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5 2011
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O presente estudo objetiva apresentar uma síntese do atual conhecimento sobre os conceitos e
fundamentos das substâncias húmicas, métodos de extração, fracionamento, purificação e caracterização,
através do uso de técnicas espectroscópicas, além de traçar um panorama dos avanços dos estudos
científicos relacionados ao tema na região Nordeste do Brasil. A matéria orgânica do solo (MOS) tem
uma série de funções no meio ambiente, que incluem a fertilidade e a reciclagem de nutrientes e de
carbono. No entanto, devido à sua natureza extremamente complexa, sua caracterização sempre foi um
desafio na química do solo. Dada à comprovação da MOS em aumentar a capacidade produtiva dos solos,
em particular em solos tropicais, pesquisas visando o melhor entendimento de sua dinâmica no solo tem
sido incentivadas. Há crescente interesse no melhor entendimento de suas frações estáveis, denominadas
substâncias húmicas (SHs), constituídas por ácidos fúlvicos, ácidos húmicos e humina. O estudo das SHs
no meio ambiente desenvolveu-se bastante nas últimas três décadas, graças a novas metodologias e
equipamentos, porém sua origem e métodos adequados para mensurar o grau de humificação ainda são
tema de discussão. As várias técnicas utilizadas atualmente nem sempre são acessíveis por serem
complexas e requererem equipamentos de alto custo, o que pode ter limitado o desenvolvimento das
pesquisas em algumas regiões do Brasil, como a Nordeste.
Palavras - chave: Métodos de extração, Técnicas espectroscópicas, Fracionamento da matéria orgânica, Região Nordeste
This study aims to present a synthesis of current knowledge about the concepts and fundamentals of
humic substances, methods of extraction, fractionation, purification and characterization, by using
spectroscopic techniques, and provides an overview of the developments of scientific studies related to
the subject in Northeastern Brazil. The soil organic matter (SOM) has a number of functions in the
environment, including fertility, nutrient cycling and carbon. However, by their very nature extremely
complex, its characterization has always been a challenge in soil chemistry. Given the evidence of SOM
to increase the productive capacity of soils, particularly in tropical soils, research aimed at better
understanding the dynamics of the soil has been encouraged. There is growing interest in better
understanding of their stable fractions, called humic substances (HSs), consisting of fulvic acid, humic
acids and humin. The study of SHs in the environment has grown significantly in the last three decades,
thanks the new methods and equipment, but their origin and methods for measuring the degree of
humification are still widely discussed. The various techniques used today not always accessible because
they are complex and require costly equipment, which may have limited the development of research in
some areas of Brazil, like the Northeast.
Keywords: Extraction methods, spectroscopic techniques, Fractionation of organic matter, Northeast Region
1. INTRODUÇÃO
A matéria orgânica do solo (MOS) compreende componentes vivos e não-vivos. Os vivos são
as raízes de plantas e os organismos do solo, constituindo aproximadamente 4% do total. Os
componentes não-vivos representam à matéria macrorgânica, constituída de resíduos de plantas
em decomposição, as substâncias humificadas e as não humificadas. Sabe-se que a MOS
constitui o maior reservatório de carbono da superfície terrestre e que é dinâmico, podendo
variar em decorrência de práticas de manejo. Na maioria dos solos, o teor de MOS pode variar
de 5 a 50 g.kg-1 nos horizontes minerais [1,2].
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A importância da adição e conservação da MOS nos solos bastante intemperizados como, por
exemplo, no semiárido do Nordeste brasileiro, advém do seu baixo teor, associada normalmente
ao baixo pH do solo devido à presença de óxidos de alumínio. Por outro lado, nos sistemas
agrícolas onde não há entrada de nutrientes de fontes externas, a matéria orgânica do solo
(MOS) é a principal fonte de nutrientes, como é o caso da agricultura de subsistência da região
semiárida do nordeste do Brasil [3]. O uso da matéria orgânica em solos com baixo pH e baixa
fertilidade natural, permite dentre outros fatores, o aumento da CTC, rápida correção da acidez,
tendendo a estabilizar o pH próximo à neutralidade e o fornecimento de nutrientes às plantas
[4], tornando-se fator de grande relevância para a melhoria das propriedades físicas, químicas e
biológicas dos solos dessa região.
A comprovação da MOS em aumentar a capacidade produtiva dos solos, em particular, em
solos tropicais, tem incentivado o desenvolvimento de pesquisas visando melhor entendimento
da sua dinâmica, especificamente de suas frações estáveis, denominadas de substâncias húmicas
(SHs). As SHs podem ser entendidas como produtos das transformações químicas e biológicas
dos resíduos vegetais e animais, assim como da atividade dos micro-organismos do solo.
Contudo, os conhecimentos sobre suas origens e processos de humificação, em diferentes
sistemas de cultivo e ecossistemas, ainda são hipotéticos, principalmente sobre a estrutura
físico-química e o potencial de retenção de nutrientes.
As SHs, constituintes de aproximadamente 70 a 80% da MOS na maioria dos solos são
compostas pelas frações ácidos fúlvicos (AF), ácidos húmicos (AH) e humina (HUM),
determinadas com base na solubilidade em meio ácido ou alcalino [1, 2]. O estudo das SHs no
meio ambiente desenvolveu-se bastante nas últimas três décadas, graças ao desenvolvimento de
novas metodologias e equipamentos, porém as rotas de suas origens e os métodos para mensurar
o grau de humificação são ainda tema de discussão, pois não há um modelo definido para a
estrutura química das frações humificadas da MOS.
Os estudos das SHs vão desde os métodos de extração, fracionamento e purificação até a
caracterização por métodos espectroscópicos. Os métodos de extração mais utilizados são
Kononova, Dabin, Danneberg & Ullah, Schnitzer, Swift, Benites e os de purificação são os com
ácido fluorídrico (HF), resina DAX-8, diálise e liofilização. A caracterização é feita por técnicas
espectroscópicas, sendo as espectroscopias na região do ultravioleta-visível (UV), na região do
infravermelho (IV), fluorescência, ressonância magnética nuclear (RMN) e ressonância
paramagnética eletrônica (RPE) as mais utilizadas ultimamente.
Várias das técnicas utilizadas atualmente nos estudos das frações estáveis da matéria orgânica
são de pouca acessibilidade, por serem complexas e os equipamentos necessários são de alto
custo de aquisição e manutenção, o que pode estar limitando o desenvolvimento de pesquisas
dessa natureza em algumas regiões do Brasil. As reuniões bianuais realizadas pela Sociedade
Internacional das Substâncias Húmicas (IHSS) vem oferecendo grande contribuição na oferta e
organização de informações sobre as frações húmicas da MOS no solo e nas águas, sua estrutura
e transformação no meio ambiente.
Assim, o presente estudo apresenta uma síntese do atual conhecimento sobre os conceitos e
fundamentos das SHs, métodos de extração, fracionamento, purificação e caracterização, através
do uso de técnicas espectroscópicas, além de traçar um panorama dos avanços dos estudos
científicos relacionados ao tema na região Nordeste do Brasil. O conhecimento gerado pode
servir para a tomada de decisão relacionada ao uso e manejo dos solos dessa região.
2. DESENVOLVIMENTO
A matéria orgânica do solo (MOS) é considerada como todo material no solo que contém
carbono orgânico, incluindo os micro-organismos vivos e mortos, resíduos de plantas e animais
em estágios variados de decomposição, a biomassa microbiana, as raízes e a fração mais estável,
denominada húmus [5]. A MOS desempenha papel fundamental nas funções do solo, sendo, por
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isso, considerada a principal característica indicadora da sua qualidade, por apresentar forte
interrelação com quase todas as características físicas, químicas e biológicas do solo, exercendo
forte influência na sua capacidade produtiva e, de modo muito intenso, na nutrição das plantas
[2].
A MOS tem recebido atenção considerada nas pesquisas, particularmente na última década. É
constituída por C, H, O, N, S e P, com os teores 58%, 6%, 33% e os três últimos 3% [4].
Estudos mais recentes têm mostrado que a MOS na fração pesada associada ao material
sedimentado (areia, silte e argila) geralmente compreende aproximadamente 80% do carbono
orgânico total (COT) e nela estão presentes as frações estáveis denominadas de substancias
húmicas (SHs). Segundo [1], as SHs podem ser definidas como uma série de polímeros amorfos
de coloração amarela, marrom a preta, de peso molecular relativamente alto e formado por
reações de sínteses secundárias, bióticas e abióticas, usualmente classificados em relação a sua
solubilidade em álcali e ácidos.
São divididas em três frações com distintas características físico-quimicas: ácidos fúlvicos
(AF), ácidos húmicos (AH) e humina (HUM). As SHs contribuem com cerca de 85 a 90% do
COT e são o principal componente da MOS, consistindo em grande reserva orgânica do solo
[4]. A parte humificada da MOS do solo é formado por moléculas recalcitrantes de origem
vegetal, animal e microbiana e representa um estado indefinido da MOS. Mesmo com os
recursos da química moderna, a estrutura molecular das SHs é ainda assunto de muitos estudos e
controvérsias. São formadas por mistura heterogênea e bastante complexa de moléculas
orgânicas, polimerizadas e com massa molecular bastante variada [2].
Os ácidos fúlvicos são solúveis em meio alcalino e em ácido diluído. São constituídos,
sobretudo, por polissacarídeos, aminoácidos e compostos fenólicos, que são mais reativos do
que as outras duas frações pela maior quantidade de grupos carboxílicos e fenólicos que contém.
Estudos da ação direta das SHs sobre o metabolismo e o crescimento das plantas têm sido
centrados principalmente, sobre os AF, a fração humificada considerada de menor massa
molecular e maior solubilidade e mobilidade no solo [1, 6].
Os ácidos húmicos são solúveis em meio alcalino e insolúveis em meio ácido diluído. Têm
sido definidos como substâncias de coloração escura, compostas por macromoléculas de massa
molecular relativamente elevada, formadas por meio de reações de síntese secundárias a partir
de resíduos orgânicos de plantas, animais e micro-organismos [1]. Entretanto, alguns estudos
têm sugerido novas concepções para a estrutura complexas dessas frações. Os AH apresentam
maior teor de C, menor de O e teor similar de H que os AF [7]. Isso pode ser comprovado com
os estudos realizados por [8] em amostras de um Argissolo Amarelo.
A massa molecular relativa dos AH é maior do que a dos AF, tendendo a ter mais aromáticos
e menos carboxílicos e grupos C-O alquil do que os AF [7] possivelmente por possuírem maior
conteúdo de estruturas tipo polissacarídeos. Entre as SHs, os AF e AH são os mais estudados.
As composições médias de unidades básicas de AF e AH, em termos de fórmulas químicas, são
respectivamente C135 H182 O95 N5 S2 e C187 H186 O89 N9 S2 [9]. Os AH e AF são bastantes reativos e
essa elevada reatividade deve-se principalmente, à presença de grupos funcionais que contem
oxigênio, tais como carboxilas e hidroxilas fenólicas que são responsáveis pela sua acidez. A
acidez dos AH é menor que a AF, o que está relacionado com seus menores teores de carboxilas
[8].
2.4. Humina
A humina é insolúvel em meio alcalino e meio ácido e pode ter composição variada. Possui
reduzida capacidade de reação. A sua não insensibilidade em meio aquoso pode ser devida
simultaneame à elevada hidrofobicidade e forte interação com os componentes inorgânicos e
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Os estudos sobre a formação e estrutura das SHs não são recentes. Ao final do século XIX, já
se considerava que as SHs possuiam natureza principalmente coloidal e com propriedades
fracamente ácidas. Havia também informações a respeito de sua interação com outros
componentes do solo e a noção de que os AH seriam essencialmente lignina modificada. No
início da década de 30 do século XX, sabia-se que os AH eram os constituintes mais
característicos das SH. Inferia-se que havia grupos carboxílicos e os AH eram formados
principalmente por compostos nitrogenados (proteínas) e anéis aromáticos derivados da lignina
[1].
A via de insolubilização refere-se à humificação dos compostos fenólicos solúveis, a partir da
sua oxidação a quinona e polimerização, formando inicialmente dímeros e trímeros que
compõem a maior parte da policondensação dos núcleos aromáticos. A partir da
policondensação dos núcleos aromáticos destes compostos (dímeros e trimeros) são formados os
ácidos fúlvicos, os quais se condensam, formando os ácidos húmicos castanhos que, por sua
vez, formam os ácidos húmicos cinzentos [11].
Por apresentarem alta complexidade química e forte interação com a fração coloidal
inorgânica do solo, essas substâncias decompõem-se lentamente e acumulam-se nos solos. As
SHs são formadas a partir do processo denominado humificação. Dentre as várias
possibilidades, encontra-se desde a clássica teria que considera que são formadas a partir da
lignina modificada até a teoria mais aceita na atualidade, a chamada de rota dos polifenóis. As
rotas que envolvem a síntese das SHs a partir da condensação de polifenóis e compostos
aminados são as mais aceitas atualmente [6].
A lignina é um polímero disperso numa faixa de massa molecular que varia de menos de
1000 até vários milhões de Daltons [12] e a sua resistência à degradação biológica no solo tem
sido atribuída a sua estrutura macromolecular. As ligninas são formadas a partir de três
precursores básicos, que são os álcoois p-cumarílico, coniferílico e sinapílico. Algumas ligninas
consistem de polímeros fenilpropanóides da parede celular, altamente condensados e muito
resistentes à degradação. Eles são compostos de unidades p-hidroxifenila, guaiacila e siringila
[13].
Muitos pesquisadores têm tentado desenvolver modelos químicos para representar a
estruturas médias dessas substâncias, como as apresentadas para AH por [14] e por [15]. A
grande variação no grau de polimerização e no número de cadeias laterais e radicais que podem
ser encontradas nas SHs faz com que não existam similaridade entre duas moléculas húmicas.
Conforme argumento apresentado por [1] as substancias húmicas são quimicamente muito
parecidas, mas as frações podem ser diferenciadas umas das outras pela cor, massa molecular,
presença de grupos funcionais, grau de polimerização e teores de C, O, H, N e S.
Estudos com microscopia de ressonância magnética nuclear têm demonstrado que as SHs
resultam da agregação de várias classes de compostos orgânicos como açucares, aminoácidos,
ésteres e éteres alifáticos e aromáticos [16]. Com o uso da técnica de “dosy” (difision ordered
spectroscopy), [17] afirmou que é possível identificar várias classes de compostos nos
agregados do solo e, demonstrou que as SHs são, na realidade, associações ou agregações de
moléculas de menores pesos moleculares que podem ser rompidas pela ação de ácido.
Muitos trabalhos são realizados utilizando extratores brandos como pirofosfato de sódio,
agentes complexantes, ácido fórmico, misturas ácidas e solventes orgânicos. Mesmo havendo
risco de alterações estruturais, há pesquisadores que preferem à extração mais completa das SHs
utilizando álcalis. A International Humic Substances Society (IHSS) método [27] recomenda
um procedimento baseado em 4 horas de extração com solução de NaOH 0,1 mol.L-1 à
temperatura ambiente, na razão solo/extrator 1:10 (m/v). Entretanto, vários fatores influenciam
no procedimento de extração e muitas questões ainda estão por serem respondidas.
Atualmente são conhecidos vários métodos de extração e fracionamento das SHs: Kononova
[28], Dabin [29], Danneberg e Ullah [30], Schnitzer [31], Swift [27], Benites [32], purificação
com ácido fluorídrico (HF), resina DAX-8, diálise e liofilização, Swift [27]. Esses métodos
diferem quanto ao uso de substâncias extratoras, relação massa da amostra/extrator, tempo de
agitação, centrifugação e formas de purificação.
O método Dabin utiliza pirofosfato de sódio (Na4P2O7 0,1 mol.L-1), relação solo/extrator de
1:20. O método Danneberg e Ullah utiliza água deionizada e resina quelatizante saturada com
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sódio numa relação solo/resina/água de 1:2,5:5, agitação por 16 horas e centrifugação por 30
minutos a 15.000 rpm. O método Kononova usa solução de pirofosfato de sódio (Na4P2O7 0,1
mol.L-1), relação solo/solução de 1:20, com agitação e centrifugação. O método Schnitzer usa
hidróxido de sódio (NaOH 0,1 mol.L-1), relação solo/solução de 1:10 agitação horizontal a 250
rpm, por 24 horas, e centrifugação. O método de Benites usa o hidróxido de sódio (NaOH 0,1
mol.L-1), relação solo/extrator de 1:10 agitação por 4 horas, centrifugação 15 minutos a 2,5 rpm
e o método de Swift usa ácido clorídrico (HCl 0,1 mol.L-1) e hidróxido de sódio (NaOH 0,1
mol.L-1), relação solo/extrator de 1:10, agitação por 1 hora e centrifugação de 9000 rpm por 10
minutos. Os métodos de extração, fracionamento e purificação são procedimentos antecedentes
aos estudos de caracterização das SHs por meio de técnicas espectroscópicas.
A RMN é a absorção ressonante de radiação radiofreqüente (MHz) por núcleos com spin
nuclear (I) diferente de zero e que estejam sujeitos a um campo magnético. Esta técnica é muito
sensível na caracterização da estrutura da matéria. Embora conceitualmente simples, a RMN
pode ser muito complexa, especialmente em experimentos multidimensionais [37]. As análises
das SHs por RMN envolvem a identificação e quantificação dos diferentes grupos funcionais
presentes na amostra. A técnica da RMN tem sido utilizada no Brasil, principalmente na
avaliação qualitativa da MO em diferentes solos e sistemas de manejo [37].
Essa caracterização é feita pela identificação dos grupos funcionais alifáticos, aromáticos e
carboxílicos em suas respectivas bandas representadas [1]. O método mais amplamente usado
para a caracterização de SH em geral é o do 13C em estado sólido, utilizando a polarização
cruzada e rotação no ângulo mágico (CP-MAS), para avaliação do processo de humificação da
MOS no solo. O núcleo ideal para estes estudos é o 13C, por se encontrar uniformemente
distribuído. No entanto, devido à sua baixa abundância natural, as análises são muito
demoradas, requerendo às vezes, um período de mais de 24 horas [37].
Após o primeiro experimento em que essa técnica mostrou-se capaz de resolver questões
químicas da matéria, tornou-se uma das principais técnicas analíticas para os químicos, porém,
devido à flexibilidade dos seus métodos experimentais, tem sido utilizada por outros ramos da
ciência além da química [39]. Um dos problemas em análises por RMN de 13C, especialmente
no caso de ácidos húmicos isolados de solos de zonas tropicais com predomínio de minerais de
argila é o considerável teor de Fe, que causa um alargamento dos sinais devido ao seu
paramagnetismo, além de poder alterar o tempo de relaxação, que por sua vez, altera a
intensidade relativa dos sinais. O problema é ainda mais acentuado pelo fato de que o
isolamento dos ácidos húmicos envolve a acidificação da amostra de solo, o que causa a
degradação dos minerais de Fe, aumentando ainda mais sua concentração na solução de ácido
húmico [33].
O sinal do radical livre detectado na MOS é caracterizado por uma única linha (com g ~ 2), a
qual revela estar o radical livre provavelmente associado ao átomo com spin nuclear zero, como,
por exemplo, o oxigênio, isótopo mais abundante, o que explicaria a ausência de interações
hiperfinas, conforme assegura a multiplicação de linhas dada por 2I + 1 (I=0, então se tem uma
linha). Isso permite supor que o sinal de RPE da MOS seja atribuído a semiquinonas, as quais
podem ser reduzidas pela redução de quinona ou pela oxidação de fenóis, e que estejam
possivelmente conjugadas a anéis aromáticos [44]. Com a RPE é possível analisar-se não
destrutivamente amostras sólidas, líquidas e gasosas. É uma técnica extremamente sensível e
sob condições favoráveis o limite de detecção para centros paramagnéticos encontra-se no
intervalo de 1011 a 1012 spins g-1, o que equivale à parte por bilhão [39].
Os estudos científicos com as substâncias húmicas na região Nordeste do Brasil são escassos,
os poucos que existem muitas vezes não trata de substâncias húmicas e sim de frações lábeis da
matéria orgânica como o de [50]. Em outros momentos, iniciou-se os estudos das substâncias
húmicas, como o de [51] objetivando verificar o impacto do manejo convencional nas
propriedades físicas e no conteúdo e qualidade das SHs num Latossolo Vermelho-Amarelo do
cerrado de São Desidério-BA, avaliaram quatro áreas sob diferentes períodos de uso e uma sob
cerrado nativo. A extração e o fracionamento foram realizados pelo método Dabin. O processo
de humificação e a qualidade da matéria orgânica foi influenciada pela aplicação de calcário que
favoreceu o aumento dos teores de cálcio e a atividade microbiana, o que acelerou o processo de
humificação da matéria orgânica, e pela rotação de culturas (milho/soja) e que o sistema de
cultivo convencional, com o tempo de uso favoreceu o aumento de AF e de HUM e, uma
diminuição de AH.
[52] avaliaram e caracterizaram por métodos espectroscópicos (UV-Vis, infravermelho,
Fluorescência e EPR), as possíveis mudanças qualitativas no AH extraído de solo fertirrigado
com duas fontes de fertilizantes (orgânica e mineral), associadas à aplicação de ácidos orgânicos
comerciais, na cultura da goiabeira no vale do São Francisco, no estado de Pernambuco. A
extração e o fracionamento do húmus para obtenção dos AH, bem como sua purificação, foram
realizados conforme método da Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas [27]. O esterco
proporcionou maior grau de policondensação dos AH e o uso de esterco associado a ácidos
orgânicos e fertilizantes minerais favoreceu a formação de AH mais estáveis que os tratamentos
que não receberam esterco.
Entre outro estudo [25], caracterizaram AH extraído de carvão vegetal de Mimosa tenuiflora
(jurema-preta) e Aspidosperma pyrifolium (pereiro). A extração foi feita pela metodologia
proposta por Haumeir e Zech (1995) e a caracterização por análise elementar, termogravimetria,
espectrofotometria no infra-vermelho (IV), espectrofotometria no UV-Visível e fluorescência.
Esses autores concluíram que os AH extraídos do carvão apresentaram alta aromaticidade, alta
estabilidade, alta CTC e predominância de COOH e, que as técnicas utilizadas permitiram
identificar semelhança entre os ácidos húmicos extraídos do carvão vegetal e os AH do solo.
Apesar dos escassos estudos realizados até o momento na região Nordeste do Brasil referente
ao tema, há muitos interesses futuros do ponto de vista técnico científico por parte de
pesquisadores em ampliar o desenvolvimento de projetos de pesquisas nessa linha. Pois a
compreensão dos processos envolvidos na dinâmica da MOS do solo é fundamental para a
definição de estratégias de manejo e uso da terra associadas ao desenvolvimento de sistemas de
produção agrícolas racionais, viáveis e sustentáveis.
8. CONCLUSÃO
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