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VISÃO GERAL DOS PROCESSOS DA GENÉTICA MOLECULAR

Os ácidos nucleicos são moléculas vitais responsáveis pela função celular. Estes, no geral, são
polímeros de nucleótidos. Estas macromoléculas contêm a informação para determinar a
sequência de aminoácidos e a função da proteína que se irá formar. Catalisam um número
fundamental de várias reações químicas nas células, incluindo a regulação da expressão dos
genes.

O DNA é uma molécula que contém a informação necessária para a produção de todas as
proteínas do organismo. Porções da sequência nucleotídica são copiadas em moléculas RNA
mensageiro (RNAm) que são diretamente sintetizadas numa proteína específica. Esta síntese
baseia-se em dois processos: transcrição e tradução da informação genética inicial contida no
DNA. A molécula de RNAm é lida por uma nova molécula de RNA, o RNA transferência – RNAt.
Este processo contém a ajuda do RNA ribossomal – RNAr – que promove a associação de
vários componentes.

Composição química do DNA: polímero de unidade repetidas de fosfato, açúcar (pentose


desoxirribose) e bases (pirimidinas ou purinas).

Estrutura dos Ácidos Nucleicos

Os ácidos nucleicos são polímeros de unidades


complexas chamadas nucleótidos. Cada
nucleótido é um agrupamento molecular
formado por três subunidades: uma base
azotada, um açúcar com cinco átomos de
carbono e um grupo fosfato. As bases azotadas
classificam-se em dois grupos: as bases púricas,
cujo componente central da molécula possui
dois anéis, e as bases pirimídicas, que contêm
apenas um anel central. As bases púricas são a
adenina e a guanina. A citosina, a timina e a
uracila (ou uracil) são as bases pirimídicas.
Destas bases, 3 são encontradas tanto no DNA
como no RNA (A,C e G), a T apenas é
encontrada no DNA e a U é encontrada no RNA.
Outra diferença entre o DNA e o RNA baseia-se
no açúcar, o DNA contém uma desoxirribose e o
RNA uma ribose (contém mais um oxigénio do que o açúcar do DNA). A acidez dos nucleótidos
deve-se ao grupo fosfato que, nas condições intracelulares normais, liberta o ião H+, deixando
o fosfato carregado negativamente.

A estrutura química destes nucleótidos mostra um grupo hidroxilo na terminação 3’ e um


grupo fosfato na terminação 5’. A ligação química entre nucleótidos adjacentes é chamada de
ligação fosfodiéster.

O DNA e a sua dupla hélice

O modelo de Watson e Crick propunha que o DNA era constituido em duas cadeias
polinucleotidicas que se enrolam em torno de um eixo formando uma dupla hélice. Os
esqueletos de açúcar-fosfato encontra-se virado para fora e as bases projectadas para dentro
(hidrofóbicas). A orientação destas cadeias é antiparalela, ou seja, a sua direcção 5’-3’ é
oposta. As cadeias são unidas devido à sua complementaridade de bases, isto é, a A liga-se à T
com duas ligações de hidrogénio e a base G é emparelhada com a C através de 3 ligações de
hidrogénio. Ligações hidrofóbicas e interacções van der Waals entre as bases adjacentes
estabilizam a estrutura da dupla hélice. A estrutura em dupla hélice possibilita o mecanismo de
replicação do DNA.

Regra de Chargaff

A composição em bases do DNA é sempre igual independentemente da idade, estado


de nutrição ou mudanças ambientais. O DNA de diferentes tecidos tem todo composição igual
de bases. Erwin Chargaff chegou à conclusão que a quantidade de Adenina é igual à de Timina
e a de Guanina é igual à de Citosina, independentemente da espécie.

ORGANIZAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO

Introdução

A organização do genoma numa célula ocorre por associação do DNA com várias
classes de proteínas, atingindo o máximo de compactação durante a mitose ou meiose.
Durante estes dois períodos, são visíveis os cromossomas formados por dois cromatídeos
unidos por uma estrutura designada centrómero. A descondensação do DNA em cromossomas
e a existência de estruturas, como o centrómero e o telómero, são essenciais para a
viabilidade celular, pois deles depende a distribuição equitativa do material genético durante a
divisão celular.

O DNA celular contém tanto genes codificantes como regiões não codificantes.
Genomas complexos exigem uma maior complexidade na organização cromossómica.
Um gene é definido como uma porção do cromossoma que determina um único carácter ou
fenótipo. O DNA contém outros segmentos que apresentam funções reguladoras, estas podem
fornecer informações que influenciam a transcrição dos genes.
O termo “cromossoma” é usado para se referir à molécula do ácido nucleico onde está
depositada a informação genética. Os cromossomas aparecem durante a divisão mitótica,
quando a célula não se está a dividir, o material genético, chamado de cromatina, não se
encontra condensado. Portanto, à medida que as células se preparam para dividir, a cromatina
condensa-se e organiza-se num número bem definido de cromossomas.
A cromatina consiste em fibras de proteínas e DNA. O DNA na cromatina está
fortemente associado a histonas, que empacotam e ordenam o DNA em unidades estruturais,
chamadas de nucleossomas.
As histonas são proteínas que se associam ao DNA eucariótico. São ricas em
aminoácidos básicos que lhes confere carga positiva, estas contactam com os grupos fosfato
carregados negativamente do DNA.
Quando a cromatina é extraída do núcleo e examinada ao microscópio electrónico, a
sua aparência depende da concentração de soluto a que é exposta. A baixas concentrações de
Mg2+, a cromatina encontra-se estendida como se fosse um “colar de contas” (imaginem que
as contas são os nucleossomas e o fio do colar o DNA linker. A cromatina isolada em altas
concentrações iónicas encontra-se condensada.
A organização celular é essencial devido ao grande comprimento nuclear de DNA. A
tarefa da compactação e organização celular deve-se às histonas. O complexo de histonas e
DNA é chamado de cromatina. Quando a célula não se encontra em divisão mitótica esta
encontra-se dispersa no núcleo, mas durante a fase mitótica encontram-se visíveis os
cromossomas.

Diâmetro do núcleo das células eucariotas animais: 5-10 μm

Comprimento do DNA genómico: 1,5 m

Múltiplos níveis de organização:

 DNA cromossomal
 Nucleossoma
 Nucleossomas em cadeia
 Fibra de cromatina – complexo de
DNA compacto, proteínas histonas
(mais abundantes) e proteínas não
histonas
 Cromossoma (metáfase)

Arquitetura da cromatina

Importância biológica:

A arquitetura da cromatina influencia as


funções nucleares.

Replicação, recombinação, reparação e transcrição

Múltiplos níveis de condensação:

 Eucromatina ou cromatina ativada


o Porções de cromatina menos condensadas, incluindo regiões de transcrição
o Acessível à transcrição
o Envolvida na síntese proteica
o Predominante durante a interfase
 Heterocromatina ou cromatina condensada
o Regiões da cromatina que se mantêm altamente condensadas e inativas à
transcrição durante a interfase
o função principal: envolvimento da adição de proteínas às histonas
o Mais frequente nos centrómeros e telómeros dos cromossomas
 Facultativa: condensação depende do tipo de célula e estágio de
desenvolvimento
 Constitutiva: condensação e inatividade permanente

Resumo das várias fases do processo de enrolamento do DNA


1. O DNA é enrolado à volta das histonas para formar uma cadeia de nucleossomas, cadeia
essa que se mantêm linear

2. A cadeia de nucleossomas enrola-se numa estrutura solenoide que é estabilizada pela


histona H1.

3. A estrutura solenoide é condensada por arranjamento em vários loops

Estrutura da cromatina

O DNA não se encontra livre, mas sim associado a catiões de baixo peso molecular, que
podem ser metais divalentes, de e poliaminas e proteínas. As interações são de natureza de
natureza electroestática de forma que o anião fosfato internucleotídico carregado
negativamente seja neutralizado por estes compostos carregados positivamente, ou pelos
resíduos de AA básicos. Estas interações resultam na condensação do DNA (compactação). O
DNA associado a histonas dá origem à cromatina.

Histonas

 Família de pequenas proteínas


 Proteínas associadas ao DNA eucariótico mais abundantes
 Ricas em aminoácidos básicos (arginina e lisina), que lhe conferem carga positiva e
contactam com grupos de fosfato do DNA carregados negativamente
 O enrolamento do DNA requer uma molécula de histona H1 por nucleossoma e a
enzima topoisomerase II
 Tipos principais: H1, H2A, H2B, H3 e H4
 Core histones (histonas nucleares - fazem parte do núcleo do nucleossoma, não
confundir com núcleo da célula): H2A, H2B, H3 e H4
 H1 – histona ligante
 As sequências de AA da H2A, H2B, H3 e H4 são muito semelhantes entre si e entre
espécies muito diferentes
 Cada histona nuclear contém uma cauda ou N-terminal – NTD’s – envolvidas em
diferentes aspetos da estrutura e função da cromatina (essenciais para a compactação
da cromatina)

As caudas NTD’s das histonas não são observáveis: não têm uma estrutura definida,
encontram-se “para fora” no núcleo e são móveis. A superfície do nucleossomas providencias
uma estrutura de interface bastante larga para interações entre proteínas. Como dito, as
NTD’s são os domínios de interação proteína-proteína e proteína-DNA e são constituídas por
aproximadamente 30 aminoácidos.
Cada uma das histonas (H1,H2a, H2b,H3,H4) pode existir em diferentes formas porque as
cadeias laterais podem ser modificadas por metilação, ADP-ribosilação, fosforilação ou
acetilação. Tais modificações alteram a carga elécrica, a forma e outras propriedades das
histonas, com como as propriedades estruturais e funcionais da cromatina, possibilitando uma
regulação do metabolismo do DNA/RNA.

Modificações de pós-tradução das histonas

 Afetam a forma, carga elétrica e outras propriedades das histonas


 Modificam as propriedades estruturais e funcionais da cromatina
 Regulam o metabolismo DNA/RNA, por condicionarem as interações nucleossoma-
nucleossoma
 Incluem:
o Acetilação
o Metilação
o Fosforilação
o Ubiquitinação
o Etc.

Acetilação

Um dos aminoácidos básicos constituintes dos NTD’s é a lisina. Adicionando um grupo acetil à
lisina, a carga desta fica neutralizada, inibindo a interação com o DNA. Quando isto acontece, a
cromatina tende a ficar numa conformação menos condensada, favorecendo os fenómenos de
transcrição e replicação.

Este processo é levado a cabo pela HAT –


Histone acethyltransferase – faz a
transferência do acetil da Ac-CoA para a
lisina; e pela HDAC – Histone
deacyltransferase – transfere o acetil da
lisina para a CoA. Assim, as HAT podem
ser chamadas de ativadores de
transcrição, enquanto as HDAC são vistas
como repressoras desta.
o Acetilação da lisina das cadeias laterais neutraliza as cargas positivas da lisina e
inibe a interação com as cargas negativas do DNA
o Assim, a acetilação das NTD’s diminui a probabilidade de condensação da
cromatina
o Enzimas
 Histona acetiltranferase (HAT) – Ac da Ac-CoA para lisina
 Catalisa a acetilação de histonas e atua como ativadora da
tradução
 Histona deaciltransferase (HDAC) – Ac da lisina para CoA
 Catalisa a deacetilação de histonas e atua como repressor da
tradução
 Os inibidores farmacológicos da HDAC mantêm a acetilação de
histonas e, por isso, contêm cromatina menos condensada

Metilação

É um processo baseado na
transferência de grupos
metilo para os
aminoácidos das histonas,
tal como acontece com a
acetilação, a metilação de
histonas tanto pode
aumentar ou diminuir o
processo de transcrição de
genes.

As histonas podem ser


metiladas tanto no
aminoácido lisina como a
arginina, apesar de ser
mais frequente utilizando
a lisina. Cada grupo metilo
que é adicionado requer
um conjunto de enzimas
específicas que incluem a
PRMT – arginine
methyltransferase (para a
arginina) e a HMT –
histone methyltransferase
(para a lisina).

Resumo geral
Nucleossoma

O nível mais simples de organização da cromatina


consiste no enrolamento local para esquerda de pequenas
regiões de DNA, 147 pb de comprimento, em torno de um
complexo proteico octamérico de histonas, duas moléculas de
cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4. Esta estrutura é
designada como domínio central do nucleossoma.

 Unidade fundamental da cromatina: estrutura de 10 nm


 Nucleossoma nuclear: octâmero de histona + 147 pb
DNA (menos de 2 voltas)

2 H2A + 2 H2B + 2 H3 + 2 H4

 DNA enrolado à volta do histona octamérica


o Primeiro nível de compactação do DNA
o Barreira de acessibilidade ao DNA
 No contexto da arquitetura da cromatina
o As NTD’s da histona nuclear não são observadas; são móveis e destruturadas
o A superfície dos nucleossomas fornece uma grande interface para interações
proteína-proteína
o As NTS’s são sítios de acetilação, metilação e outras modificações de pós-
tradução
o As NTD’s são os domínios externos de interação proteína-proteína e proteína-
DNA
o As NTD’s são cadeias estendidas de polipéptidos de ~ 30 AA

Cadeias de nucleossomas

 Conformação em “colar de pérolas”: complexo DNA+histonas nucleares espaçadas


aproximadamente por 200bp diferentes ao longo da molécula de DNA
 Nucleossoma + “linker” = 160 a 200 bp em diferentes organismos
 Estruturalmente dinâmicas
 Este substrato é essencial para fenómenos como a transcrição e a replicação
 A estrutura dobrada de 30 nm é uma “2-satar helix”: o linker DNA liga duas pilhas de
nucleossomas arranjados
 A conformação de 30 nm formada por cadeias de nucleossomas endógenos é mais
irregular
 Catiões alteram o equilíbrio a favor dos estados dobrados
 Uma grande concentração iónica promove a condensação
 Sob as condições fisiológicas de sal, as cadeias de nucleossomas estão em equilíbrio
entre 2 conformações extremas, devido à neutralização de cargas através dos catiões
(entre nucleossomas da mesma fibra ou entre fibras diferentes).
 A estrutura em “colar de pérolas” é apenas observada in vitro na ausência de sais

Refere-se ao diâmetro de cada “pérola” (> diâmetro; > compactação)

Dobramento de cadeias de nucleossomas


 O dobramento é conduzido por neutralização de carga do DNA dependente de catião e
interações nucleossoma-nucleossoma intra-fibras
 Estas interações também são mediadas pela ligação do domínio de cauda da H4 a uma
região específica na superfície dos nucleossomas vizinhos

Fibras de cromatina

 Dobramento de fibras mediado por proteínas


 As fibras intrínsecas de 30 nm estabilizadas por histonas linker tem um arranjo “cara a
cara”
 Na maioria das regiões do genoma, as cadeias de nucleossomas são complexadas com
um conjunto específico de proteínas para formar as fibras de cromatina
 Por isso, há vários tipos diferentes de fibras de cromatina
 Exemplos:
o Histonas linker (H1) – estabilizam a cromatina (proteína ligante)
 estabilizam as estruturas dobradas de 30 nm
 Têm uma porção que interage com o nucleossoma e outra que
interage com o DNA linker para possibilitar a conformação do
nucleossoma

o HMGs (high mobility group)


 pequenas proteínas que se ligam à cromatina (2 HMG : 1
nucleossoma)
 Quando as HMGs estão ligadas às cadeias de nucleossomas, o
equilíbrio move-se a favor de uma conformação menos dobrada e
mais acessível
 Estas tendem a descompactar o DNA, aumentando a sua
acessibilidade
 Os locais de ligação no nucleossoma para as HMGs e H1 sobrepõem-se
 HMGs e linker histones estão em competição
 HMGs são antagonizam a função da H1
o Proteínas de heterocromatina
 Estas são importantes componentes na compactação da
heterocromatina, rica em centrómeros e telómeros.
 Estas podem interagir com os componentes de modificações
estruturais de histonas, como a metilação, favorecendo a condensação
e compactação do DNA.
o Fatores/enzimas de transcrição

Para além das histonas e de toda a sua importância com o nucleossoma, este também
se pode associar a proteínas não histónicas, para facilitar a sua tarefa nos processos de síntese
proteica. Os nucleossomas, juntamente com outras proteínas não histónicas formam as fibras
de cromatina. Devido aos diferentes tipos de
associações com diferentes proteínas existem
vários tipos de fibras de cromatina.

Resumo

A imagem em baixo faz um resumo das


proteínas/enzimas que
favorecem/desfavorecem a compactação do
DNA e a sua consequente transcrição de genes.
Enzimas como a HAT, HMT, HDAC, HP1, já foram
faladas em cima.

Mecanismo de remodelação da cromatina

A cromatina tem uma organização compacta que conduz à inacessibilidade estrutural e,


consequentemente, à inativação funcional da maior parte das sequências. A cromatina
ativamente transcrita apresenta-se sob uma forma menos empacotada.
As modificações pós-tradução da cromatina são os componentes-chave da expressão dos
genes, permitindo estabelecer uma relação entre os estados de condensação da cromatina e
os níveis de transcrição. Esta informação de gene ativo ou inativo reside primariamente nas
caudas aminoacídicas terminais das quatro histonas que formam o domínio central dos
nucleossomas. As caudas destas proteínas estão expostas à superfície dos nucleossomas,
encontrando-se sujeitas à ação de várias enzimas capazes de introduzir modificações pós-
tradução de alguns AA. As modificações mais comuns consistem na acetilação dos resíduos de
lisina, metilação dos resíduos de lisina e arginina, fosforilação dos resíduos de serina e
ubiquitinação das histonas. Estas modificações das histonas não constituem apenas uma forma
de reorganização da cromatina, mas também providenciam uma fonte importante de
informação epigenética. Algumas lisinas (K) e argininas (R) podem ser metiladas na região N-
terminal das histonas H3 e H4 por ação de enzimas, genericamente designadas
metiltransferases das histonas (HMT). No caso dos eucariotas superiores, há duas lisinas das
histonas H3, K4 e K9, que podem estar metiladas. Estas duas modificações apresentam,
aparentemente, funções antagónicas: em regiões que estão a ser ativamente transcritas, a
histona H3 apresenta-se enriquecida em metil-K4; mas em regiões silenciadas
(heterocromatina), a histona H3 apresenta o K9 metilado. Estas alterações pós-traducionais
das histonas são acompanhadas pela ligação específica de outras proteínas como é o caso da
hisotna HP1 (proteína heterocromática-1) que se associa à cromatina, conduzindo à sua forma
silenciada. As caudas N-terminais da histona H3 constituem os locais de ligação preferencial do
complexo proteico de remodelação e desacetilação da cromatina.

O controlo da condensação do DNA é, assim, mediado por interações proteína-cromatina,


influenciadas também pela acetilação de histonas e pela metilação do DNA.

Cromossomas

 A cromatina condensa em cromossomas


 In vitro equivalente de condensação global: oligomerização fibra-fibra
 As cadeias de nucleossomas cooperativamente associam-se entre si em oligomeros de
cromossomas
 A oligomerização é conduzida por interações nucleossoma-nucleossoma dependentes
de NTD das histonas nucleares e é facilitada por linker histones
 Algumas proteínas de ligação dos nucleossomas podem “cross-link” fibras de
cromatina individuais em supraestruturas oligoméricas maiores

A associação dos nucleossomas é feita por um processo chamado de oligomerização, que é


baseado em interacções nucleossoma-nucleossoma. Estas interacções dependem das NTDs
das histonas e são facilitadas pelas histonas de ligação. No final temos uma estrutura
oligomérica.

Arquitetura de maior nível da cromatina

 Dobramento de cromatina de maior nível


 Cromossomas de interfase consistem em diferentes tipos específicos de estruturas de
cromatina secundárias e terciárias

Importância da arquitetura da cromatina

 A cromatina existe para mais do que a condensação do DNA no núcleo


 Também é essencial para a regulação adequada da transcrição e de outros processo
que envolvem o metabolismo do DNA no núcloe
 Interações nucleossoma-nucleossoma hierárquicas conduzem à condensação das
fibras de cromatina e mecanismo devem existir para que as cadeias de nucleossomas e
as fibras de cromatina condensem sob condições fisiológicas
 Mecanismos que suportam a condensação de cadeias de nucleossomas e de fibras de
cromatina sob condições fisiológicas
o As NTDs das histonas nucleares medeiam as interações nucleossoma-
nucleossoma intra-fibra e inter-fibra intrínsecas que levam à condensação
local e global das cadeias de nucleossomas
o Certas proteínas de ligação dos nucleossomas possuem a capacidade de
condensar localmente e globalmente a estrutura de cromatina
o Dependendo da composição macromolecular específica de uma fibra de
cromatina, várias estruturas secundárias e terciárias de cromatina diferentes
existem nos cromossomas

A arquitectura cromossómica é um fenómeno importante pois mecanismos como a


regulação da síntese proteica são feitos através da condensação cromossómica. A
condensação e compactação do DNA é essencial para os mecanismos fisiológicos da célula.
Assim, esta deve-se a fenómenos físicos, metabólicos e funcionais.

Concluindo, a organização do DNA é importante pois o seu grau de compactação


também regula o processo de transcrição. Uma enzima como a Polimerase II não consegue
aceder ao DNA para iniciar a transcrição, este tem de ser minimamente descompactado para
esta se processar. Os níveis de compactação do DNA também pode regular o metabolismo do
DNA condicionando as interacções entre nucleossomas (alterando as NTDs que são as
responsáveis pela “formação” dos nucleossomas).

Transcrição da cromatina

Histonas e a estrutura da cromatina regulam a transcrição de certos genes em alguns ou todos


os níveis de arquitetura.

Mecanismos de remoção de nucleossoma