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  • Capitulo Cadeia Transportadora de Eletrons

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    Fosforilação Oxidativa e Fotofosforilação; Bioquímica

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    CAPITULO 19 515 Fosforilagéo Oxidativa e Fotofosforilacao A fosforilagao oxidativa é 0 estagio final do metabolismo pro- dutor de energia nos organismos aerébicos. Todas as ecapas cxi- dativas na degradagao dos carboidratos, gorduras ¢ aminoéci- dos convergem para esse estégio final da respiragio celular, no qual a energia proveniente da oxidagao € cesponsavel pela sinte- sede ATP. A fotofosforilagio & 0 meio pelo qual os organismos fotossintéticos capturam a energia da luz solar —a fonte funda mental de energia na biosfera — ea usam para produzir ATP. A forforilagto oxidativa c a fotofostorilagio, em conjunto, sao tes- ponsiveis pela maioria do ATP sintetizado por virios organis- ‘mos aerébicos na maior parte do tempo. [Nos eucariotos,a fosforilagao oxidativa ocorre nas mitocon- drias ea fotofosforilagio nos docoplastos. A fosforilagao oxida- tiva envolve a redugao do ©; & H,O com elétrons-doados pelo NADH e FADH2,¢ ocorre igualmente na presenga de luz ou na escuridio. A fotofosforilagao envolve a axidagio da H;0 a O,, fem que © NADP! € 0 aveptor de elétrons € absolutamente de- pendente da energia luminosa, Apeser das diferencas, esses dois processos conversores de energie, altamente eficientes, apresen- tam mecanismos fundamentalmente semelhantes. ‘Nosso entendimento atual da sintese do ATP na mitocdn- dria e nos doroplastos esté baseado na hipotese, introduzida por Peter Mitchell, em 1961, de que as diferencas na concentraro transmembrana de protons sio 05 reservatorios para a energia extrufca das reagdes de oxidagao biologices. Essa teoria quimios- ética tem sido aceita como um dos grandes principios uni adores da biologia no século XX. Ela permite a compreensao dos processos de losforilagdo oxidativa e fotofostorilacao e para transdugdes de energia aparentemente distintas, tals como 0 transporte ativo através de membranas € o movimento dos fla- gelos das bactérias, A fosforilagdo oxidativa e a fotofosforilagao sie mecenisti- camente similares em trés aspectos: (1) Ambos os processos en yolvem © fluxo de elétrons por meio de uma cadeia de transpor- tadores ligacios a membrane, (2) A energia livre, dispontvel por meio desse fluxo de eléirons “morro abaixs” (exerg6nico), esté acoplada ao transporte de protons “morro acima’, por meio de ‘uma membrana impermedvel ao préton, conservando a energia livre da oxidacio dos combustiveis como um potencial eletro- uimico transmembrana (pag, 316). (3) O fluxo transmembra- na de prétons, no sentido do seu gradiente de eoncentragio por neio de canais protéicos especificos, fornece a energia livre para asintese do ATP. que ¢ catalisada por um complexo proteico ligado & membrane (ATP sintase) ¢ que acopla o flaxo de pré- tons a fosforilagao do ADP. Este capitulo comesa com a fosforilagio oxidativa. Inicial- mente, serio descritos os componentes da cedeia de transporte de elétrons, a sua organizagao em grandes complexos funcio- taisa membrana interna da mitoeéndria, a sequéncia do flaxo de elétrons por meio deles ¢ os movimentos de protons que acompanham esse fluxo, O préximo t6pico é o notivel comple- x0 enzimatico que, por meio da “catdlise rotacional”, captura a cenergia do fluxo de prétons na forma de ATP. Entdo, serdo con- siderados os mecanismos regulatérios que coordenam a fosfo- rilagao oxidativa por varias vias catabélicas que oxidam com- bustiveis. Com esse entendimento da fosforilacao oxidativa tocondrial, serd abordada entao a fotofosforilagdo, comegando com a absorcéo da luz por pigmentos fotossintéticos, seguido pelo fluxo de elétrons, direcionado pela luz, da H,O para o NADP’, ea base molecular para o acoplamento do fluxo de ele- trons e protons. Finalmente, serio abordadas as similaridades de estrutura e mecanismo entre as ATP sintases dos clocoplastos ce mitocdndrias, bem como as bases evolutivas para essa conser- vagio do mecanismo. FOSFORILACAO OXIDATIVA Reagées de Transferéncia de Elétrons na MitocOndria AA descoberta, em 1948, por Eugene Kennedy e Albert Lehninger, de que as mitocéndrias sio os sitios da fosforilagio oxidativa nos eucariotos, marcou o inicio da fase moderna dos estudos das transdugdes de energia biolégica. As mitocondria, tais como as bactérias gram-negativas, possuem duas membranas (Fig. 19- 1). A membrana mitocondrial extema ¢ facilmente permedvel a pequenasmoléculas (M, <5.000) e fons que se mover ivremente através de canais transmembrana formados por uma familia de proteinas integrais de membrana chamad2s porinas. A mem- brane interna € impermedvel A maioria das moléculas pequenas € de fons, incluindo protons (H"). As tnicas espécies que atra- vyessam a membrana interna sio aquelas para as quais existem transportadores especificos. A membrana interna contém os components da cadeia respiratéria e a ATP sintase, Albert L, Lebninger 1917-1986) 516 Figura 19-1 - Anatomia bioquimica de uma mitocéndria. As crcun- volugtes (crstas) da membrana interna proporcionam uma superficie ‘muito grarde. A membrana intema de ura inica metacéndna do tgado ode ter mais de 10.000 conjuntos de sistemas de warsterércia de eé- trons (cadesas resp atria) € MO\RcLlas de ATP sintase, cstrbuidas sobre toda a superficie da membrana. Mitacindrias do coraco, que apresen- tam crstas musto abundantes e, portanto, uma area de membrana inter a muto mao, contém cerca de Us veres mats conjuntos de ustemas e trarstertncia de elétrons que as mitoctndrias do figado. O reservato- fo mitocondial das coenemas ¢ intermedrios ext funconalmente se- parado do reservaterio ctoplesmético. As mitacondrias des inveriebra- os, plantas e microrganismos eucaniotes so semelnantes as mostradas 29u, embore haja muta variacéo no tamanho, na forma € no grau de enrolamento da membxana interna. Vela 0 Captuo 2 (osgs 28-29) para custos detalhes da estrutura mitocondrial ‘A matriz mitocondrial, cercada pela membrana interna,con- tém 0 complexo da piruvato desidrogenase,¢ as enzimas do ciclo do dcido citrico, a via da B-oxidacio dos Scidos graxos ¢ as vias de oxidacao dos aminodcidos. Em resumo, ela contém todas as vias da oxidagdo dos combustiveis, exceto a glicélise, que ocorre no citosol, A membrana interna, seletivemente permedvel, se ‘rega os intermedidrios e as enzimas das vias metabdlicas cito- sélicas por meio de processos metabélicos que ocorrem na ma- ‘riz, Entretamto, transportadores especificos carregam piruvato, fcidos graxos ¢ aminodcidos ou seus derivados a-ceto para 0 interior da matriz, garantindo 0 acesso & mequinaria do ciclo do dcido citrico, Semelhantemente,o ADP ¢ 0 P, sdo :ransporta- dos especificamente para o interior da matriz 4 medida que 0 ATP recém-sintetizado € transportado para fore. Os elétrons so canalizados para transportadores universais de elétrons ‘A fosforilacdo oxidativa comega com a entrada de elétrons na cadeia respiratéria. Muitos desses elétrons slo provenientes da agdo de desidrogenases que coletam elétrons das vias cataboli- «as e 05 canalizam para aceptores universais de elétrons — citocromo ¢, = citocromo ¢ ~ citocromo a ~ citocromo a; -> O3. Note, contudo, que 2 ordem dos potenciais de reducio padrao no & necessariamente a mesma que a dos potenciais de redugo ver- Proteina @ @ 519 le Figura 19-5 ~ Centros Fe-S. Os centros Fe-S das protelnas ferro- encore poder ser simples corno em (a), com um inca Fe rodeado Dor atomos de S de quatro residuos de Cys. Outros centos incluem tante dtomes inorginies « atomos de § de Cys, comma no: cartes 2Fe-25 (b| ou FetS (e) A feredoxine da cianobactria Ancboera 7120 @) possui umn cento2Fe-25 (Obsewe que apenas os tomes 5 inorgancos estao convados nestas designactes. For exemnplo, NO Cent 2Fe-25 ib), cada ian Fe esté de fat rodead por quatio dto- ios de $0 potencial de reducio pachdo exato do ferro nestes Centtasdenende do ipo de cena da sua nteracéo com as protee nat sesocadae ‘Tabela 19-2 - Potencials de redusdo padrio da cadela respiratéria e dos transportadores de elétrons relacionados Reagio redox (mela-reaso) 2H de —> Hy NAD" + H+ 26 —> NADH NADP" 4H" 4 26° NADPH NADH esidrogerase (PMN) + 2H" 4 22 —+ NADH desidregenase (FMINH,) Ubiquincna + 2H" + 2° —+ ubiqunol Gitccroma b Fe")+ e° —> etocroma b (Fe) Citecroma c) (Fe) +e — dtocromo cy (Fe) Gitocroma ¢ (Fait) +o" —> citocremeo ¢ (Fo) ‘itocromo a (6!) + € —» ctocrome a (Fe) Grtccroma ay (Fe) +.@—> citoeramo as (Fe) JO, 2h + 2° — 10 dadeiros em condigaes celulares, quue dependem da concentra- lo das formas reduzida e oxidada (pag, 401). Um segundo mé- todo para determinar a seqiiéncia dos carregadores de elétrons envolve a redugdo experimental da cadeia completa de earrega dores quando se fornece uma fonte de elétrons, mas nenhum aceptor de elétrons (sem O.). Quando O36 introduzido abrup- tamente no sistema, a velocidade com que cada transportador de elétrons se oxida (medida espectroscopicamente) mostra @ ordem na qual os transporiadores funcionam, O transportador ‘mais proximo do O; (na extremidade da cadeia) liber seu elé- tron primeiro,o segundo transportador a partir da extremidade €0 prdximo a ser oxidado, ¢ assim por diante. Tais experimen- tos confirmaram @ seqiiéncia deduzida a partir dos potenciais ce redusao padrao. Para uma confirmacio final, agentes que inibem o flaxo de détrons através da cadeia tém sido usados combinados com medidas do grau de oxidagao de cada transportador. Na presen sadeO, eum doador ée elétrons,os transportadores que atuam antes da etapa inibida ficam totalmente reduzidos e aqueles que EV ata | 9,320 0,324 00 0.045 0.077 022 0.354 028 085 ote atuam depois do bloqueia ficam completamente oxidados (Fig. 19-6). Usando-se varios inibidores que bloqueiam a cadeia em diferentes locais, a seqiléncia completa foi deduzids ¢ ela € a ‘mesma prevista pelas duas abordagens anteriores, 5 transportadores de elétrons funcionam em complexos multienziméticos 3s transportadores de elétrons da cadeia respiratéria estao ot- ganizados em complexes supramoleculares embebidos ra mem- brana que podem ser fisicamente separados. O tratamento brat- do éa membrana mitocondrial interna com detergentes permite a resolugdo de quatro tinicos complexes transportadores de clé- trons, cada um capaz de catalisar a transferéncia de elétronsatra- vyés de uma parte da cadeia (Fig. 19-7; Tabela 19-3). Os complexos Le Il catalisam a transferéncia de elétrons para a ubiquinona a partir de dois doadores de elétrons diferentes: o NADH (comple- x0 I) e0 succinato (compleno II). O complexo IT transporta elé- trons da ubiquinona até o citocromo c, ¢ © complexo LV completa a seqiiéneia transferindo elétrons do citocromo ¢ para 0 O:. 520 19-6 - Método para determinar a se- ‘quéncia dos transportadores de elétrons. Este ‘metodo mede os efetos oe mibidores da transfe- ‘ancia de elétrons sobre 0 estado de oxidacto de ‘ada transportador. Na presenca de um doador eletrons e de O;, cada inioidor produz un pe- ‘ra0 caracterstico de transportadores oxidadoy reduzidos: aqueles que esta0 antes do bloqueio ficam reduzidos (azul e aqueles que estdo depos ‘60 bloqueto fcam oxidados (vermelho) Figura 19-7 ~ Separayio dos complexos fur- onais da cadela respiratoria. & membrane mitocondrial externa é inialmente rermovia atré- ves de tatamento com o detergerte cigitonina Fragmentos de membrana interna sao ertéo ‘obtdos per ruptura osmética da mitocSndia 05 fragmentos 80 cudadosamente dissolvides ‘emu segundo detergente. A msture resulian~ 1 as protejnas da membrana interna € resolv~ a, por meio de cromatogiata de troca erica, 10s diferentes complexos até (V) da cadela res pat6ria, cada um com sua composicio potca nica fveja Tabela 19-3) e 2 enzmma AT? sintase (elgumas vezes chamada de complexo V). Os complenos I @ IV isolades catalsam as transte- rencies entre doadores (NADH e succinato),trans- portadores intermaciaios (Q ecitocremo ce Os, Conforme mostiado. In vito, a ATP sintase apre~ senta apenas a atividade de hdidlse do ATP (ATPase), mas nBo a de sintese do ATP ‘Teatamento com digitonina fa a Ruptura osmética Seem Fragments de membrana externa desprezados ATP sintase ete on ore seguida por cromatografia de toca ienica Tabela 19.3 ~ Componentes protéicos da cadeia de transferéncla do olétrons da mitocéndria ‘Complexo ‘Massa Nomerode Grupo enzimético (ia) _subunidades* _prostético T NADH dencrogenare 860 42 (14) FMN, Fes 1 Succinato ‘esiarogenase wo 8 FAD, Fes W Ubicuinana 20011 Hemes, Fes citocoma © ‘ondorredutase Ctocrome Bot Heme IN Ctostomo oxidase 16013134) Hemes, Cus, Cus = \linera de subunidades em bactia entre parbteses "Gitecroma c nice parte de um cmplexo erzenatic, mas s® moveliremente ‘ontie cx comploves I IV carn uma protina sual Vamos agora anclisar com mais detalhes a estrutura e a fun- gio de cada complexo da cadeia respirat6ria mitocondrial. Complexe I: NADH até ubiquinona. A Figura 19-8 ilustra a relagdo entre os complexos I, II ¢ a ubiquinona, O complexe T, também chamado de NADH:ubiquinona oxidorredutase,é uma grande molécula de enzima composta por 42 cadeias polipeptt- dices diferentes, incluindo uma flayoproteina ligada a FMN e, pelo menos, a seis centros Fe-S (Tahela 19-3). A microscopia eletrénica de alta resolugie mostra que 0 complexo | tem a for- ma de L, com um brago do L na membrana ¢ outro proton- gando-se em direcdo 2 matriz. Conforme mostrado na Figura 19-3, 0 complexo | catalisa simultanea e obrigatoriamente dois processos acoplados: (1) a transferéncia exergdnica de um fon hid-eto do NADH para 2 ubiquinona ¢ um proton da matrix: NADH +H! +Q—+ NAD‘ + OH; ast) € (2). transferéncia endergénica de quatro protons éa matriz para oespago intermembranoso, Entretanto,ocomplexo | uma bomba de proton movida pela energia da transferencia de elé- trons ea reagao que ela catalisa é vetorial: cla movimenta os prétons em uma diregao especifica de um local (a matriz, que se torna negativamente carregada com a saida de protons) para ‘outro (0 espaco intermembranoso, que se toma positivamente carregado), Para enfatizar a natureza verorial do processo, @ rea~ Go global geralmente & escrita com subscritos que indicam @ localizagao dos protons: P para o lado positive da membrana interna (0 espago intetmembranoso), N para 0 laco negativo (a matriz): NADH + SHi+Q—> NAD'+QH)+4H3 92) © amital (uma droga barbiturica), a rotenona (um produto vegetal comumente usado como inseticida) e apiericidina A (um antibiético) inibem o fluxo de elétrons dos centros Fe-§ do com. plexo | para a ubiquinone (Tabela 19-4) e, por isso, bloqueia todo o processo de fosforilagao oxidstiva, © ubiquinol (QH, a forma completamente reducida; Fig, 19-2) difunde-se ne membrana interna, do complexo I até 0 complexe Ill, onde 6 oxidado a Q em um processo que envolve 0 movimento de protons para 0 lado exiemno (da matriz para 0 ditosol), Complexe Il: succinato até ubiquinona. No Capitulo 16, éencontramos 0 complexo II com 0 nome de succinato desidroge- nase; a tinica enzima do ciclo de Krebs que ¢ ligada a membrana (pgs. 449-450). Embora menor e mais simples que 0 complex ele contém dois tipos de grupos prostéticos ¢ pelo menos, quatro proteinas diferentes (Tabele 19-3). Uma proteina possui um FAD ligado covalentemente e um centro Fe-S com quatro étomos de 521 Eepago entre as nee licer}-3-fosfaro (citosolico} ice 3-ox6t0 Sesrogmie NADH NAD! sucdinate Matciz AciLCoA graze Figura 19-8 - Via dos elétrons do NADH, suctinato, acil-CoA grax @ glicarol-3-fosiato até a uhiquinona. Fistrons do NADH pascam por uma flavoproteina e uma sére de proteinas feo: enxofre (no complex 1 © depo’ vao para Q. Os eletrors do sucinato pessam por uma flavepro- teine e vanos ceritis Fe-S (no complexe Il es) seu Cain Fara Q. 0 glcero! 3tostato doa eletiors para uma flavoproteina(glierol-3-fostato desidrogenase) ra superficie extema da membrane rritocendial interna, da qual ees passam para 0. A aci-CoA desidrogenase (a primei’a encima 1s PLoxidacio_ trarstere 0: eletrons para a flavoproteina tarsferidora de clétrane (FTE). A partir dl, 05 elétions passom para Q via FTE-ubiquinona ondorreculase Espaco entre as ‘membrenas (lado P) tt & Brogo da Figure 19-9 - NADitubiquinona oxidorredutase (complexo ). 0 complexo catalis a trarsferénca de um (on Fidreto do NADH para Fiat, do qual dois eetrors passa avarés de ura sete de cers Fe- S paraa proteina fero-ernoire N-2 no brago da matriz do comglexo. A itansferénca de elstions da N-2 para a ubiquinona no braco de mem bana forma OH: que dfunde para a bicanada ilcca, Ele tabém rige a expukso de quatro prdtors 90” pat de eltrons, da matr2. O mecarismo detalhad que acopla» trarsterénca de etrons¢ prétons no compleno | ainda n80 ¢ carhecido, as, provavelmente,envolve um cle Q simtar aquele ro complew Il'em que QM, paricpa duas vezes por par de eletion (ej fig. 19-11). Ese fluxo de protons produz um potencialeletioquico através da membrene mitocondral interna dado N negatio, lade Ppasttvo), que conserva alguma energa iberada pe- lar raacdos de ‘ransferércis de protons. Este potancal eatroquimico dice a sintese de ATP 522 ‘Tabela 19-4 ~ Alguns agentes que interferem com a fosforilacao oxidativa @ a fotofostoriiacao Tipe de interferéncia ‘Composto* ‘Alveimodo de aco =3 Inbiio de vanslerénde de elvan Goneto } ‘Menoxido de carbon Animicna A ‘Mixotiaot fotenona Arita Rercdina A ocwy Avrverina ‘Ongomiina | Venturing cco icc } NP Valnomicina ‘etmogenina Indio da ATP sintase Desacoplamenta da fostoriagso ‘da tansferénda de eletions Inibigdo oo roca ATP-ADP Auctlosideo Inbe a ctocromo oxidase Bloquea 2 tanstertncia de elérans do citocromo b para o citacrome €, lempete @transferencia de elrons do centro Fe-S para a ubiquinona ‘Compete com Qx pelo sti de igacao em PSE Inibe F Inibe F, eCR, Bloquela o fuso de protons através de Fae CFe Carregadores hidrofébicos de protons lon6foro para K* Forma poros condutores de protons na membrana interna das ‘mitocOndhias de tecdo marrom gorduresc Inbe a aderina nudeotidea translocase *DCMU& 0343 dticorofenf-1,1-dimetiuréia DCCD, diilahexiearbadimda FCCR, carhoaicaneto de p-tiftuernatoxerilhdrazona: DNF. 2.4dintotendl Fe: uma segunda proteina ferro-enxofre também esté presente (vejafrontispicio). Os clétrons passam do succinato para o FAD €-entdo, através dos centros Fe-S, para a ubiquinona (Fig, 19-8). ‘Outros substratos para as desidrogenases mitocondiais tam- bbém passim elétrons para a cadeia respiratoria no nivel da ubi- quinona, mas ndo por meio do complexo Il. A primeira etapa 1a B-oxidagdo dos acil-CoA graxos, catalisada pela flavoprote!- na acil-CoA desidrogenase (pig. 470), envolve a transferéncia de elétrons do substrata para o FAD da desidrogenase, depois para uma flavoproteina transferidora de elétrons (FTE) qus, por sua Vez, passa seus elétrons para a FT Esubiquinona oxidorredu- tase (Fig, 19-8). Essa enzima passa os elétrons para a cadeia res pirat6ria, reduzindo a ubiquinona, O glicerol-3-fosfato, forma- do por meio da liberaco do glicerol devido & degradagto dos triacilglicerdis ou por meio da redugio da diidroxiacetona for- mada ta via glicolitica, € oxidado pela glicerol-3-fosfato desi- drogenase (veja Fig. 17-4). Essa enzima é uma flavoproteina, localizada na superficie externa da membrana mitocondrial in- terna e, tal como a succinato desidrogenase ¢ a acil-Cod desi- -drogenase, ela canaliza elétrons para a cadeia respiratéria, redu- indo a ubiquinona (Fig. 19-8). O importante papel da glicerol- 3-fosfato desidrogenase em transportar equivalentes redutores do NADH citosdlico para a matriz mitocondrial sera descrito posteriormente (veja Fig. 19-27). O efeito de cada uma dessas enzimas transferidoras de elétrons ¢ contribuir para o reserva- trio de ubiquinona reduzida. A QH: de todas esses reagbes € teoxidada pelo complexo III, 0 componente seguinte da cadeia de transferéncia de elétrons da mitocondria. Complexe It: ubiquinona até citecrome «. 0 complexo IIL, © proximo complexo respiratorio e também chamado de complexo dos citocromos bc, ou ubiquinona-citocromo c axi- dorredutase, acopla a transferencia de elétrons do ubiquinol (QH:) pare 0 citocromo ¢ com o transporte vetorial de protons da matriz para o espayo intermembranoso. A determinagao das estruturas desse enorme complexo (Fig. 15-10) e do complexo IV (a seguir), por meio de cristalografia de raios X, em 1995-1998, foram marcos no estudo da transferéncia de elétrons mitocon- driais, propiciando a armacio estrutural para integrar as int- meras observagies bioquimicas sobre a funglo des complexos. Baseado na estrutura do complexo III € nos estudos biogu- micos detalhados das reagdes redox, foi proposto um modelo razodvel para 2 passagem dos elétrons e protons por meio desse ‘complexo. A equacio global para as reagbes redax desse ciclo Q (Fig, 19-11) & Hs + 2k peste + 2Hiy—? Q4 2 Gt Cretan +4HE (193) O ciclo Q acomoda o comutador entre o carregador de elétrons (ubiquinona) ¢ os carregadores de um clétron (citocromos bye bags €; €€) € explica a estequiometria de quatro protons translo- ‘cados por par de elétrons que passa por meio do complexo, para ocitocromoc. Embora o camino dos eletrons através desse seg- ‘mento da cadeia respiratéria seja complicado, o feito global da transferéncia € simples: QH, ¢ oxidado a Q c duas moléculas de citocromo ¢ sao reduzidas. O citocromo ¢ (veja Fig. 6-18) € uma proteina soldvel do espago intermembranoso. ApOs 0 seu unico heme aceitar um elétron do completo IIL, 0 citocromo c se move em ditegio ao complexe IV para doar o elétron para urn centro de cobre binu- clear nessa enzima. ‘Complexo 1V: citocromo ¢ até 02. No passe final da cadeia respiratéria. o complexo IV, também chamado citocromo axi- dase, transporta dois clétrons do citocrome ¢ para o oxigénio ‘molecular, reduzindo-o a H,0. O complezo IV é uma proteina grande (13 subunidades; M, 204.000) da membrana mitocon- drial interna. As bactérias apresentam uma forma mais simples, ‘com somente trés ou quatro subunidades. mas ainda capaz de ‘catalisar tanto a transferéncia de clétrons como o bombeamen- to de protons. A comparagio dos complexos da mitocondria € da bactéria sugere que trés subunidades s30 criticas para a fun- ao (Fig. 19-12), A subunidace 11 mitocondrial contém dois ions cobre com- plexados 20s grupos —SH de dois residuos de Cys em um cen- tto binuclear (denominado Cu,) (Fig, 19-12b) que lembram a proteinas de centros 2Fe-28. A subunidade I contém dois grupos heme designados ae ase um outro fon cobre (Cus).O heme ase ‘0 Cus formam um segundo centro binuclear que aceita elétrons do heme a eentio os transfere para 0 O: ligado ao heme a. 523 2-28 Pe ee tocrome ¢ as memibranas (lado Prowina ferro-enxofie Rieske \, _ Profeina ferra-enxofre Rieske Figura 19-10~ Complexe do citocromo be, (complexe Il).© complexo 6 um aimero de mendmerosidénticos, cada umn deles comm 11 subunidades dierentes. (a) Estruturs do mpondrmero. O centro funcional & formado por trés subunidades. ¢ citocrorro & Iverde) com seus dois hemes (by e by, veimelhc Cato), a proteing lertoreraoite Rleske (purpura) Com sey ceniro 2Fe-25 (arnarelo) e 0 cocroma ¢, (azul) com seu herre Wermeno). tb) A unidade funcional dimerica, O citacromo c.@ a proteina ferro-enxotre Rieske se projetam a partir da superficie Pe podem interagir com o citocromo c (mostrado aqui, mas nao come parte do comolexc funciena) no espaco intermembraroso. O complexo apresenta dots stios de igacao dstintas para ‘aubiquirona, Q, € Qs, que correspondem 20s stios de inbicao por duas drogas que bioquelam a fosforilecaa oxidative, A antimicna A que blocueia ffluxn de eletrons de here by pata Q.liga-se.a Oy, prdxima ao heme by ne lace N(malria} ca membrana. O misatiazo, que impede ofluxo de eetrons do QH, para a protoina ferra-emmotre Rieske, liga'se a Q,, proxime ao centro 2Fe-25 ¢ a0 heme ‘pn lado P da membrana. A. estruture cerca € essencal pare 0 funcionamento de campexo ill A interface entre os mondmeros forma duas cavdedes, cada una contends um sito Qy de um rmonbmero e urn sitio Qy do Outro, O movimento dos intermediaios da ubiquinena ocorre dentro dessas Cavidades protegiaas, 1 compievo Il se cistalza em duas conformacoes distintas (nzo mostradas) Em uma delas, 0 certo ferto-2nwoire Rieske est pronrro do seu aceoter de elétrons, a heme do ctocromo c, mas relatisamente dstante do ctocromo b e do sito de ligacao QH>, por meio do qual ee recebe 05 ebtions. Na cutra Configurardo, 0 cent Fe-5 se afastou da citacromo c, em diecéo ao citocrorro b. Acreditase qua a proteha Rieske otce entre e3s25 dus conformagdes, em que ela é prmeiramente reduzida e depcis oxdada Oxidagdo do primeiro QH, Osidagio de segundo QH, \,Espaco entre as rmembranas (lado ®) Matris lado n) QH. 4 Cite (oxidedo) —+ Q' + 2H} 4 Cit e (reduzide) QH, + +284 + Cite (oxidado) —> QE, + 2H + Q+ Cite (ecusido) quasi global OH, + 2 Cite, (oxidado) + 2H —> Q + 2 Cite (redunido} + 443 Figura 19-11 - O cio Q. 0 caminha dos eltrons através do complexa Ill é mostrade pelas setas azuls. No lado P da membrana, duas moculas de (OH, sto oxidadas até Q no sto Gy bberanda quatro pratans no espaco intermembrarase. Cada QH, dea um eléton (via contro Fe-S Reske) 20. Cctocroma c 9 um eltion (via citocroma B) para a moiécula de Q no skio Qu, redutinde-o em duse etapas a QH,, Essa redusie tambérn usliza dos protons captedos de matiz. 524, oy Figura 19-12 ~ Subunidades criticas da citocromo oxidase (complex IV). mostiado 0 4 it Gases + AEE FHYO (1944) Esta redugio de quatro elé:rons do O; envolve centros redox que transportam apenas um eétron de cada vez ¢ ela deve ocorrer ‘sem gerar intermedifrios incompletamente reduzidos. tais como 0 perdxido de hidrogénio ou os radicais hidroxila livres, que s80 espécies muito reativas que podem danificar os componentes celulares. Os intermedirios permanecem firmemente ligados 20 complexo até serem completamente convertidos em dgua. A energia da transferéncia dos elétrons é conservada eficientemente em um gradiente de protons A transferéncia de dois elétrons do NADH, por meio da cadeia respiratéria, para o oxigénio molecular pode ser escrita como: NADH +P + 10; NAD! 4 HO 113.8) Esta reagdo global ¢ altamente exergonica. Para 0 par tedox NAD'/NADH, B° é-0,320V e, para o par O./H.O, £" €0,816V. Porianto, o AE* para esta reagdo € +1,14V c a variagdo de ener- gia livre padrao (Eq. 14-6, pég. 401) & aG" = agar” ~2{96.5K)¥ - mol) 14V) 20k1/mol (de NADH) 13-8) Espago entre as smembranas lado) au (substesto) (bembesdo) 4H 28,0 Matrix (lado) Figura 19-13 ~ © caminho dos elétrons por meio do complexo IV. AS us proteinas citicas para o fluro dos eletrons 820 | Heil, © contormo mais claro inclu as outras dee proterias co complexo, Atransferéncia de ‘elétrons por meo do corrplexo IV comeca quando cada urra das duas rmoléculas de citacromo reduzdo doa um elétron para a centro bnucle- af Cu Os elgtrons endo passam. por meio do herve a, pata o centro fe: ‘Cu (citocromo a; @ Cus). Oomgéno entio se liga ao heme 25 éreduzido ‘até seu derivado perbido (OF) por dos eletrons do centro Feu. A Niberagdo de mas dos elétrons do etocromo ¢ converte 0 O}- em duas rrokeculas de aqua, corsumindo quato “substratos™ protons da mata Smuttaneamente. quatto outros protons sio bombeades da mat” por ‘meio de um mecanismo anda desconhecdo, Essa mudania de energia livre padrao € baseada na consideragao de que as concentragdes de NADH e NAD" sao ‘guais (1M). Na mitovondria que respira ativamente, a ago de varias desidroge: nases mantém a relacdo NADH/NAD" acima da unidade e a ver dadeira mudenga de energia livre para a reagdo mostrada na Equasao 19-5 é, de fato, substancialmente mator (mais negati va) quue~220kI/mol. Lim céleulo semelhante para a oxidacio do suctinato mostra que a transferéncia de elétrons do succinato (E° do furarato/succinato = 0,031) para 0 O, tem uma varia: ‘gio de energia livre pad-o menor, mas ainda negativa, da or em de —150K)/mol, ‘A maior parte dessa energia é usada para bombear os pré: tons para fora da mattiz, Para cada par de elétrons transferidos pata 9 O>, quatro prétons sao bombeados para fora pelo com: plexo I, quatro pelo complexo III, e dois pelo complexo IV (Fig 19-14). Portanto, a equagao verorial para o processo &: NADH + (11+ 40, —> NAD" + 10115-+ HLO 9.7 A energia eletroquimica inerente a essa diferengs na con centragio de protons e separaczo de cargas representa uma con servacao temporaria da maior parte da energia da transferéncia dos clétrons. A energia armazenada nesse gradicnte, denomina- a forga proton motria, epresenta dois componentes: (I) a enet- siapotencial quimica devido & diferengana concentragao deuma expécie quimica (H”) em cuas regioes separadas pela membra. nna e (2) a energia potencial elévrica que resulta da separacio de ‘arga quando um proton se move através da membrana sem um contra-ion (Fig, 19-15). Conforme mostrado no Capitulo 12, a mudanga de energia livre paraa criagao de um gradiemte eletroquimico por uma bom- bade fons & a AT In (CC) + 23a (98) conde C,/C, 6 a razio entre as concentragdes para fon que s¢ esloca: Z 60 valor absoluto da sua carga (1 para o proton) e Ay éa diferenga de potencialelétrico transmembrana, dadaem volts. Para protons @ 25°C, In (CiiC) = 230g (Helo (Hp) = 23PH— pHa = 2.3 ApH ‘ea Equagio 19-8 se reduz a: AG = 2.987 ApH + gay = (5,70K)/mol)ApH + (95,8kI - mol) ay (19-9) Espayo ene as membrana (lado ) NADH +H" NAD* Matrie (lado N) Succinate Fumarsto 525, AG = RP In ICIG) + 2gy ART ApH + Aye Figure 19-15 ~ Forga proton motriz. rembiara interna da rritccon= dia separa dos comparimentos de diferente [H'] resultando em diferen- (25a concentragSo quimica {ApH e dstnbuigdo de car ly) através da membana. efelto global & a forca prbton rrotiz (AG) que pode ser ‘alculada como mestraco. Iso & expicada com mas detalhes no texto Em uma mitocondria que respira ativamente, o Ay medido é (015-0,2V e 0 pH da matriz é cerca de 0,73 unidade mais alcali- ‘no que 0 do espago intermembranoso, de tal modo que a mu- danga de energia livre calculada para bombear protons para fora € da ordem de +20k}/mol (de H"], 8 maior parte da qual é pro- veniente da porgao elétrica do potencial eletroquimico, Uma vez 4quea transferéncia de dois elétrons do NADH para o 0; 6acom- panhada pelo bombeamento para forade 10 H” (Eq, 19-7),apro- ximadamente 200k] dos 220k] liberados pela oxidacdo de um ‘mol de NADH sio conservados no gradicate de protons. Quando 0s protons se deslocam espontaneamente a favor do seu gradiente eletroquimico,a energia ¢ disponibilizada para produzir trabalho, Nas mitocondrias, cloroplastos ¢ bacterias aerobicas,a energia eletroquimica no gradiente de pritons dite ciona a sintese de ATP a partir de ADP ¢ P, Nés voltaremos & cenergética e a estequiometria da sintese de ATP direcionada peo potencial eletroquimico no gradiente de préions posteriormen- te neste capitulo, oH 0 Figura 19-14 — Resumo do fluxo de elétrons @ protons por meio dos quatro complexos da cadeia respiratéria. Os elétrons aicancam Q por ‘eo dos compleros | Il. QH; funcona como um transportador mével de elétrens protons. Ela wanslore elérrons para o complexo Il, que 05 ‘vansfere para uma outta conextio mbvel, o citocrome ¢ © compexo IV trensfere entéo os elétrons da citocromo c reduzico para 0 0;. 0 flixo de ‘déivons por meo dos commpiexos|, ll e IV éacomparhado por um fuxo de protons da matriz para o espaco interrmembranoso. Lembrar que os eétrons da f-oxedarao os acicos graxos tambem podem entrar na cade respiratona por meio de Q (vela Hg. 13-8), 526 ‘As mitocondrias das plantas possuem mecanismos alternativos para oxidar o NADH As mitocéndrias das plantas fornecem ATP durante os periodos de baixa iluminagdo ou escuridao por meio de mecanismos in- teiramente andlogos dqueles usados pelos organismos nio-fo- tossintéticos, Na luz, a principal fonte de NADH mitocondrial é a reaciona qual a glicina produzida pela fotorrespiracao é con- vertida em serina (veja Fig. 20-29) 2 Giicina + NAD*—+ serina + NADEY+ HT + CO; + NE} Por razies discutidas no Capitulo 20, as plantas devem efetuar esta reagio, mesmo quando nio tém necessidade de usar NADH para produzir ATP. Para regenerar o NAD”, a partir de NADH desnecessério, a mitocindria das plantas transfere elétrons do NADH diretamente para a ubiquinona, « da ubiquinona direte- mente para 0 O;, desviando-os dos complexos III e IV e de suas bombss de prétons. A energia em NADH é dissipada na forma de calor, que, algumas vezrs, pode ser de valor para a planta (Adendo 19-1), Contrariamente & citocromo axidase (comple- x0 IV), & QH; oxidase alternativa no é inibida por cianeto. A ‘oxidagdo do NADH resistente ao cianeto é, de fato, uma marca caracteristica dessa via de transporte de elétrons em plantas. A Sintese de ATP ‘Como o gradiente de concentragao de protons ¢ transformado em ATP? Vimos que a transferéncia de elé:rons libera ¢ a forsa proton motriz.conserva energia livre mais que suficiente (cerca de 200k!) por*mol” de pares ce elétrons para formar um mol de ATP que requer 50k} (veja Adendo 14-2). Portanto, a fosforil a0 oxidativa mitocondrial nio representa nenhum problema termodindmico. Vamos agora considerar 0 mecanismo quimico que acopla o fluxo de elétrons com a fosforilagio. © modelo quimiosmético proposto por Peter Mitchell € 0 pparadigma para esse mecanismo. Deacordo com o modelo (Fig. 19-16), 2 energia eletroquimica inerente da diferenca na con- centrago de prétons e da separacio de cargas através da mem- brana mitocondrial interna, a forga proton motriz, dirige a sin~ tese de ATP & medida que os protons fluem passivamente de Figura 19-16 -O modelo quimicemétice. Nests representagio simples da teoria quimiosmetca apiicada 2 mitocondra, os eevons do NADH € ‘outros substratos ondavers passam atravesde uma cadesa de carregadores araniados simetrcaren- te na membrana interna. O fluxo de elétrons € ‘acompanhado por uma transferéncia de prétons ‘atavés da membrana produzinds um gradiente ‘qulmico (ApH) e un gradiente elétrico (aw). A membrana nterna de mitoctndria ¢ impernea~ vel 20s protons eles podem volt para a matriz somente através de canais especticos para pro- ‘tons (F). A forca proton motriz que dlreciona os protons de volta para a matriz propicia a enerpia para a sintese de ATP que & catalsada peo com- plexo F;associads a Fy Peter Michel (1920-1992) volta para a matriz através de um poro de protons associado & ATP sintase. Para enfatizar este papel crucial da forga préton motriz, a equacao da sintese do ATP ¢ dada por: ADP +B. 4 nH} —+ ATP + HLO + rit 19-10) ‘A definigio operacional de“acoplamento”é mostrada na Fi- gura 19-17, Quando mitocéndrias isoladas so suspensas em uma solugao-tampao contendo ADP, Pje um substrato oxidével, ‘como o succinato, ocorrem trés processos facilmente mensuré- veis: (1) 0 substraio € oxidado (succinato produz fumaraio), (2) (0.0; € consumido, e (3) 0 ATP é sintetizado, O consumo de axi- sénio ca sintese de ATP dependem da presenga de um substrato ‘oxidavel (nesse caso, 0 succinato) bem como de ADP ¢ P,. ‘Como a energia da oxidagio do substrato dirigea sintese do ATP na mitocondria, nao € inesperaco que inibidores do trans- porte de elétrons para oO; (por exemplo, cianeto, monéxiéo de carbono, antimicina A) bloqueiem a sintese de ATP (Fig, 19- 17a). Mais suzpreendente ¢ o achado de que o inverso também ¢ verdadeito: inibicio da sintese de ATP bloqueia a transferéncia de elétrons na mitoctndria intacta, Esse acoplamento obrigat6rio pode ser demonstrado em mitocéndrias isoladas suprindo-as de O, € substratos oxidiveis, mas no de ADP (Fig. 19-17). 'Nessas condicdes, ndo ocorre nenthuma sintese de ATP ea transfe- réncia de elétrons para 0 O; ndo acontece. O acoplamento da oxidasio ¢ fosforilagdo também pode ser demonstrado usando- se oligomicina ou venturicidina, antibisticos téxicos, que se li- 527 Adendo 19-1 desidrogenase alternative Vias respiratérias alternativas ¢ calor, plantas malcheirosas ‘Muitas plantas floridas atraem insetos polinizado- 15, linerando moléculas odoriferas que mimetizam uma fonte de alimento natural de insetos ou locais potenciais de pestura de ovos. As plantas poliniza- das por moscas ov escaravelhos, que normalmente ali se alimentam ou pdem seus ovos em esterco ou. came podre, algumas veres usam compostos com ‘mau cheiro pra atrar esses insetos ‘Uma familia de plantas malcheirosas éa Araccacy que incluios filodendros,oscopos-de-lirio e de uma espécie de couve malcheirasa. Essas plantas apre- sentam folhas delgadas densamente empacotadasem turra estrutura ereta chamada espadice, rodeada por tuma folhe modificada chamada espata. A espadice libere odores de carne putrefata ou esterco, Antes da polinizagao, a espadice também se aquece, em muitas espécies de 20 a 40°C acima da temperatura ambiente, A produgio de calor (termogénese) aju- da. evaporacio das moléculas cdorifecas para uma melhor dispersdo. Como a came putrefata e oester- co sao geralmente quentes devide ao metebelismo hiperativo dos micrébios carniceiros, 0 proprio ca- Figura 1 ~ Especle de couve oriental malcheirosa, NAD(P)H NAD(P)* — desidrogenase externa NADPH NADH NAD! Oxidase shternative Calor Jor também pode atrair insetos. No caso da couve ‘malcheirosa (Fig, 1), que floresce no final do inver: ‘no ou no comeyo da primavera quando a neve ain- da cobre o solo, @ termogénese permite que a espa- dice cresga através da neve Como essa espécie de couve aquece sua espédi cet Embora as mitocindrias das plantas, fungos ¢ encariotos unicelulares apresentem sistemas de transporte Ge elétrons que sio essencialmente os ‘mesmos que 0s dos animais, elas apresentam ume via respiratéria alternativa, Nessa via, a QHs, que é resistente a0 ciancto, transfere os elétrons do reser vatorio de ubiquinona diretamente para o oxigénio, desviando-os das dras vias de translocacao de prd- tons dos complexos Ill ¢ IV (Fig. 2). energia que poderia ser conservada como ATP ¢ liberada como calor. A mitocéndria das plantas também apresenta luma NADH desidrogenase alternativa que € insen- sivel 8 rotenona, um inibidor do complexo I (veja Tabela 19-4), que transfere elétrons do NADH na ‘matriz.dirctemente para ¢ ubiquinona, desviendo- (5 do.complexo 1 e seu associado bombeamento de protons, As mitocéndrias das plantas apresentam ainda uma outra NADH desidrogenese, na face ex: terna da membrana interna, que fica defromte ao es- ‘ago intermembranosa ¢ transfere os elétrons do NADPH ou NADH para a ubiquinona, desviando: ‘95 novamente do.complexo |. Assim, quando os elé- trons entram na via respirat6riaalternativa por meio da NADH desidrogenase insensivel & rotenons, i NADH desicrogenese externa ou ao succinato desi Arogenase (complexo Il) e passam para oO; oxidase alternctiva resistente ao cianeto, a energia ‘nao € conservada como ATP, mas liberada como calor. A conve malcheitosa pode usar o calor para derreter a neve, produzir um fedor pode ou atrair escaravelhos ou moscas. Eepago entre ne membranes Mateia Figura 2 - Caregadores de eevrons da membrana intema da mitocSndra das plantas. Os eitrons podem fir por mee des complerosiy tle IV, como na mitocbndria dos enimais, ou por meio de carreyadoresalteraives especficos e plantas pelas vias mostradas com setas azus. ha 528 ATP simttizado ©, consumo Tempo ib) Figura 19-17 - Acoplamente da transferdncia de elétrons @ sintesa de ATP na mitocéndria. Em experimentos para demonstra’ © acoplamento, 25 rtocbndias s80 suspersas em um meio larmponedo e um elétrodo de O; ¢ usado para monitorer 0 consumo de O;. Em intervalos de tempo ‘ererminados,s20 rerroidas arrostras que S80 analsadas para se venticar a presen de ATP (a) A adicao de apenas ADF e P;resuita em um pequeno ‘ou nenhum aumento tanto da respirac8o (consumo de Q;, preto) como da sintese de ATP (vermelho). Quando 0 succnato é adcionado, a respragao comeca imediatamente © 0 ATP @ sintetzado, A adcao de cianeto (CN), que bloqueia a trarsferéncia de elétions enire a citocromo oxidase € 00; inibe tanto arespiragdo quanta a sintese de ATP (b) MitacBndlias suptidas com succinato respram e sintatizam ATP apenas quando o ADP e o P forerh adeionados, A adigto subseqiente de verturieidina ou olgomicins, inibidores da ATP sirtase, biocueia tanto a sintese de ATP quanto a respiracho. 0 {inirafenol (ONP) é um desacaplador e permite que a resprracdo continue sem a sintese de ATP gam ATP sintase na mitocondria. Esses compostos sao poten- tes inibidores da sintese de ATP e da transferéncia de elétrons por meio da cadeia de carregadores para 0 O; (Fig, 19-17b).Como §2€ conhecido que 2 oligomicina nao interage diretamente com ‘os carregadores de elétrons, mas somente com 2 ATP sintase, 2 transferéncia de eigtrons ea sintese de ATP sdo obrigatoriamen te acopladas, isto €, uma ndo ocorre sem a outra. ‘A teoria quimiesmética explica prontamente a dependén- ia da sintese de ATP na mitocindria do transporte de elétrons. ‘Quando o fluxo de prstons para o interior da matriz através do «anal de protons da ATP sintase € bloqueado (com oligomicina por exemplo), ndo existe nenhum caminho para o retorno dos protons para a matriz, ea continua extrusio de prétons, provo- cada pela atividade de cadeia respiratOrie, gera um grande gra- diente de prétons. A forea préton motriz aumenta até queo custo (nemgia livre) do bombeamento de protons para fora da matrie, contra esse gradiente se iguale ou exceda a energia liberada pela ‘ransferéncia dos elétrons do NADH para 0 O;. Nesse ponto, 0 fluxo de elétrons cessa, a energia livre do processo de fluxo de clétrons acoplado ao bombeamento de protons torna-se zero € © equilibrio € estabelecido. Entretanto, certas condigdes ¢ reagentes podem desacoplar 2 oxidac3o da fosforilacio. Quando mitocéndrias intactas $0 rompidas com detergentes ou cisalhamento fisico, os fragmen- tos de membrana resultantes ainda podem catalisar a transfe- réncia de elétrons do succinato ou NADH para 0 O;, mas ne- nnhuma sintese de ATP € acoplada a essa respiragaa. Certos com- postos quimicos causam 0 desacoplamento sem romper 4 estrutura mitocondrial. Entre os desacopladores quimicos esto incluidos © 2,4-dinitrofenol (DNP) ¢ a carbonilianeto-p-tri- fluormetoxifenilidrazina (FCCP) (Tabela 19-4; Fig. 19-18), am bos dcidos fracos com propriedades hidrofobicas. A hidrofobi- cidade desses compostos permite que eles se difundam rapida- mente através da membrana da mitovondria. Apés entrarem na ‘matriz mitocondrial na forma protonaca, eles podem liberar um proton, dissipando assim o gradiente de prétons. londforos, tais ‘como a valinomicina (veja Fig. 12-37; Tabela 19-4), permite que fons inorginicos passem facilmente através das membra- ‘nas. Os ionéforos desacoplam a transferéncia de elétrons da fos- forilacio oxidativa, dissipando a contribuicdo elétrica do gradi- 9 i FC i f -F mir t F (Carbonicianeto-p-triflaormetoalfeniidrarina (FOR) Figura 19-18 - Dols desacopiadores quimicos da fostoritagso ox dativa. Tanto o DNP como 0 FCCP possuem um préton dissoouvel e530 ‘mutta hidrofcbicos. fies carregam protons através da membrana mito- condrial intema. dssipando o gradiente de protons. Fes também desa- coplam 2 fotofoxfoniacso (pig. 553). Se 0 papel da transferéncia de elétrons ne sintese de ATP mitocondrial ¢ apenas bombear protons para criar © potencial dda forga proton motriz, um gradiente de prétons, criado artifi- cialmente, deveria ser capaz de substituir a transferencia de elé- ‘trons para conduzir a sintese de ATP. Essa predicdo do modelo quimiosmético foi testada econfirmada experimentalmente (Fig. 19-19). Mitocondrias manipuladas, de modo a se impor uma diferenca de concentraciio de prétons e uma separacio de cargas através da membrana interna, sintetizam ATP na auséncia de um substrate oxidavel. A forca proton motriz sazinha ¢ suficien- te para conduazir a sintese de ATP. | ce tt ) Figura 19-19 ~ Evidéncia do papel do gradiante de proton na sin- tese de ATP, Um gradiente eletroquimico imposto artificamente co- ‘manda a sintese de ATP na auséncia de um substraio oxdavel como um doador de plétrans. Nesce expermento de duas etapas, mitactindriasiso- ‘das 580 incialmente incubadas em um tampao de pH.90 contendo KCI 9,1M. (@) Um lento vazamentio do tarrpao e do KCI para 0 intetior da inicondra evenivalmente provoca um equilrio ca matriz com 0 meio ‘orcurvizinne. Nao estao presentes substrates oxidaves. (b} AS mtacon- sas s80 agora seperadas do tampao ce pl 9,0 e ressuspensas em um ‘ampio de cH 7,0 contenco valinomicina, mas ni KCI A mudanca de ‘ampio era uma diferenca de dias unidadies de pH através da membra- nainterna de ritacdndria, 0 luxo de K" para fora, sem 9 seu contraion t contra o sew gradiente de concentragao, promovido ela valinomicina, na umn destalancesmento de cargas através da membrana (matiz ne- gale). A soma co potencial quimico, devido a ciferenga de pH, com 9 Dotencial létrico, devido senaracio de cargas, é uma forca préton motrz sufcienteriente grande para suporta’ a sintese de ATP na auséi- Ciacde um substrato oxidivel AATP sintase possul dois dominios funcionais, Fo © Fx AATP sintase mitocondrial é uma ATPese do tipo F (veja Fig. 12-316; Tabela 12-4), similer na estrutura ¢ no mecanisme as ATP sintases de loroplastos e bactérias. Esse grande complexo enzimitico da membrana mitocondrial interna catalisa a for- magao de ATP a partir de ADP e P acompanhaco do fluxo de protons do lado P para o N da membrana (Eq. 19-10). A ATP sintase, também chamada complexe ¥, apresenta dois compo- nentes distintos: F;, uma proteina periférica de membrana, € Fy, uma proteina integral de membrana. A letra o subscrita ems F, significa sensivel a oligomicina, F, foi o primero fator ideniifi- cado como essencial para a fosforilacio oxidativa. Ble fol identi- ficaco e purificado a partir da membrana mitocondrial interna por Efraim Racker e seus colaboradores no inicio dos anos 1860. Invitro, pequenas vesiculas formadas a partir da membrana mi- toconcrial interna promovem a sintese de ATP acoplada a trans- feréncia de elétrons. Quando F, € extraido cuidadosamente des- as vesiculas, as vesiculas “despojadas” ainda contém as cadeies respiratorias intactas ¢ a porcdo Fa da AIP sintase, Essas vesicu~ 529 Era Racker (1913-1991) las podem catalisar a transferéncia de elétrons do NADH pars 0 ‘Oz, mas nde podem produzir um gradiente de protons: F, apre- senta um poro de protons através do qual esses protons vazam tio rapidamente quanto sio bombeados pele transferéncia de eetrons e, sem um gradiente de protons, as vesiculas desprovi das do componente F, nao podem fazer ATP. Isoladamente, 0 ‘componente F; catalise a hidrdlise do ATP (o reverso da sintese) € port isso, foi originalmente chamado F, ATPase. Quando puri- ficedo ¢ adicionado as vesiculas “despojadas’, ele se reassocia a0 componente F,, fechando sea poro de protons ¢ restaurando a capacidade da membrana de acoplar a transferéncia de elétrons ea sintese de ATP. © ATP é estabilizado em relagio 20 ADP, na superficie de F; Experimentos de troca isot6pica, usando P, purificado, revelam uum fate notivel sobre 0 mecanisme catalitico da enzima: na sua superficie, a reagdo ADP + P;—=ATP + HO é rapidamente reversivel, isto é,a variagio da energia livre para a sintese de ATP €proxime de zero! Quando o ATP ¢ hidrolisado por F, (o rever- so da sintese de ATP) em 4gua marcada com #0, 0 P, que é for- mado epresenta o étomo !*0, Medidas cuidadosas do teor de "© no Pj formado in vitro pela hidrdlise enzimética do ATP catalisada pela F, revelam que 0 P, contém nao um, mas trés ov ‘quatro atomos de "O (Fig. 19-20). 1850 indica que a ligagao pi- ATP + HO an ADP. Figura 19:20 - Mecanismo catalitico de F,: experimento de troca com "0. F, solublizado de membrana mitncardrialincubado corm ATP ra presenca de agua maicada com "10, Em intervals de tempo defii- os, uma mesta & retrada da solucéo e analisada para a incarporagic do "0 no P,preduzido pela hidrolise do ATP. Em minutos, oP. apresente wes ou quatto 0, inalcando que tanta a hidrolise quanto a sintese do ATP ocosreram varias vezes durante 0 period de incubacdo. 530 rofostato terminal do ATP é quebrada e refeita repetidamente antes que o P; deixe a superficie da enzima. Com 0 P livre para se movimentar eim seu sitio de ligacdo, cada hidrdlise insere a0 acaso 0 '"O em cada uma das quatro posicdes no P,, Essa reagio de troca ocorte nos complexos F,F, nao energizados (sem ne- nhum gradiente de prétons) e com o complexo F,isolado, pois no requer aplicagio de energia. Estudos cinéticos das velocidades de sintese ¢ hidrélise do ATP confirmam a conclusio de que 0 AG” para sintese do ATP na enzima ¢ proxima de zero. Por meio de medidas de velocida- 0s") e sintese (k , = 245"), a constante de A partir desta Kg 0 AG” € proximo de zero. Isso contrasta com 2 Kugda ordem de 10° (AG =—30.5kI/mol) para ATP livre em solugio (ndo na superficie da enzima). © que explica essa enorme diferenca? A ATP sintase es- ‘tabiliza © ATP em relagdo 20 ADP + P, ligando mais fortemen- te 0 ATP e liberando energia suficiente para contrabalangat 0 custo de fazer ATP, Medidas cuidacosas das constantes de lig so mostram que a F,Fyliga o ATP com uma afinidade muito grande (Ky < 10M) €0 ADP com uma afinidade muito menor (Ky 10M). Essa diferenga no K, corresponde a uma diferenga de cerca de 40kJ/mol na energia de ligagao, eessa energia de liga ao desloca o equilibrio na direcao da formacao do produto ATP. 0 gradiente de protons direciona a liberagao de ATP da superticie da enzima Embora a ATP sintase equilibre o ATP como ADP + P, sinteti- zado de novo. ATP nio pode deixar a superficie da enzima na ‘auséncia de um gradiente de protons. E exse gradiente de pré- tons que ajuda a enzima a liberar 0 ATP formado em sua super- ficie. O diagrama de coordenadas de reagio do processo (Fig. 19-21) ilustra a diferenga entre o mecanismo da sintese do ATP ‘eaquele de virias outras enzimas que catalisam reagdes ender- sinicas, Para. sintese continua de ATP, a enzima deve oscilar entre a forma que lig: © ATP muito firmemente e a forma que libera ATP, Estudos quimicos ¢ cristalogréficos da ATP sintase mos- traram a base estrutural para essa alterndncia de fungao. Cada subunidade B da ATP sintase pode assumir trés configuracdes diferentes AF, mitocondrial apresenta nove subunidades de cinco tipos diferentes, com a composicao asBs76e. Cada uma das trés subu- nidades B apresenta um sitio cataltico para a sintese do ATP. A Geterminagao cristalografica da estrutura de F, por Jobn E. Walker e colaboradores revelou detalhes estruturais muito iiteis John €. Walker Coordenada di reacio Enzima tipica Figura 19-21 - Diagrama de coordenadas da reago para » ATP sintase e uma enzima tipiea. Em uma reacdo catalsads por ure ea ‘ma tpka (a esquerda), acancar o estado de transcao (¢) entveo subst toe 0 produtaé a manr barra de enercia a ser scbrepujada. Na eacéo ‘atalsada pela ATP sintase (3 direta), a tberacdo do ATP da enzms, € 1nio a formacSo do ATP. & 2 maior bareia de energia Embora 2 muar- (G2 de energia inze para a formarso do ATP, a partir do ADP + P,em Sdlugde aquoss, se grande e positva, a forte ligacéo do ATP 3 enzima \garante energia de igagao suficiente para lever a energie do ATF ligado 8 ‘encima proxira aqueta do ADP + P,. Na superficie da enzima, a reacao é portanto rapidamente reversivel ea constante de equillrio € aproxma- damente 1. eneraia lve requerida para a liberacdo do ATP é garantida pela forca proton motri aT sintase para explicar o mecanismo catelitico da enzimma, A parte de F, em forma de macaneta é uma esfera achatada de &nm dealturae 1onm de espessura, consistinde em subunidades ce B alterna- ds arranjadas semelhantemente aos gomos de uma laranje (Fig. 19-222, b,c). Os polipeptideos que formam o caule na esteuturs cristalina de F; estao arranjados assimetricamente, com um do- minio de uma tnica subunidade y que caracteriza uma haste que atravessa F, ¢ um outro dominio de y primariamente asso- lado a uma das trés subunidades B, designada B-vazia (Fig. 19- 22c). Embora a seqiiéncia de aminoscidos das trés subunidades B scjam idénticas, as suas conformasOes slo diferentes, em par- te, devido & associacdo da subunidade y com apenas uma das trés, As estruturss das subunidades 8 ¢ © nio foram reveladas nesses estudos cristalogréficos. [As diferencas conformacionais entre as subunidades B se ampliam para diferengas nos sitios de ligag3o do ATP/ADP. ‘Quando os pesquisadores cristalizaram a proteina na presenca de ADP ¢ App(NH)p.um anilogo estrutural muito parecido com ‘© ATP quenio pode ser hidrolisado pela atividade ATPase de F;, © sitio de ligacdo de uma das trés subunidades B foi ocupado pelo App(NH)p, 0 segundo foi ocupado pelo ADP ¢ 0 terceiro ficou vazio (Fig. 19-22). As correspondentes conformactes di subunidade B foram designadas ATP, B-ADP e B-vazia Esst iferenga na ligac2o do nucleotideo entre as trés subunidades ¢ critica para o mecanismo desse complexo. AppiNitip (B.y-imidoade. ‘nosina 5 trifstaro) © complexo F, cue constitui o poro de protons ¢ composto de trés subunidades a, b ecem uma proporgio abzeyaA subu nidade c é um polipeptideo pequeno (iM; 8.000) muito hidrofo- bico, constituido fandamentalmente por duas hélicestransmem- brana, com uma pequena volta xe projetando do lado da matriz na membrana, A estrutura cristalina da FF; de levedura, dedu- Zida em 1999, mostra o arcanjo das subunidades c. Existem 10 subunidades nas leveduras, cada uma com duas helices trans: membrana quase perpendiculares 20 plano da membrana e ar- ranjadas em dois creulos coneéntricos (Fig, 19-224, e). O circu: lo interior & composto das hélices aminoterminal de cada subu- nidade ¢. O circulo exterior, de cerca de 55& de dismetro, ¢ formado pelas helices caboxiterminais, As subunidades ¢ €7 de F, formam uma pernace-pé que se projeta do fundo (membra- ra) da F ¢ se apbia firmemente no anel das subanidades ¢, Um desenho esquemtico (Fig. 19-22f) combina a informagao es- trutural dos estudos da FoF, bovina e de levedura, A catalise rotacional é a chave para o mecanismo de mudanga de ligagio para a sintese do ATP Baseaclo em detalhtados estudos cinéticos ede associacio de ligan: tes,da reagao catalisada pels FF), Paul Boyer propds um mecanis. mo no qual 0s trés sitios ativos de F, giram catalisendo a sfates de ATP (Fig. 19-23). Lima subunidade R comeca naconformagao P-ADP, que liga ADP € P, do meio circunvizinho. A subunidede suds entio de conformagio, assumindo a forma B-AT?, que liga firmemente e estabilize 0 ATP, eferuando um equilibrio imediato do ADP + P, como ATP na superficie da enzima. Finalmente, a subunidade muda para a conformacio B-vazia, que tem baixa afi- nidade pelo ATP, ¢ 0 recémsintetizado ATP deina « superficie da enzima, Uma nova rodada da catdlise comega quando essa subu- nidade assume « forma B-ADP e liga ADP ¢ P. Pau Boyer ‘As mudangas conformacionais fundamentais para esse me- canismo sao dirigidas pela passagem dos protons atravésda por do Fda ATP sintase. A corrente de prétons através do“poro” F, provoca ¢ rotasio do cilindro de subunidades ce da subunidade + aele ligada, ao redor do eixo da subunidade y, que ¢ perpendi- cular ao plano éa membrana. A subunidade yatravessa 0 centro do esferdide a9 que € mantido estaciondrio em relagdo & su- perficie da membrana pelas suburiidade b;€ 6 (Fig. 19-22f]. cada 120° de rotagdo, y entra em contato com uma subunidade B diferente e esse contato forga essa subunidade fa assumir a conformacio Bevazia {As trés subunidades P interagem de tal modo que, quando ‘uma assume a conformacao f-vazia, a sua vizinka de um lado deve assumir a forma B-ADP, ¢ ¢ outra vizinha, a forma B-ATP. Desse modo, uma rotacao completa ca subunidade 7 provoca uma mudanga da subsmidade 8 nas trés conformacdes possiveis esa cada rota;ao completa, tres ATP so sintetizados e liberados na superficie da enaima. 531 Uma forte predicao desse modelo de mudanga de ligacao € que a subunidade y deve rodar em uma direcdo quando F,F, estd sintetizando ATP, e, na diregao oposta, quando a enzima esté hidrolisando ATP. Essa predicao foi confirmada por meio de experimentos clegantes nos laboratériosde Masamitsu Yoshi- da e Kazuhiko Kinoshita Jr. A rotacdo dey em uma tinica mole- cula de F, foi detectada microscopicamente ligindo-se um lon- g0, fino e fluorescente polimero de actina a y ¢ a aguardando a mover-se em relagao a cus imobilizada em uma lamina de mi- croscépio, & medida que 0 ATP era hidrolisado. Quando todo 0 complexo FE; (e nao apenas F;) foi usado em um experimento similar, 0 anel de subunidade e girou com y (Fig. 19-24). A“has- te” girou na direcao prevista de 360°, A rotagao nao foi tae regu lar, mas ocorreu em trés discretos passos de 120°. Conforme ja calculado a partir de velocidade de hidrélise do ATP por uma molécula de F,¢ 0 arraste friccional no longo polimero de act ina, a eficiéncia desse mecanismo em converter energia quimica ‘em movimento & quase 100%. Segundo Boyer, ela € “uma es- pléndida méquina molecular’, © acoplamento quimiosmético acarreta uma estequiometria nao inteira de consumo de 0, sintese de ATP Antes da aceitacao geral do modelo quimiosmotico para a fos- forilagio oxidativa, sesamia-se que a equacio da reacio global teria @ seguinte forma: ADP 4 P.-x({)0, + #HY 4 sNADH— ATP 4+H,0 + xNAD! (19-11) ‘onde o valor de x, 4s vezes chamado razio P/O ou razio P/2e", sempre era um mimero intciro, Quando mitocéndrias intectas, sao suspensas em uma solueao contendo um substrato oxicavel tal como o succinato ou NADH e é fornecido Oz, a sintese de ATP, bem como a diminuigo do O;, podem ser medidas ra- pidamente. Entretanto, a medida de P/O & complicaca pelo fato de que a mitocéndria intacta consome ATP em muitas reaydes, que ccorrem na matriz © consome O; para propésitos outros que no a fosforilagio oxidativa. A maioria dos experimentas produz razses P/O (ATP para 02) maiores que 2, quando o NADH 6 0 doador de elétrons, e maiores que 1, quando o succi- rato é o doadar. Considerado-se que P/O deve ser um valor in- teiro, a maioria dos pesquisadores concorda que a razao P/O deveria ser 3 para o NADH e 2 para o succinato. Durante anos, cesses valores foram encontrades em artigos de pesquisas ¢ em. livtos-texto, Com a introdugio do paradigma quimiosmético para 0 acoplamento da sintese do ATP a transferéncia de elétrons, nto existe nenhum requisite tebrice para a razao P/O ser inteira. AS questdes relevantes sobre a estequiometria tornam-se: quantos prétons sio bombeados para fora por meio da transferéncia de ‘létrons de um NADH para 0 O; e quantos protons devern en- ‘rar por meio do complexo FF; para proporcionar a sintese de uma molécula de ATP? A medida do fluxo de prétons é tecni- camente complicada, Deve-selevar em consideracao a capa de tamponante da mitocOndria, 0 vazamento nao produtivo de prétons através da membrana interna e 0 uso do gradiente de protons para fungoes diferentes da sintese de ATP, como, por exemplo, o transporte de substratos através da membrana mi- tocondrial (descrito a seguir). O valor de consenso para 0s pré tons bombeados para fora por par de elétrons ¢ 10 para o NADH 6 para 0 succinato. O valor experimental mais aceito para 0 rmimero de protons requeridos para proporcionar a sintese de uma molécula de ATP € 4, dos quais | € usado para transportar B, ATP © ADP através da membrana mitocondrial (ja a s¢- auir), Se 10 protons sio bombeados para fore por molécula de 532 Figura 19:22 - Complexo da ATP sintase mitocondirlal, (a) Etrutura do corpleno Fy ded 2ida 2 partr de estudos crstalogratics e bioqumices. NaF), tres Suburidades w e tes fs estaa arranjacas como os gomos de ua laranja, com alterndncla das subunidades « (sombreado Cinea} e B (sombreado pirpura) 20 recor de urna haste central, a subunidade + (verde). (b) Fetiuturacritaina de Fy vista de lac, Duat subunidaces «0 uma i foram remewidas para mmestrar a haste central Subunidade y| ¢ 0: stios de igacio para o ATP (verrelhol e ADP (ama rele) cas subundades fs subunicade & ex ndo esta mostradas agus () f vsa per cima (sto €, do ado da membrana), rrostiero as Les subunidaces a, as 1 f ¢ @ haste Central OU: ridade 7) Em cada subundade f, pero da sva interface com a subundade avira, existe um sltia ce ‘igacao pera 0 nucleatidea que ¢ crltco para a atvidade cataltica. A Gnica subundade vyassocie-5e fundamentaliente a um des trés pares a, forcando cada uma das tes subunida es la atsumir canformagber lgeiramarte diferertas, com diferantes skios de ligagSo para rrudectideos. Na enamra cestaina, uma subunidace (pADP) apresenta © ADP (amarelol em seu sitio ce igacio, a proxma {B-ATP) contém o ATP {vermelho), © 8 teceira (-vazial nde contem henhur nuckotices igado, (€} Vistalateral daestrutura da FF, Talase de ure corrposkao, fa qual as coordenadas cistalograticas de F) mitocondral bovina (sorbreadas em purpura & ‘onza) forarn combinadas corr da F, mitacondrial de levedura (sorroreadas em amarelo & laranial. As subunigades a, b. 7 ec nao fazem parte ca esirutua cristalina mostrada aqui (Contnea, pag. sequirte | Lae Su lo wo fa) ih Figura 19.22 (continuacde) ~e) Est utura a Ff de levecura vista part da bese na deco doadoP nara © edo N. As estuturas mares, ‘et cesiasecio tans, sho asin Paes varsmembrana le Cad ima desde sumnacesearanadas om ros concn | terra co compleo FF, deus pari estos hoqumes ¢ cieslogiafes Asse svbundase bd 58 soca frmemerte 3s | suburidades. e f de, mantendo-c5 fxs ere rage 8 membrana. Em fy, 0 clind de subunidadesc, embebico na membara,e3 igada ‘haste constuida pels subunidadesy ede F. A medida que os protons fuer atievés Ga memotena do lao Fpate ladon, va 0 lindo fa haste rocam e as Suburi e Fy mudem de canforragao a medida que a suburigade se assoca a cada uma Cel. BH} BHR, Figura 19-23 - Modelo da mudanca de ligacio para 2 ATP sintase. © corrplexo F, tem ttés stios nao equivalentes nara.a igacto des nurlotideos de adenina, ur para cata par de subunidades « 0 Em umm dado momento, um desses sins esta na conformagio BHAT (que liga ATP frmemente), um segundo esta na conformecdo B-ADP lligacde flaca) e ur terceio ests ne conformacso f-vacie {igacéa musto frexal. A forge praton motiz provace a rotacao da haste cenval a subunidade y, mastrade corno urva seta verde) que entra emi comtato com cada um dos pares de suburidades a sucessivamente. sso acareta uma mudanga conforrraconal cooperatva, na qual O sito BHAT & convertdo ra conformagao f-vazia & 0 ATP ¢ lterado, O sito BRADP & convertdo na conformacae [LAP que promove a condensacao de ADP +P, lgadosa ela, para formar ATP. A conformacdo f-iavia se trarsforma em um sto ADP. que liga fracamente AD? e P. provensentes dosolvente, O modelo, baseade em resutados experimentais, requer que, pelo menos, dois dos tr@ssiios catalticos se alternem em atvida- de. © ATP nao pode sar iborado do um stio se © at6 que ADP 6 P,estejam ligadas a0 outa sto, 534 Eilamentoe de acting Figura Fey. Fy, goneticamente construlda, contendo um certo nimmero de residuos de His adere firmemerite a ura lsmina de microscépio coberta com um complex de Ni. biotina € ligada covalentermente a subunidade c A proveina avidine, que se liga fimmemente a biotina, € ligada covalentemente 4 fongos famentos de acina marcados corn uma sonda fluorescente, 4 ligagdo da biotina 2 aviaina une os flamentos de actina com a subunidade c. Quanco 9 AT? ¢ adiionado para estimuar a atmdade ATPase da F;, observa-se 0 fiamento marcado grar continuamente em ura direcao, demmonstiando que o ciindro de subunidades de, gra. Em outro expermento (no mosirado),a iqacSo do filamento de actna diretamente na subunidade y mostrou que ela tamoém gra Provavelmente, 0 clindso e a haste se movem como uma unidade. NADH e 4 devem entrar para produzir um ATP, a razio PIO baseada em protons ¢ 2,5 para oNADH como doador de eiétrons € 1,5 (6/4) para o succinato. Serao usados os valores de P/O de 25 1,5 a0 longo deste livro, mas os valores 3,0.¢ 2,0 ainda sto encontrados na literatura bioquimica. A palavra final acerca da estequiometria de prétons provavelmente nao sera escrita até ‘que 05 detalhes completos de mecanismo de teagio da FF; se jam conhecidos. A forga proton motriz energiza o transporte ativo Embor: 0 papel primario do gradiente de prétons na mitocén. ria ¢ fornecer energia para a simese do ATP, a fora proton motriz também comanda véries processos de transporte essen-

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