Gente TP53 e Proteína p53

Organismos possuem um interesse vital em eliminar células defeituosas ou em mau funcionamento de seus
tecidos. Em resposta a tal necessidade, os mamíferos possuem um fiel guardião em suas células. Dentro de quase todas
as células dos tecidos desses organismos, a proteína p53 atua como o representante local de seus interesses; ela está
presente para assegurar que a célula mantenha seus componentes em ordem.

Caso p53 receba informação sobre uma desordem metabólica ou algum dano genético dentro de uma célula, ela
poderá deter o avanço dessa célula por meio de seu ciclo de crescimento e divisão e, ao mesmo tempo, coordenar
respostas localizadas na célula em questão para facilitar o reparo do dano.

Se p53 assimila que a desordem metabólica ou o dano ao genoma é muito grave para ser reparado, ela poderá
decidir emitir sinais que desencadeiem o programa suicida normalmente latente das células – a apoptose. Este evento
resulta na eliminação de uma célula que, se continuasse em crescimento e divisão, poderia acarretar o comprometimento
da viabilidade do organismo.

A presença contínua de uma maquinaria apoptótica latente, porém intacta, representa um tratamento para uma
célula cancerosa incipiente, já que essa maquinaria é equilibrada para eliminar células que estão em processo de se tornar
neoplásicas. Isso explica por que a ação de p53 deve ser interrompida antes que um clone de células pré-malignas alcance
estabilidade dentro de um tecido.

Papilomavírus leva à descoberta de p53

Quando células murinas que foram transformadas com o vírus de tumor de DNA SV40, são injetadas em um
camundongo com mesma identidade genética (i. e., um hospedeiro singenêico), o sistema imune do hospedeiro reage por
meio de uma forte resposta; anticorpos são produzidos e reagem contra uma proteína nuclear que está presente nas células
transformadas com o vírus, não sendo possível detectá-la em células murinas normais. Essa proteína é o antígeno tumoral
grande (large T, LT).

LT é uma proteína multifuncional que o vírus SV40 utiliza para perturbar diversos circuitos regulatórios distintos
dentro de células infectadas e transformadas. Soros anti-LT coletados de camundongos e hamsters com tumores induzidos
por SV40 foram utilizados no ano de 1979 para
analisar as proteínas presentes em células
transformadas com SV40. Os imunoprecipitados
resultantes continham tanto LT como uma proteína
associada, que exibia uma massa molecular
aparente de 53 a 54 kDa.
Essas observações indicam que a proteína LT expressa em células transformadas com
SV40 estava fortemente ligada a uma nova proteína, a qual veio se chamar p53. O anti-
soro que reagiu com ambos, LT e p53, detectou p53 em determinadas células não-
infectadas, notavelmente, células tumorais que foram transformadas por mecanismos
não-virais. As últimas observações indicaram que p53 era de origem celular em vez de
viral.

Essas linhas de evidências sugerem que a oncoproteína LT atua, ao menos

em parte, escolhendo proteínas celulares do hospedeiro para ligação. (A descoberta de
que o antígeno “large T” também é hábil em se ligar a pRb, proteína do retinoblastoma,
já data de sete anos).

Nos anos que se passaram desde as descobertas de 1979, foi observado que uma variedade de outros vírus de
DNA e, pelo menos um, de RNA possuem oncoproteínas específicas que se associam a p53 ou que perturbam sua função.

Por que o gene que codifica a proteína p53 foi primeiro definido como um oncogene? A
descoberta de p53 como um gene supressor de tumor
A transfecção de um clone de cDNA de p53 em fibroblastos de embrião de rato (REFs) revelou que esse DNA
poderia colaborar com o oncogene ras. Assim como myc, o cDNA de p53 introduzido pareceu contribuir para evidentes
sinais indutores de crescimento que acabaram resultando na transformação celular na presença de um oncogene
concomitantemente expresso, ras.

Porém, as aparências enganaram. Como se tornou evidente mais tarde, esse cDNA de p53 foi originalmente
sintetizado utilizando o mRNA extraído a partir de células tumorais como molde. A subsequente manipulação de um cDNA
de p53 clonado em lugar de um mRNA de células normais revelou que esse clone de cDNA, em vez de favorecer a
transformação celular, na verdade suprimiu este processo.

A comparação das sequências dos dois cDNAs revelou que ambos diferem por uma única substituição de base,
uma mutação pontual, que causou uma substituição de um aminoácido na proteína p53. Como consequência, o clone
utilizado inicialmente codificava uma proteína p53 mutante com uma função alterada.

Esses resultados indicaram que o alelo tipo selvagem de p53 realmente atua na supressão da proliferação celular,
e que p53 adquire funções para o estímulo do crescimento celular somente quando apresenta uma mutação pontual em
sua fase de leitura. Por meio dessa descoberta, o gene p53 foi finalmente classificado como um gene supressor de tumor.

Os genes supressores tumorais codificam proteínas que possuem importante papel

na regulação do ciclo celular e apoptose, inibindo a formação de tumores. As mutações
chamadas de “perda de função” ocorridas nesses genes contribuem para o desenvolvimento
de tumores através da inativação de sua função inibitória.
 Dentre todos os genes examinados em genomas de células cancerosas humanas, p53 é o gene mais
frequentemente encontrado com mutações, estando presente na forma mutante nos genomas de quase metade de
todos os tumores humanos.

No caso da maioria dos genes supressores de tumor, quando o gene é inativado (i. e., por nocaute)
homozigoticamente na linhagem germinativa de um camundongo, o resultado foi, quase que invariavelmente, um bloqueio
no desenvolvimento embrionário devido à morfogênese desregulada em um ou mais tecidos. Esses genes
supressores de tumor parecem atuar como reguladores negativos de proliferação em uma variedade de tipos celulares;
sua deleção dos circuitos regulatórios das células leva, consequentemente, à proliferação inapropriada de algumas delas
e, assim, ao rompimento do desenvolvimento normal.

Entretanto, p53 não é um gene supressor de tumor típico. A deleção de ambas as cópias do gene p53 da
linhagem germinativa de camundongo não possui efeito evidente no desenvolvimento da grande maioria de embriões p53-
/-. Esse comportamento forneceu os primeiros indícios de que a proteína p53 não atua para transduzir sinais
proliferativos e anti-proliferativos que continuamente incidem sobre as células e regulam sua proliferação. Em vez disso,
p53 pareceu ser especializado em prevenir o aparecimento de células anormais, especificamente aquelas células que
são capazes de gerar tumores.

Portanto, falta de p53 predispõe ao desenvolvimento de tumores, sendo dispensável a

presença de uma forma mutante oncogênica da proteína p53.

Versões mutantes de p53 interferem na função normal da proteína

As observações de frequentes
mutações do gene p53 em genomas de
células tumorais sugerem que muitas
células cancerosas incipientes devem
perturbar ou eliminar a função de p53
antes de proliferarem.

O gene p53 não parece obedecer

ao esquema de Knudson para a
eliminação dupla de genes supressores de
tumor.
 De acordo com o esquema de Knudson, uma célula pré-maligna que está em evolução pode somente obter
benefício substancial uma vez que tenha perdido ambas as cópias funcionais de um gene supressor de tumor que tem
retardado sua proliferação. Tais inativações genéticas são causadas por mutações que criam alelos inativos (nulos) e,
assim, recessivos.

A mudança substancial no fenótipo celular ocorre normalmente apenas quando a função de um gene supressor é
eliminada por meio de duas mutações inativadoras sucessivas ou por meio de uma combinação de uma mutação
inativadora com um evento de perda de heterozigosidade (LOH). Perda de heterozigose, em uma célula, é a perda da
função normal do alelo de um gene, no qual o outro alelo já era inativo.

Pesquisadores chegam à conclusão de que as células tumorais podem se beneficiar da presença de uma proteína
p53 sutilmente alterada em vez da sua ausência completa, como ocorreria seguindo a criação de alelos nulos por meio de
mutações sem sentido ou a partir de deleções de porções significativas do gene p53.

Alelos dominante-negativos: a mutação responsável inativa o funcionamento normal do produto gênico

codificado. Ao mesmo tempo, essa mutação confere, ao alelo mutante, a habilidade de interferir nas atividades da cópia
tipo selvagem desse gene na célula ou de obstruí-las.

Análise bioquímica da proteína p53: p53 é uma proteína nuclear que

normalmente existia na célula como um homotetrâmero, isto é, uma estrutura de quatro
subunidades polipeptídicas idênticas. Em conjunto com o conceito de dominante-
negativo, a observação da estrutura tetramérica sugeriu um mecanismo pelo qual um alelo
p53 mutante poderia interferir ativamente no funcionamento de um alelo p53 tipo
selvagem sendo expresso na mesma célula.

Um alelo p53 mutante encontrado em uma célula humana cancerosa codifica uma
forma de proteína p53 que possui a maioria da função normal perdida, porém conserva a sua habilidade em participar na
formação do tetrâmero. Se tal alelo mutante estivesse coexistindo com um alelo tipo selvagem nessa célula, os tetrâmeros
p53 formados poderiam conter misturas de proteínas p53 mutadas e tipo selvagem em diversas proporções. A presença
de somente uma proteína p53 mutante em um tetrâmero pode interferir no funcionamento deste como um todo.
 A lógica descrita anteriormente pode sugerir que muitas células humanas tumorais, as quais parecem obter
alguma vantagem por meio da perda da função de p53, deveriam possuir um alelo p53 tipo selvagem e um mutante. Na
verdade, na grande maioria das células humanas tumorais que são mutantes no loco p53, esse loco tem sofrido a perda
de heterozigosidade (LOH), na qual o alelo tipo selvagem tem sido descartado, produzindo uma célula com dois alelos p53
mutantes. Assim, nessa célula, uma cópia do gene p53 é inicialmente mutada, o que é seguido pela eliminação da cópia
tipo selvagem sobrevivente alcançada por meio de algum tipo de mecanismo de perda de heterozigosidade.

Está claro que em uma mutação inicial que resulte em um mutante, o alelo dominante negativo (dn) será o mais
utilizado pela célula tumoral incipiente do que um que resulte em um alelo nulo, que causa perda total de uma proteína
p53 codificada. O alelo dominante negativo pode causar a perda de 15/16 da função de p53, enquanto o alelo nulo resultará,
no máximo, na perda de metade da função de p53. (Na verdade, se os níveis da proteína p53 são cuidadosamente
regulados na célula, como devem ser, então o alelo nulo não causará nenhum efeito qualquer que seja a concentração
total de p53 na célula, pois o alelo tipo selvagem compensará por meio da produção de mais proteína tipo selvagem.)

 Então, por que a eliminação do alelo p53 tipo selvagem é

mesmo necessária? A resposta parece estar no 1/16 da função
completamente normal do gene p53; mesmo essa pouca quantia
parece ser mais do que as células tumorais necessitam para
viver.

Sob condições normais, uma célula sintetizará continuamente moléculas

p53 em uma alta taxa e rapidamente irá degradá-la de forma igual. Isso resulta
num nível de “estado estacionário” muito baixo da proteína dentro desta célula. Em
resposta a determinados sinais fisiológicos, entretanto, a degradação de p53 é
bloqueada, resultando num rápido aumento dos níveis dessa proteína na célula.
Esta observação leva a questões adicionais de porque uma célula normal desejaria
níveis de p53 rapidamente modulados, e quais tipos de sinais fariam uma célula
cessar a degradação de p53, resultando em níveis rapidamente aumentados desta
proteína.

Sinais que causam a indução de p53

Durante o início dos anos 1990, descobriu-se que vários agentes eram
capazes de induzir rápido aumento nos níveis da proteína p53. Estes incluíram
raios X, radiação ultravioleta (UV), certas drogas quimioterápicas
que danificam DNA, inibidores da síntese de DNA e agentes que
destroem componentes dos microtúbulos do citoesqueleto. Após
alguns minutos da exposição de células a alguns desses agentes,
a proteína p53 foi prontamente detectada em quantidades
substanciais em células que previamente demonstraram níveis
mínimos dela. Essa rápida indução ocorreu na ausência de
quaisquer modificações nos níveis de mRNA de p53 e comprovou
que isso não ocorreu devido ao aumento da transcrição do seu
gene. Em vez disso, logo se torna evidente que os níveis elevados
da proteína resultaram inteiramente da estabilização pós-
traducional da proteína p53 normalmente lábil.
 Essas vias convergentes de sinalização revelam uma profunda vulnerabilidade da célula mamífera. Esta tem
confiado a uma única proteína – p53 – a tarefa de receber sinais de observatórios que estão encarregados de
monitorar uma ampla variedade de importantes sistemas fisiológicos e bioquímicos intracelulares. O afunilamento
desses diversos sinais a uma única proteína parece representar um elegante e econômico desenho do circuito de
sinalização celular. Porém, isso coloca as células em uma desvantagem maior, desde que a perda de sua única
proteína do circuito regulador da célula resulta na perda catastrófica da capacidade desta em monitorar o seu próprio
bem-estar e responder com contramedidas apropriadas quando alguns sistemas operacionais não funcionam bem.

Sinais fisiológicos celulares que induzem aumento dos níveis de p53:

Hipóxia (baixa tensão de oxigênio): ocorre tanto em células normais quanto malignas, que não tem acesso
adequado à circulação, e assim, ao oxigênio carregado pelo sangue.

Já era sabido, a partir de outros trabalhos, que os mesmos agentes genotóxicos (i. e., que causam danos ao
DNA) e sinais fisiológicos que provocam o aumento de p53 atuavam sob certas condições de uma maneira citostática,
forçando as células a parar seu avanço pelo ciclo celular, uma resposta várias vezes chamada “apreensão do
crescimento”. Em outras situações, alguns desses sinais podem desencadear ativação do programa apoptótico
(suicídio celular).

De fato, esses poderes citostáticos e pró-apoptóticos de p53 representam o principal tratamento para células
cancerígenas incipientes que avançam para o estado de crescimento maligno. Inúmeras situações de estresse, incluindo
hipoxia, dano genômico e desequilíbrios nas vias de sinalização que controlam a proliferação celular, são
comumente vivenciadas por células cancerígenas durante muitos estágios do desenvolvimento tumoral. Na presença de
qualquer uma dessas situações, um intacto sistema de alarme funcional de p53 ameaça a viabilidade de células que
seriam cancerígenas. Consequentemente, a atividade de p53 deve ser bloqueada ou mesmo completamente eliminada
nessas células caso elas sobrevivam e prosperem.

Isso explica por que a maioria, e talvez todas, das células humanas tumorais apresenta sua resposta de alarme
de p53 parcial ou totalmente inativada. Sem p53 funcional, as células cancerígenas são capazes de tolerar hipoxia, danos
extensos a seus genomas e profunda desregulação de seu circuito controlador de crescimento.

Em um determinado curso (na verdade, os dois eventos que causam a inativação sucessiva das duas cópias do
gene p53), a célula torna-se cega a muitos de seus próprios defeitos. Entretanto, ela ganha a habilidade de continuar a
proliferação ativa sob circunstâncias que normalmente causariam a parada desta ou o desencadeamento da morte
apoptótica. Em adição, a perda do reparo do DNA e das funções que estabilizam o genoma, promovidos pela proteína p53,
deixará descendentes de uma célula p53-/-, mais suscetíveis para adquirir mutações adicionais e avançar mais
rapidamente à malignidade.

Controle dos níveis de p53 por MDM2

Os diversos sinais de alarme que implicam sobre p53 possuem um efeito comum – causam um rápido aumento
nos níveis dessa proteína. Assim como um amplo arranjo de outras proteínas celulares, as moléculas da proteína p53 são
degradadas pela ubiquitina – sistema proteassomo. Proteínas que são destinadas a serem degradadas por esse sistema
são inicialmente marcadas pelo acoplamento covalente de cadeias
laterais de poliubiquitinas, as quais transportam as proteínas aos
proteassomos, onde estas são digeridas em oligopeptídeos. O ponto de
controle crítico, nesse processo, é a marcação inicial.
 A degradação de p53 em células normais, não-perturbadas, é regulada por uma proteína chamada Mdm2
(em células de camundongo) e Hdm2 (em células humanas). Essa proteína reconhece p53 como um alvo que deveria ser
ubiquitinilado logo após sua síntese e, assim, ser marcada para destruição

p53 atua como um fator transcricional. A ligação de Mdm2 a p53 bloqueia imediatamente a capacidade de p53
de realizar sua função. Depois disso, Mdm2 direciona a ligação de uma molécula de ubiquitina a p53 e a exportação desta
do núcleo (onde p53 realiza a maior parte de seu trabalho) para o citoplasma; a subsequente poliubiquitilação de p53
assegura sua rápida degradação em proteassomos citoplasmáticos. As contínuas e altamente eficientes ações de Mdm2
asseguram a curta meia-vida de 20 minutos de p53 em células normais, não-perturbadas.

Em algumas circunstâncias – especificamente, quando células estão sofrendo determinados tipos de estresse ou
dano –, moléculas de proteína p53 devem ser protegidas de seu executor Mdm2, de maneira que possam ser
acumuladas em níveis funcionalmente significativos na célula. A proteção várias vezes é alcançada por meio da
fosforilação de p53, a qual bloqueia a capacidade de Mdm2 de se ligar à p53 e desencadear sua ubiquitilação.

A fosforilação de p53 é feita pelas cinases como ATM, Chk1, e Chk2, as quais se tornam ativadas em resposta
ao dano a DNA. Ao mesmo tempo, a ATM cinase pode fosforilar Mdm2 de uma forma que cause sua inativação funcional.
Como consequência dessa fosforilação de ambas, p53 e Mdm2, esta última falha em iniciar a ubiquitilação de p53, e, então,
p53 escapa da destruição e tem sua concentração rapidamente aumentada na célula.

Mdm2 é uma oncoproteína? Mdm2 atua antagonizando p53 e, dessa forma, previne a entrada de uma célula na
apreensão do ciclo celular, entrando em um estado estacionário de crescimento conhecido como senescência, ou no
programa suicida apoptótico. Entretanto, o resultado final é o mesmo: as ações de ambas, oncoproteínas e Mdm2,
favorecem o aumento no número celular.

A atividade e os níveis da proteína Mdm2 são afetados, ainda, por outros sinais positivos e negativos. A via de
sinalização que favorece a sobrevivência celular por meio da ativação da via da PI3 cinase (PI3K) leva, por meio da
Akt/PBK cinase, à fosforilação de Mdm2 (em um sítio diferente daquele alterado pela ATM cinase descrito anteriormente)
e à translocação resultante de Mdm2 do citoplasma ao núcleo, onde esta é postada a atacar p53. Em virtude de PI3K,
sozinha, ser ativada por Ras e por receptores de fatores de crescimento, viemos a pensar que a via de sinalização
mitogênica influencia, de fato, Mdm2 e, assim, p53, embora indiretamente. Ao mesmo tempo, a ativação da via de
sinalização mitogênica Ras→Raf→MAPK leva, por meio dos fatores de transcrição Ets e AP-1 (Fos + Jun), à transcrição
bastante elevada do gene mdm2, resultando em altos níveis de mRNA e proteína Mdm2. Esses níveis elevados de proteína
Mdm2 amplificam a ativação induzida por fosforilação de Mdm2 alcançada pela via de sinalização PI3K→Akt/PKB.

Ainda um outro mecanismo que afeta Mdm2 tem sido revelado por meio da descoberta de um antagonista de

Mdm2, que é chamado p19ARF em células de camundongo e p14ARF em células humanas. A expressão forçada de um
cDNA codificante para ARF em células de roedores tipo selvagem causou uma forte inibição da proliferação celular.
Entretanto, essa inibição não foi observada quando o cDNA de ARF foi expresso em células que não apresentavam a
função tipo selvagem de p53. Isso indicou que os poderes inibidores de crescimento de ARF dependem absolutamente
da presença de p53 funcional nessas células.

Uma variedade de sinais oncogênicos favorece a apoptose por meio de suas habilidades em induzir a atividade
de E2F, o que leva, por sua vez, ao aumento da expressão de ARF. Dentre esses fatores, estão incluídas as oncoproteínas
E1A de adenovírus, Myc (=c-Myc) e Ras. Isso sugere que essa via de sinalização tem evoluído para eliminar células que
apresentam, dentre outros defeitos, sinalização excedente de E2F ativa.

A proteína ARF liga-se à Mdm2 e inibe a ação desta, aparentemente por meio do sequestro de Mdm2 no
nucléolo – estrutura nuclear que é grandemente devotada a produzir subunidades ribossomais. Uma vez Mdm2 sendo
desviada para longe de suas interações com p53, esta escapa da ubiquitilação mediada por Mdm2 e subsequente
destruição e, além disso, acumula-se rapidamente em altos níveis na célula.

ARF é uma aliada de p53 e, como esta, uma proteína supressora de tumor. Em
muitos tumores humanos, a inativação do loco p16INK4A/p14ARF por mutação
genética ou metilação hipergenética do promotor pode ser verificada. Uma vez
que uma célula tenha perdido a atividade de ARF, ela perde a capacidade de
bloquear a função de Mdm2. Como consequência, Mdm2 fica livre para
direcionar a degradação de p53, e a célula é privada das atividades de p53 por
esta não poder ser acumulada em níveis funcionalmente significativos .
ARF e a apoptose mediada por p53 protegem contra o câncer por meio do monitoramento
da sinalização intracelular
A evolução tem criado diversas formas para eliminar células que apresentam muita atividade de E2F e, por
implicação, têm perdido o controle próprio de pRb. A atividade de E2F1 coordena a expressão de um número de genes
que codificam proteínas que participam diretamente do programa apoptótico. Dentre esses, estão incluídos genes que
codificam caspases (tipos 3, 7, 8 e 9), proteínas relacionadas à Bcl-2 pró-apoptótica (Bim, Noxa, PUMA), Apaf-1, e a ‘prima’
de p53, p73; essas proteínas colaboram para direcionar as células à apoptose.

Em adição, o programa apoptótico dependente de p53 é frequentemente desencadeado pela alta atividade
de E2F. Ele revela que o gene p14ARF carrega uma sequência de reconhecimento à E2F em seu promotor. De uma
maneira que ainda permanece sem entendimento, altos níveis não-comuns de atividade de E2F1 ou E2F2 induzem a
transcrição do mRNA de p14ARF. A proteína ARF logo entra em cena e bloqueia a ação de Mdm2. A proteína p53, então,
é acumulada e desencadeia, por sua vez, a apoptose.

A descoberta do papel crítico de ARF no controle da função de p53 sugeriu a possibilidade de que a função de
ARF é eliminada por uma variedade de estratégias moleculares durante a formação do tumor. Tal eliminação pode conferir
a células cancerosas os mesmos benefícios daqueles resultantes da mutação do gene p53.

Indução de apoptose mediada por E2F1. O estado apoptótico das célulaspode ser monitorado por um separador
celular ativado por fluorescência (FACS), o qual, neste caso, é utilizado para medir o tamanho individual das células ou
fragmentos subcelulares (abscissa) e o número de células de um dado tamanho (ordenada). Nesse experimento, o fator
de transcrição E2F1 (E2F, verde) foi fusionado à proteína receptora de estrogênio (ER) (vermelho), fazendo com que a
atividade de E2F1 dependesse da presença de tamoxifen (OHT), um ligante de ER. Na ausência deste ligante (painel
superior), o fator E2F1 é seqüestrado no citoplasma; sob essa condição, quase todas as células em tal população
apresentam um tamanho de aproximadamente 100 (arbitrário) unidades (com 2,44% possuindo um tamanho menor).
Entretanto, quando o tamoxifen é adicionado nessas células (painel inferior, círculo roxo), NLS é exposta, e a proteína de
fusão contendo E2F1 é importada para o núcleo e se torna ativada, resultando na expressão de um conjunto de genes,
dentre eles os que possuem efeitos pró-apoptóticos. Como resultado, uma proporção significativa de células (32,06%)
agora apresenta um tamanho menor do que as células normais saudáveis, indicativo de sua fragmentação durante o
processo de apoptose.
P53 atua como um fator de transcrição que para o avanço do ciclo celular em resposta ao
dano no DNA e que tenta auxiliar no processo de reparo
A proteína p53 possui um domínio de ligação ao DNA. Os poderes ativadores de transcrição do tetrâmero p53
dependem do reconhecimento e ligação dessa sequência dentro de um promotor. Além disso, um complexo arranjo de
modificações covalentes de p53 deve ocorrer, várias afetando o domínio C-terminal dessa proteína. Essas modificações
provavelmente afetam a capacidade de p53 em interagir fisicamente com outros fatores de transcrição que modulam seus
poderes transcricionais. Na verdade, parece que interações combinatoriais de p53 com esses outros fatores determinam
as identidades dos genes-alvo específicos que são ativados em várias circunstâncias por p53.

Alelos p53 mutantes encontrados nos genomas de células tumorais humanas codifica
substituições de aminoácidos no domínio de ligação ao DNA de p53.

Como sugerido anteriormente, um alvo extremamente importante do fator de transcrição p53 é o gene Mdm2.
Como consequência, quando ativa como um fator de transcrição, p53 incentiva a síntese de Mdm2 – o agente de sua
própria destruição. Isso cria um mecanismo de retroalimentação negativa que geralmente funciona para assegurar que
moléculas de p53 serão degradadas tão logo tenham sido sintetizadas, resultando em níveis muito baixos de estado
estacionário de proteína p53, observados em células normais.
 Em células cancerosas humanas que possuem alelos p53 mutantes, defectivos, a proteína p53 está quase
invariavelmente presente em altas concentrações em contraste à sua ausência virtual em células normais. À primeira vista,
isso pode parecer paradoxal, uma vez que os níveis de uma proteína supressora de crescimento como p53 pareceriam ser
incompatíveis com proliferação celular maligna. O paradoxo é resolvido pelo fato de que, como mencionado anteriormente,
a grande maioria das mutações que afetam o gene p53 causa a perda dos poderes ativadores transcricionais da proteína.
Como conseqüência direta, p53 torna-se incapaz de induzir a transcrição de Mdm2
e, então, a síntese desta proteína. Na ausência de Mdm2, p53 escapa da
degradação e acumula-se em níveis bastante altos. Isso significa que muitos tipos
de células cancerosas humanas acumulam altas concentrações de moléculas p53
essencialmente inertes.

Essa lógica explica por que a presença de p53 prontamente detectável

em uma população de células tumorais, geralmente revelada por meio de
imunocoloração, é um sinal indicador da presença de um alelo p53 mutante no
genoma dessas células.

Mdm2 é somente um do grande conjunto de genes cuja expressão é induzida por p53. Um outro gene-alvo de
grande importância é o p21Cip1, que observamos anteriormente como um inibidor de CDK de ampla ação. Sua indução
explica as ações citostáticas (em vez das pró-apoptóticas) de p53.

Células que não possuem p53 funcional são incapazes de reparar eficientemente as lesões no DNA causadas por
benzo(a)pireno (um potente carcinogênico presente em piches) e os dímeros de pirimidina-ciclobutano causados por
radiação ultravioleta (UV). Além disso, a DNA polimerase β, a qual exerce um importante papel na reconstrução das fitas
de DNA após bases quimicamente alteradas terem sido retiradas por proteínas de reparo do DNA, é muito menos ativa em
células p53 negativas do que em suas contrapartes tipo selvagem.

No momento em que o DNA é reparado com sucesso, os sinais que têm protegido p53 da destruição
desaparecerão. A conseqüência disso é que os níveis de p53 entram em colapso e os de p21Cip1 continuam adaptados.
Isso permite a progressão do ciclo celular até o recomeço, permitindo que as células entrem na fase S, na qual ocorrerá a
replicação do DNA.

Caso uma célula que sofreu dano no DNA já tenha avançado para a fase S e,
consequentemente, esteja no meio da ativa replicação de seu DNA, a proteína
p21Cip1, induzida por p53, pode acoplar a maquinaria da DNA polimerase na forquilha
de replicação e parar seu avanço pelas moléculas de DNA molde.

Essas várias ações de p53 têm retratado esta proteína como a “guardiã do
genoma”. Pelo fato de prevenir o avanço do ciclo celular e a replicação do DNA
enquanto o DNA cromossomal está danificado e pela indução da expressão de enzimas
de reparo de DNA, p53 pode reduzir as taxas nas quais mutações são acumuladas nos
genomas celulares. Inversamente, células que apresentam perda da função de p53
podem proceder na replicação do DNA com dano, ainda não-reparado, podendo causar
a elas, por sua vez, genomas relativamente mutáveis, ou seja, genomas que acumulam
mutações em um índice anormalmente alto por geração celular. Em situações em que
danos graves ao DNA têm sido mantidos (i. e., danos que sobrecarregam as funções
de reparo de DNA das células), p53 pode desencadear apoptose.
p53 frequentemente conduz para o programa de morte apoptótica
Em resposta à massiva anoxia (privação extrema de oxigênio), dano genômico essencialmente irreparável ou
desequilíbrios graves de sinalização, p53 desencadeará a apoptose.

A apoptose é executada rotineiramente durante a morfogênese normal com o objetivo de descartar células
desnecessárias. Ela serve para descartar populações celulares não-desejadas durante a construção que resulta em tecidos
e órgãos bem-formados. A apoptose também possui um importante papel na fisiologia tecidual normal. No intestino delgado,
por exemplo, as células epiteliais são continuamente eliminadas por apoptose, após uma jornada de quatro a cinco dias,
desde o fundo das criptas intestinais às pontas das vilosidades que se projetam para dentro do lúmen.

A apoptose, que é utilizada para a manutenção tecidual de rotina, não parece depender da função de p53. Assim,
as ações de p53 parecem estar limitadas a situações de emergência, que não são de rotina, que ocasionalmente ameacem
células e, portanto, os tecidos. No contexto específico de patogênese de câncer, como observado anteriormente, o
organismo utiliza a apoptose disparada por p53 como uma maneira de remover células que têm potencial para se tornarem
neoplásicas, incluindo algumas células que têm sustentado certos tipos de mutações que desregulam o crescimento e
outras que têm sofrido dano difundido em seus genomas.

A proteína p53 inicia a apoptose, em parte, por meio de sua habilidade em promover a expressão de diversos
genes-alvo downstream, os quais especificam componentes da maquinaria apoptótica. Dentre esses, estão os genes que
codificam um grupo diverso de proteínas pró-apoptóticas. Ao mesmo tempo, p53 reprime a expressão de genes que
especificam proteínas antiapoptóticas.

A inativação de p53 dá vantagens às células cancerosas incipientes em várias etapas na

progressão do tumor
Uma etapa inicial na formação de uma célula cancerosa pode envolver a ativação de um oncogene por meio de
algum tipo de mutação. Essa ativação do oncogene pode colocar a célula em grande risco de apoptose induzida por p53.
Assim, células que têm adquirido tal oncogene acumulam vantagens adicionais de crescimento pela perda da função de
p53.

Posteriormente, no desenvolvimento do tumor, uma população crescente de células tumorais pode sofrer anoxia,
pois elas não possuem uma rede de vasos adequada para lhes fornecer o acesso ao oxigênio carreado pelo sangue.
Enquanto células normais morreriam em virtude de tal privação de oxigênio, as células tumorais podem sobreviver, pois
seus antepassados coordenaram a inativação do gene p53 durante um estágio inicial de desenvolvimento tumoral.

Durante grande parte desse longo processo de múltiplas etapas da progressão de tumor, a ausência de respostas
aos danos genéticos, desencadeadas por p53, permitirá a sobrevivência de células que estão acumulando mutações em
uma taxa mais alta do que o normal. Essa elevada mutabilidade aumenta a taxa na qual oncogenes se tornam ativos e os
genes supressores de tumor inativados; a taxa total de evolução de células pré-malignas para um estado maligno é, desse
modo, acelerada. O colapso do telômero, outro perigo enfrentado pela evolução de células pré-malignas, também seleciona
para aquelas células que têm perdido sua resposta de dano ao DNA dependente de p53.

Juntas, essas diversas conseqüências da inativação de p53 ilustram dramaticamente como o mau funcionamento
de um único componente do circuito de respostas-alarme permite que as células cancerosas adquiram múltiplas alterações
e sobrevivam sob condições que geralmente levariam à morte de células normais.
Alelos mutantes herdados que afetam a via de p53 predispõem a uma variedade de tumores
Em 1982, um grupo de famílias foi identificado por apresentar uma elevada suscetibilidade a uma variedade de
diferentes tumores, incluindo glioblastoma; leucemias; carcinomas de mama, pulmão e pâncreas; tumor de Wilms; e
sarcomas de tecido mole.

Essa síndrome cancerosa familiar, chamada Li-Fraumeni, conforme os dois geneticistas que primeiro a
identificaram e caracterizaram, é mais incomum, uma vez que causa suscetibilidade a uma ampla variedade de cânceres.

Em 1990, oito anos após a primeira descrição da síndrome de Li-Fraumeni, pesquisadores descobriram que muitos
dos casos foram devidos a um alelo mutante em um loco do Cromossomo humano 17p13 – precisamente onde o gene p53
está localizado.

Membros de famílias que herdaram um alelo p53 mutante apresentaram uma alta probabilidade de desenvolver
alguma forma de malignidade frequentemente cedo na vida.

Agora sabemos que os alelos p53 mutantes que são transmitidos através das linhagens germinativas de famílias
Li-Fraumeni carregam uma variedade de mutações pontuais que estão dispersas pela fase de leitura de p53. A análise do
espectro de mutações de linhagem germinativa tem demonstrado uma predominância de transições G:C para A:T em sítios
CpG – precisamente aquelas que ocorreriam se uma 5-metilcitosina fosse submetida a uma deaminação espontânea,
causando sua substituição por uma timidina.

A apoptose é um complexo programa que, por diversas vezes, depende da mitocôndria

Uma vez p53 tendo sido ativada e colocada em uma configuração indutora de apoptose, ela pode dirigir a
expressão de genes que codificam proteínas como Bax. Bax, então, atua para abrir os canais mitocondriais e, em
conseqüência, o citocromo c e outras proteínas pró-apoptóticas escapam da mitocôndria e a apoptose é iniciada por meio
da ativação das caspases.

O papel da oncoproteína Bcl-2 na patogênese do câncer tornou-se aparente. Ela opera mais como um agente
antiapoptótico do que como um mitógeno. Assim, Bcl-2 atua de uma maneira precisamente oposta à p53. Bcl-2 bloqueia a
apoptose, enquanto p53 a promove. Colocado em termos genéticos, a ativação do oncogene bcl-2 e a inativação de p53
conferem benefícios similares (porém dificilmente idênticos) em células cancerosas, em que ambos reduzem a
probabilidade de ativação do programa apoptótico.

Cuidadosas investigações bioquímicas e biológicas celulares finalmente revelaram o sítio intracelular da ação de
Bcl-2. Observou-se que ela atuava em um local intracelular mais inesperado – a membrana externa da mitocôndria. O
Citocromo c, o ator central nesse processo, normalmente reside no espaço entre as membranas interna e externa da
mitocôndria, onde ele atua na transferência de elétrons como parte da fosforilação oxidativa. Entretanto, quando
determinados sinais disparam o início da apoptose, a membrana mitocondrial externa torna-se despolarizada (i. e., perde
seu gradiente normal de carga) e o citocromo c é secretado da mitocôndria para o citosol circundante por meio de canais.
Uma vez presente no citosol, o citocromo c associa-se a outras proteínas para desencadear a cascata de eventos que
resultará na morte apoptótica. Alguns membros da família de proteínas de Bcl-2, incluindo esta e Bcl-XL, trabalham para
manter esses canais fechados e, assim, manter o citocromo c preso na mitocôndria. Ainda outras “parentes” de Bcl-2, como
Bax, Bad, Bak, e Bid (veja a Figura 9.25), atuam de forma oposta, lutando para manter esse canal aberto.
 Uma vez tendo escapado da mitocôndria para o
citoplasma, moléculas de citocromo c associam-se à proteína
Apaf-1 e formam uma estrutura que tem sido denominada
apoptossomo. Os complexos de apoptossomo então procedem
para ativar uma protease citoplasmática normalmente latente
chamada procaspase 9, convertendo-a em caspase 9 ativa.
Quando convertida na protease ativa pelo apoptossomo, a
caspase 9 cliva a procaspase 3 e, dessa forma, ativa ainda outra
protease relacionada, a qual cliva e ativa outra procaspase, e
assim sucessivamente. Essa sequência de clivagens constitui
uma cascata de sinalização em que uma protease ativa a próxima
da série por meio de clivagem.

Enquanto o citocromo c no citosol serve para ativar as

caspases, Smac/DIABLO – uma outra proteína que é liberada da
mitocôndria junto com o citocromo c – inativa um grupo de
proteínas antiapoptóticas chamadas IAPs (inibidores de
apoptose). Essas IAPs normalmente atuam para bloquear a ação
da caspase de duas maneiras: elas ligam-se diretamente e, com
isso, inibem a atividade proteolítica da caspase e, em determinados casos, elas podem marcar as caspases para
ubiquitilação e degradação. Sem a influência contínua de IAPs, as caspases estão livres para iniciar as clivagens
proteolíticas que, finalmente, resultam em apoptose.
Duas vias distintas de sinalização podem disparar a apoptose
De forma importante, a apoptose também pode ser disparada por meio de uma rota alternativa. Esta é iniciada do
lado de fora da célula e ativa receptores pró-apoptóticos de superfície celular. Tais receptores são proteínas transmembrana
que freqüentemente são chamadas de receptores de morte, para indicar a sua capacidade de ativar o programa apoptótico.
Após a ligação de seus ligantes cognatos no espaço extracelular, os receptores de morte ativam uma cascata
citoplasmática de caspases que converge rapidamente na via apoptótica intrínseca descrita anteriormente, disparando,
assim, uma resposta apoptótica idêntica àquela verificada depois da ativação do programa apoptótico intrínseco. Em virtude
dos sinais que ativam os receptores de morte originarem-se do lado de fora da célula, o programa apoptótico iniciado por
esses receptores tem sido chamado de programa apoptótico extrínseco ou via apoptótica ativada por receptor.

Os ligantes dos receptores de morte são membros da família de proteínas do fator de necrose tumoral (TNF), que
inclui TNF-α, TRAIL e ligante Fas (FasL). Uma vez ativados pela ligação de seus ligantes, os domínios de morte desses
receptores ligam-se e ativam uma proteína associada chamada FADD (proteína de domínio de morte associado a Fas) no
citoplasma. O complexo resultante é chamado DISC (complexo de sinalização indutor de morte) e intima as formas inativas
de pró-enzimas da caspase 8 e, menos comumente, da caspase 10, as quais estão entre as caspases iniciadoras. DISC
então desencadeia a autoclivagem dessas caspases e sua conversão em proteases ativas. As caspases 8 e 10 (caspases
iniciadoras dessa via) então ativam as caspases executoras 3, 6 e 7, convergindo, assim, na via de sinalização por meio
da qual o programa apoptótico intrínseco atua.

Além disso, a caspase 3 pode clivar e ativar a proteína relacionada à Bcl-2 no citosol, chamada Bid, a qual migra
para o canal mitocondrial e faz com que este se abra. Fazendo isso, Bid realiza a amplificação de sinais pró-apoptóticos
do programa apoptótico extrínseco pelo recrutamento de elementos do programa intrínseco para dentro do processo
também.

De fato, existe uma terceira via de disparo de apoptose, em efeito a outro programa apoptótico extrínseco. Este é
desencadeado por linfócitos T citotóxicos e células matadoras naturais (NK) que se empenham em matar células-alvo.
Esses dois tipos de células matadoras – algumas das tropas da linha de frente do sistema imune – podem ativar receptores
de morte, como Fas, apresentados na superfície de células que estão sendo escolhidas para destruição.
 Ativação da apoptose por p53. A proteína p53 utiliza múltiplas vias de sinalização para ativar o programa
apoptótico. Por meio da indução da expressão do gene que codifica o receptor Fas, ela causa a apresentação deste
receptor de morte na superfície celular, sensibilizando a célula a qualquer ligante Fas (FasL) que possa estar presente no
espaço extracelular. Pela indução da expressão da proteína-3 ligadora de IGF (IGFBP-3; vermelho), p53 causa a
liberação dessa proteína no espaço extracelular, onde ela se liga e sequestra IGF-1 e IGF-2, os ligantes antiapoptóticos,
de pró-sobrevivência, do receptor de IGF-1 (IGF-1R; acima, à direita). Na ausência de IGFBP-3, IGF-1 se ligaria ao seu
receptor e causaria a liberação de sinais antiapoptóticos na célula, incluindo aqueles que levam à inativação das proteínas
pró-apoptóticas Bad (relacionada a Bcl-2), caspase 9 e IκB (antagonista de NF-κB). Em adição, p53 dirige a expressão
de Bax, a proteína pró-apoptótica relacionada a Bcl-2 que causa a liberação de citocromo c e outras proteínas da
mitocôndria. p53 também inativa diversos outros agentes antiapoptóticos, como Smac/DIABLO.
Células cancerosas inventam diversas maneiras para inativar parte ou toda a maquinaria
apoptótica

As células cancerosas recorrem a numerosas estratégias a fim de diminuir a probabilidade de apoptose. Este
diagrama indica que em diversos tipos de células cancerosas os níveis ou a atividade de importantes proteínas pró-
apoptóticas são diminuídos (azul). Inversamente, os níveis ou atividade de certas proteínas antiapoptóticas pode
aumentar (vermelho).
P53 e o metabolismo

The p53 tumor suppressor protein not only coordinates multiple functions including the ability to promote cell-cycle
arrest, apoptosis, and senescence through its target genes such as p21, PUMA, BAX, etc., but also through its targets
DRAM, SCO2, and TIGAR, which regulate metabolic pathways controlling autophagy, mitochondrial respiration, and
glycolysis, respectively. Identification of GAMT as a new p53 target connects p53 to the creatine metabolism pathway that
was previously shown to involve creatine kinase. The involvement of GAMT/creatine in both genotoxic and metabolic stress-
mediated apoptosis as well as the requirement of p53-dependent upregulation of GAMT in glucose deprivation-induced FAO
implicate a critical role of p53 in coordinating stress response with changes in cellular metabolism.

p53 como um integrador de estresse celular

p53 functions to integrate signals from different types of cellular stress and subsequently promotes the appropriate
biological response, which can lead to cell survival or cell death. In the case of repairable damage or transient stress, a
reversible process is activated that allows for damage repair and/or adaptation in response to the change in environment.
However, when the stress stimulus is persistent and irreparable, the affected cell is permanently removed from the pool of
proliferating cells through cell death, senescence or the induction of terminal differentiation. Although both responses can
promote tumour suppression, uncoupled or deregulated survival functions can contribute to tumour progression and
chemoresistance. Conversely, inappropriate activation of the cell death response can contribute to ischaemia,
neurodegenerative disease or radiation sickness. p53-mediated stress responses may also have a role in promoting
longevity as well as contributing to ageing, by regulating stem cell renewal and oxidative stress.
Drugging the p53 pathway

The apoptotic threshold effect

The tumour suppressor p53 induces apoptosis primarily via induction of the pro-apoptotic proteins phorbol-12-
myristate-13-acetate-induced protein 1 (PMAIP1; also known as NOXA) and p53-upregulated modulator of apoptosis
(PUMA); PUMA seems to have a more important role in normal cells22. The increase in levels of p53 protein leads to a
corresponding accumulation of PUMA and NOXA. PUMA is able to bind to mitochondrial anti-apoptotic proteins such as
BCL-2, BCL-XL, BCL-W, MCL1 and BCL-2-related protein A1 (BCL-2A1)230. By contrast, NOXA is only able to bind to
MCL1 and BCL-2A1. Apoptosis occurs when an apoptotic threshold is reached owing to the inhibition of BCL-2, BCL-XLand
MCL1 by NOXA and PUMA.

The induction of senescence and macrophage engulfment

Another mechanism by which p53 induction (for example, by nutlin) can lead to the elimination of tumor cells is
through the induction of senescence (mediated by the cell cycle inhibitor p21) and an associated ‘eat me’ (opsonization)
signal, which results in macrophage engulfment and killing of the senescent cells.

Strategies for activating wild-type tumor suppressor p53

Tumours that retain wild-type p53 status often have dysfunctions in the regulatory circuits that control p53 activity.
These dysfunctions create targets for p53-activating therapies.

The elevated expression of the E3 ubiquitin protein ligase MDM2 and MDMX proteins or the loss of expression of
the natural MDM2 inhibitor, ARF, occurs commonly in tumours. Here, a dual MDM2 and MDMX inhibitor would be effective.

In human papillomavirus (HPV)-induced cancers, p53 is degraded by the viral protein host complex, and it has
been shown that inhibition of the viral protein E6 can restore p53 function27.
 More general p53 activators can be discovered by high-throughput screening;
for example, the small molecule tenovin-6 can activate p53 by promoting its acetylation
through blockade of the sirtuin 1 (SIRT1) deacetylase.

p53 is often inactivated by oncogenic mutations, which can prevent the proper
folding of the transcription factor or directly disrupt its binding to DNA as a functional
tetramer. p53 reactivators are currently being developed to bind to mutant p53 and
restore its binding activity to DNA, leading to transcription of downstream genes. These
‘reactivators’ act as molecular chaperones by preferentially binding to the correctly
folded form of the protein and stabilizing its functional conformation.