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Disciplina: Microbiologia e
Imunologia
2009
Laboratório de Microbiologia
c.4) Tétrades:
d.1) Cocobacilos
e) Espirilos
Leptospira sp Borrelia sp
f) Víbrios
Bacilos e espirilos apresentam-se, normalmente, como células isoladas, porém,
aocasionalmente pode-seobservar bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeias
(estreptobacilos).
Esta coloração é bastante utilizada porque a maioria das bactérias cora-se por este
método, permitindo observar sua morfologia e fornecendo informações a respeito do
comportamento do material celular diante de corantes básicos (corantes do Gram).
Método
A coloração de Gram é melhor realizada quando o material vem da placa de cultivo
e não do meio de cultura líquido que pode trazer muitos debris celulares. Para realizar a
coloração deve-se primeiramente pingar uma gota de salina sobre uma lâmina de
microscopia e em seguida espalhar um pouco da colônia bacteriana, com o auxílio de uma
alça ou agulha de inoculação, nesta gota. Em seguida, os seguintes passos devem ser
realizados:
1. Fixar o esfregaço pelo calor passando-se a lâmina na chama do bico de Bunsen;
2. Cobrir o esfregaço com cristal violeta e esperar 1 minuto.
3. Lavar rapidamente com água destilada.
4. Cobrir o esfregaço com lugol (iodo) e esperar 1 minuto.
5. Lavar rapidamente com água destilada.
6. Cobrir o esfregaço com álcool: acetona (1:1) e esperar 30 segundos.
7. Cobrir o esfregaço com fucsina e esperar 1 minuto.
8. Lavar rapidamente com água destilada e secar a lâmina a TA.
9. Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço corado.
10. Observar em objetiva de imersão (100X resultando em um aumento final de 1000X).
Notas:
a) O etanol pode ser usado com um agente descorante fraco;
b) O material dos corantes empregados na técnica, principalmente sedimento do cristal
violeta, poderá aparecer como artefato;
c) O descoramento para mais ou para menos é resultante da utilização incorreta do
descorante (álcool: acetona);
d) A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram.
Culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-
negativas.
e) Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar
danos à membrana das células, como, por exemplo, alterando a permeabilidade aos
solventes (álcool:acetona ou éter:acetona). Conseqüentemente, o complexo iodo-
cristal violeta poderá ser retirado da célula.
f) Caso surja um questionamento quanto à coloração positiva ou negativa do Gram,
uma coloração paralela utilizando-se culturas conhecidas como Gram positiva
(Staplylococcus aureus) e negativa (Escherichia coli) devem ser usadas como
controles.
3) Álcool acetona: 800 mL de álcool; 200 mL de acetona. Misturar as duas soluções. Éter
acetona: 500 mL de éter e 500 mL de acetona. Misturar as duas soluções. Guardar em um
recipiente com vedação já que as duas substâncias são voláteis.
Meios de Cultura
a) Quanto à consistência
Líquido: Tioglicolato, Infusão de coração e cérebro (BHI)
Semi-sólido: Sulfeto indol motilidade (SIM)
Sólido: agar sangue (AS), ágar manitol salgado (MSA)
b) Quanto à função
Enriquecedor: BHI e AS
Seletivos: MSA e MacConkey (MC)
Diferenciadores: MC e AS
Manutenção: Ágar nutriente (NA)
Meio líquido: é aquele em que os nutrientes estão envolvidos em uma solução aquosa;
Meio semi-sólido: este meio possui na sua composição, além dos nutrientes, uma
pequena porcentagem de agar;
Meio sólido: é um meio que possui na sua composição nutrientes e uma quantidade de
agar maior do que o semi-sólido. Em torno de 1,5% (1,5g em 100mL);
Meio contendo
Agar carne moída
sangue (chopped meat)
Meio seletivo: é aquele que contém substâncias que inibem o crescimento de certos
microrganismos, porém seleciona aquele de interesse. Dentre as substâncias inibidoras
estão o cristal violeta, cloreto de sódio, etc.;
MacConkey
Controle da Qualidade
Conceitos importantes: