre micro organismos é frequentemente empregado com
sucesso.
Existem estudos que demonstram a eficiência de extratos vegetais, obtidos de
diversas espécies botânicas, como é o caso da arruda, melão de São Caetano, eucalipto
(CELOTO et al. 2008), cavalinha, hortelã (ROZWALKA et al. 2008); alho, canela (VIEGAS
et al. 2005); cravo-da-índia (AMARAL &BARA, 2005); jabuticaba (VENTUROSO et al. 2007)
e nim (Carneiro et al. 2007), na promoção da inibição do desenvolvimento de vários
patógenos. Podendo ser uma forma de utilização direta, sendo uma alternativa mais viável
economicamente e mais sustentável.
4.3. O Citrus
As frutas cítricas são dentre as espécies arbóreas as frutas mais importantes do
mundo. A produção de laranjas, tangerinas, limões e limas têm aumentado rapidamente. O
gênero Citrus é muito diversificado e é composta de numerosas espécies tais como: Citrus
sinensis (Laranja), Citrus paradisi (Toranja), Citrus deliciosa (Mandarim), Citrus lemon
(Limão) e Citrus aurantifolia (Lima) (SAÏDANI; DHIFI; MARZOUK, 2004).
Os frutos deste gênero são produzidos em vários países . Os Estados Unidos lidera
o mundo com um rendimento médio de 30 toneladas por hectare seguido pelo Brasil e
China, com 20-25 e 18-20 toneladas, respectivamente (ANWAR et al., 2008). São
originários da Ásia, devido às condições favoráveis para seu desenvolvimento foram
introduzidas no Brasil pelos portugueses (COSTA, 2000).
Citrus são reconhecidas como uma das mais importantes fruteiras do mundo. São
colhidas em muitos países com clima tropical ou subtropical e os principais produtores são
Brasil, China, Japão, México, Paquistão, E.U.A. e os países da região do Mediterrâneo. A
produção citrícola mundial é de cerca de 105 milhões T / ano (ANWAR et al., 2008).
Tanto no cultivo quanto no processamento de citros podem ser gerados grandes
volumes de resíduos. No manejo dos pomares de citros é realizado o raleio, que é a
remoção e o descarte de parte dos frutos verdes para atingir melhor qualidade final de
frutos. Já na extração de suco de citros, praticamente 50% do fruto é considerado
subproduto (CHON e CHON, 1997).
Atualmente, os resíduos de suco de laranja são aproveitados na forma de farelo de
polpa cítrica peletizada, polpa congelada, melaço, d-limoneno, suco extraído da polpa (Pulp
Wash), óleos essenciais, essência oleosa e essência aquosa (DARROS-BARBOSA e
CURTOLO, 2005).
A casca de citros, folhas e frutos possuem diversos metabólitos secundários,
responsáveis por sua proteção contra fatores bióticos e abióticos, como terpenoides,
carotenoides, cumarinas, furanocumarinas e flavonoides, principalmente flavononas e
flavonas polimetoxiladas, raras em outras plantas (AHMAD et al., 2006). Esses compostos
estão presentes em extratos e óleos de citros, e têm despertado interesse em diversas
áreas em virtude da bioatividade, como atividade antibacteriana (FRIEDMANN, 2004;
ASHOK KUMAR, 2011), antifúngica (LIU, 2012), antioxidante (PATIL, 2009), inseticida
(SISKOS, 2008), antiinflamatória (MABRY e ULUBELEN, 1980), entre outras atividades.
5. Metodologia
5.1. Coleta e preparação do material botânico.
O material botânico (cascas, folha e galhos finos) foi coletado na fazenda
Experimental da Universidade Federal do Amazonas (FAEXP/UFAM, Rodovia BR-174, Km
922, antigo Km 38), contidas numa área de 1.443 m2 (Figura 1).
As exsicatas das plantas foram identificadas por especialistas e posteriormente
depositadas no herbário da Universidade Federal do Amazonas – UFAM, Manaus – AM.
Depois de coletadas, as diferentes partes das plantas (cascas, folhas e galhos) foram pré-
secas à sombra em temperatura ambiente, e após foram postas em estufa de ar circulante,
a 65 ºC por 72 horas, após isso foram processadas em moinho quatro facas MSSL-304
polido, de propriedade do Centro de dinâmica ambiental – CDAM do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia- INPA, passadas em peneira de 1mm e armazenadas em sacos
plásticos identificados e armazenados no laboratório de Parasitologia e Microbiologia
animal.
Figura 1. Coleta botânica de Citrus spp.
5.2. Preparação dos extratos

Todo material pulverizado (1,0 Kg) será submetido à extração por maceração com
solvente em ordem crescente de polaridade, hexano e metanol, com remoção em intervalo
de três dias, totalizando trinta dias. O material remanescente serái desprezado. Os extratos
obtidos foram filtrados e evaporados sob pressão reduzida a temperatura de 50 °C e, em
seguida, secos em dessecador. Após a completa secagem os extratos serão pesados para
a obtenção dos rendimentos.
5.3. Obtenção e cultivo de leishmania sp

Os parasitas utilizados nesse trabalho são formas promastigotas de Leishmania
(Leishmania) amazonensis cepa PH8 (IFLA/BR/67/PH8). O meio de cultura utilizado para a
propagação in vitro das promastigotas de L. amazonensis é o RPMI 1640 (Sigma Chemical
Co St. Louis, MO, USA), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Foetal Bovine
Serum, Gibco TM, Invitrogen, Brazil) previamente inativado a 56 °C por 30 minutos e
somente adicionado ao meio no momento do uso. O RPMI 1640 foi preparado,
reconstituindo-se o pó em 1 litro de água destilada, adicionando 20nM HEPES (N-2-
hidroxietilpiperazina-N’-22, ácido etanosulfônico; GIBCOBRL) e 50 μg/mL de gentamicina.
Depois de preparado o meio RPMI 1640 foi esterilizado por filtração em membrana de
nitrocelulose de poro 0,22 μm (Millipore).
5.4. Quantificação prévia de leishmania sp
Para a propagação in vitro das formas promastigotas foi utilizado culturas de 5° dia
de crescimento (final da fase logarítma) lavadas duas vezes por centrifugação a 1000 xg
por 10 min em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril e ressuspensas em
meio de cultura preparado como descrito no item anterior. Após contagem em câmara de
Neubauer, 5x105 parasitas/mL foram ressuspensos em meio de cultura suplementado com
SFB. A manutenção das culturas de promastigotas ocorreu pelo repique a cada cinco dias,
as mesmas foram incubadas a 24 °C. O crescimento dos parasitas foi avaliado por
contagem como descrito a seguir.
5.5. Delineamento experimental
O experimento será conduzido obedecendo a um delineamento inteiramente
casualizado, constando de oito tratamentos, sendo esses: controle positivo; controle de
solvente; controle negativo e extratos nas concentrações de 100, 50, 25, 12 e 6 μg/mL) e
três repetições.
A avaliação do crescimento dos parasitas será realizada durante cinco dias através
de curvas de crescimento das promastigotas de L. amazonensis obtidas a partir de culturas
em fase final de crescimento logarítmico. A cada 24 horas, alíquotas das culturas serão
diluídas em 1 mL de PBS gelado estéril sendo acrescentados 100 μL de corante Eritrosina
B (Merck, Darmstadt, Alemanha) a 0,04% (p/v). Após cinco minutos no gelo será realizada a
contagem diferencial das promastigotas em câmara hemocitométrica de Neubauer em
microscópico óptico com aumento de 400X. A média aritmética de duas contagens será
utilizada para calcular o número de parasitas contidos em 1 mL de cultura.
Os dados obtidos serão analisados segundo a fórmula: nº de parasitas = nº de
parasitas contados x inverso da diluição x 10 4 (SILVA-JARDIM, 2001). Conforme o
protocolo proposto por Silva-Jardim (2001), o número de leishmanias na forma
promastigota será avaliado em material codificado por dois observadores independentes.
Os parasitas corados em vermelho serão considerados mortos e os birrefringentes e
móveis considerados vivos. O Cálculo será realizado considerando apenas o número de
parasitas vivos.
5.6. Avaliação da atividade leishmanicida in vitro – formas promastigotas
A avaliação da atividade leishmanicida será realizada no laboratório de microbiologia
e parasitologia animal da Faculdade de Ciências Agrárias (FCA/UFAM), sob a orientação
da Profª. Drª. Janaína Paolucci Sales de Lima. A avaliação da viabilidade das promastigotas
na presença das amostras será realizada segundo o protocolo proposto por Fumarola e
colaboradores (2004, p. 225-227).
As culturas de promastigotas serão mantidas a 24 ºC em meio NNN enriquecido com
RPMI 1640, suplementado com soro fetal bovino inativado a 10% (SIGMA), L-glutamina 2
mM (GIBCO) e os antibióticos penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) (SIGMA).
Antes de cada experimento será observado no microscópio a motilidade flagelar dos
parasitos. Para os ensaios, os extratos serão diluídos cinco vezes em meio RPMI completo,
obtendose a concentração de 1 mg/mL. Deste, serão retirados 100 μL os quais serão
diluídos seriadamente, em placas de 96 poços de fundo chato (Costar), na proporção de
1:2, resultando nas concentrações finais de 100, 50, 25, 12 e 6 μg/mL. Em cada poço serão
adicionados 10 μL da suspensão contendo 5 x 106 formas promastigotas de L.
amazonensis por mL. Pentamidina, droga utilizada no tratamento das leishmanioses, será
utilizada nas mesmas concentrações dos extratos. Como controle serão utilizadas as
formas promastigotas cultivadas em meio RPMI completo.
A atividade leishmanicida dos extratos serão avaliadas pela inibição do crescimento
de formas promastigotas após 24, 48, 72, 96 e 120 h de incubação a 24 ºC, pela contagem
do número total de promastigotas vivas, levando-se em consideração a motilidade flagelar,
utilizando-se câmara de Neubauer e microscópio ótico de luz comum. A contagem será
comparada com o controle positivo (crescimento das formas promastigotas sem o látex),
controle do solvente e controle negativo. Cada concentração dos extratos serão analisadas
em triplicata. Os resultados serão expressos como concentração inibitória do crescimento
parasitário (IC50), baseado em Schmeda-Hirschman e colaboradores (1996) e Camacho e
colaboradores (2003).
Os cálculos de IC50 foram realizados utilizando modelo de regressão não-linear
através da curva dose-resposta de inibição (Log [inibidor] x resposta), descrevendo a
relação existente entre as várias concentrações das amostras e o número de leishmania
obtidos nas curvas de crescimento. As amostras foram classificadas como altamente ativa
(IC50 < 10 µg/mL), ativo (10 µg/mL < IC 50 < 50 µg/mL), moderadamente ativo (50 µg/mL <
IC50 < 100 µg/mL) e não-ativo (IC50 > 100 µg/mL) (OSÓRIO et al., 2007).
5.7. Análise estatística
A análise estatística dos dados obtidos será efetuada no programa Graph Pad Prism
5.0 pelos métodos tradicionais de análise de variância (ANOVA) e de comparação de
médias. A curva de crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis será efetuada
através da diferença entre as médias do número de promastigotas/dia nas diferentes
concentrações de uma mesma droga em relação aos controles pela ANOVA de um fator,
utilizando o teste de StudentNewman-Keuls.
6. Resultados parciais e Discussão

6.1. Curva padrão de crescimento
A curva de crescimento das formas promastigotas de L. amazonensis apresentou a
fase exponencial tardia e a fase estacionária respectivamente, no quinto e sexto dia de
cultivo (Gráfico 1). Observou-se que estatisticamente não haveria diferença na escolha do
quinto, sexto ou sétimo dia de crescimento. O sexto dia de crescimento definiu-se como o
dia padrão de uso da cepa para os estudos in vitro de L. amazonensis.
L. amazonensis
Promastigotas/mL 10 9
10 7
10 5
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo (Dias)
Gráfico 1. Curva de crescimento de Leishmania (Leishmania) amazonensis. Intervalo de confiança de

95%. As barras indicam o erro padrão da média (SEM).
A realização de curvas de crescimento é fundamental para a manutenção e uso das

culturas de Leismania spp. É possível determinar a fase exponencial e a fase estacionária
de crescimento de microorganismos em cada sistema de cultivo, a determinação desta fase
é importante uma vez que autores sugerem uma associação entre a fase de crescimento
da cultura e o sucesso da manutenção da cultura (KILLICK-KENDRICK et al., 1974;
BOGDAN, 1990). Com a obtenção das curvas de crescimento e a observação da
morfologia das formas promastigotas de L. amazonensis, determinou-se a fase exponencial
tardia e a fase estacionária, sendo assim, possível definir os dias que as cepas tinham a
maior probabilidade de estarem infectantes.
Baseando-se nos resultados das curvas de crescimento foi definido o quinto dia para
manutenção e uso das cepas de L. amazonensis. Lima (2012), Passos (2004) e Silva
(2008) apresentaram resultados de crescimento de L. amazonensis semelhantes aos
identificados no presente estudo.
6.2. Calibração de controles
O solvente dimetilsulfóxido (DMSO) a 0,7%, concentração semelhante à usada para
as drogas na concentração de 50 μg/mL, não interfere na mortalidade das formas
promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis cepa PH8 (IFLA/BR/67/PH8) nos
experimentos in vitro. As curvas de crescimento de L. amazonenses (F = 4,902; P < 0,05)
apresenta diferença significativa no crescimento parasitário entre o grupo controle não
tratado e os grupos tratados com concentrações de 10, 5 e 2,5% (Gráfico 2 e Gráfico 3).
Na literatura são encontrados trabalhos utilizando concentrações variadas de DMSO

em formas promastigotas de Leishmania spp. concentrações de 0,1; 0,25; 0,7; 1; 1,6 e 5%
de DMSO não afetaram formas promastigotas de L. amazonensis (OSÓRIO et al., 2007;
NUNES, 2008; COSTA et al., 2009; SATALAYA, 2009; LIMA, 2012).
10 7 Controle
DMSO 10%
Promastigotas/mL
DMSO 5%
DMSO 2,5%
DMSO 1%
*
* DMSO 0,7%
* DMSO 0,5%
10 5 DMSO 0,2%
DMSO 0,1%
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (Dias)
Gráfico 2. Atividade leishmanicida de dimetilsulfóxido (DMSO) frente formas promastigotas de

Leishmania (Leishmania) amazonenses. Os resultados representam as médias de dois experimentos
realizados em triplicata com intervalo de confiança de 95%. As barras indicam o erro padrão da média (SEM).
Os asteriscos (*) referem-se a resultados estatisticamente significantes em relação ao controle sem
tratamento, *P < 0,05.
10 7
Promastigotas/mL
Controle
100 g/mL
50 g/mL
10 5 *** ***
*** 25 g/mL
*** 12 g/mL
***
6 g/mL
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (Dias)
Gráfico 3. Atividade leishmanicida de pentamidina frente formas promastigotas de Leishmania

(Leishmania) amazonenses. Os resultados representam as médias de dois experimentos realizados em
triplicata com intervalo de confiança de 95%. As barras indicam o erro padrão da média (SEM). Os asteriscos
(***) referem-se a resultados estatisticamente significantes em relação ao controle sem tratamento, ***P <
0,0001.
A calibração de controle Pentamidina, o controle de promastigotas de L.

amazonensis se comporta de maneira normal a uma curva de crescimento de sete dias
com as concentrações de Pentamidina de 100 µg/mL, 50µg/mL e 25µg/mL sua expectativa
de vida se encerra no 2º dia sem qualquer aumento de promastigotas, sob as
concentrações 12µg/mL e 6µg/mL a mortalidade de L. amazonensis se retarda por mais um
dia chegando ao terceiro dia devido à baixa concentração de Pentamidina.
7. Referências
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA - ANVISA. Resolução de Diretoria
Colegiada - RDC nº 26, de 13 de maio de 2014: Dispõe sobre o registro de medicamentos
fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos. 2014.
Disponível em:
<http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2014/rdc0026_13_05_2014.pdf>. Acesso
em: 20 abr. 2018.
AGRIANUAL. Pelo aproveitamento racional das plantas medicinais da Amazônia. FNP
Consultoria e Comércio, 2002. p. 28-29
AHMAD, M. M.; REHMAN, S.; IQBAL, Z.; ANJUM, F. M.; SULTAN, J. I. Genetic variability to
essential oil composition in four citrus fruit species. Pakistan Journal of Botany, Karachi, v.
38, n. 2, p. 319-324, 2006.
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8. Cronograma
Nº Descrição 2017 2018
Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul
1 Revisão bibliográfica x x x x x x x x x x x
2 Coleta de material vegetal x x
3 Preparação e identificação das x x
exsicatas
4 Preparação dos extratos x
5 Obtenção e manutenção das culturas x x x x x x x x x x
de L amazonensis
Curva de crescimento x x x
6
7 Atividade das amostras x x

8 Análise e tabulação dos x x x x x x x x x
dados
9 Elaboração do relatório parcial x x
10 - Elaboração do Resumo e Relatório x
Final (atividade obrigatória)
- Preparação da Apresentação Final
para o Congresso (atividade
obrigatória)

Formulario Relatorio Parcial - IC 2018 Robson Santos v1

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

RELATÓRIO PARCIAL PIBIC/PAIC 2018-2019

FORMULÁRIO PARA RELATÓRIO PARCIAL

Título do Projeto PIBIC/PAIC

2. Informações de Acesso ao Documento

2.1 Este documento é confidencial?

2.2 Este trabalho ocasionará registro de patente?

2.3 Este trabalho pode ser liberado para reprodução?

2.4 Em caso de liberação parcial, quais dados podem ser liberados?

 Material e métodos (Liberado)

ocasionando relativa perda do prestígio e da credibilidade das terapias naturais (FARIA,

(heteroxênico), vivendo alternadamente em hospedeiros vertebrados e insetos vetores,

Figura 1. Coleta botânica de Citrus spp.

5.2. Preparação dos extratos

5.3. Obtenção e cultivo de leishmania sp

6. Resultados parciais e Discussão

Gráfico 1. Curva de crescimento de Leishmania (Leishmania) amazonensis. Intervalo de confiança de

A realização de curvas de crescimento é fundamental para a manutenção e uso das

Na literatura são encontrados trabalhos utilizando concentrações variadas de DMSO

Gráfico 2. Atividade leishmanicida de dimetilsulfóxido (DMSO) frente formas promastigotas de

Gráfico 3. Atividade leishmanicida de pentamidina frente formas promastigotas de Leishmania

A calibração de controle Pentamidina, o controle de promastigotas de L.

EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA (EMBRAPA). Atlas do meio

Biológicas) – Centro de Ciências Biológicas (CCB), Universidade Federal de Santa

7 Atividade das amostras x x

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