Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre

Departamento de Ciências Fisiológicas

Disciplina de Farmacologia Básica e Clínica

PROJETO DE ENSINO:

AULAS PRÁTICAS DE FARMACOLOGIA PRÉCLÍNICA

Professores participantes: Helena Maria Tannhauser Barros – Professora Titular

Cláudia Ramos Rhoden – Professora Adjunta
Denise Conceição Dantas Ruiz - Professora Adjunta
Rosane Bossle Bernardi – Professora Substituta

Técnicos de Laboratório: Maria Letícia Vasques

Mario Serapião Pereira
Alexandre Maslinkiewski

Alunos de Pós-Graduação
Monitores

Objetivos gerais:
 Conhecer e aplicar os métodos empregados para teste pré-clínico de medicamentos,
conforme a legislação brasileira e internacional
 Conduzir trabalho científico pré-clínico em todas as etapas, desde a execução dos
experimentos, coleta de dados, análise estatística dos dados, elaboração de trabalho escrito,
aplicando conhecimentos básicos de informática
 Treinar apresentação de trabalho científico em atividade semelhante à apresentação oral
de evento científico

Objetivos secundários:
 Integrar os conhecimentos teóricos apresentados sob a forma de aulas teóricas e
seminários com a observação do efeito dos fármacos em espécies animais (ver Anexo I)
 Mensurar o efeito de fármacos administrados aguda ou cronicamente

Desenvolvimento das atividades práticas:

Durante o primeira série da Disciplina são realizadas, dentre outras atividades, aulas
práticas nas terça-feira das 16 às 18 horas para as Turmas A e B e nas quintas-feiras das
16 às 18 horas para as Turmas C e D. A cada dia da semana são alternadas as turmas.
Nestas aulas os alunos de cada turma são agrupados em grupos de 5 alunos em diferentes
mesas de trabalho prático. Cada mesa é acompanhada por um monitor da Disciplina. A
atividade prática é sempre acompanhada de um professor e um ou dois técnicos de
laboratório.
Anualmente são planejados experimentos de caráter inovador ou original,
envolvendo a mensuração de alterações comportamentais, fisiológicas ou bioquímicas de
ratos ou camundongos administrados com diferentes doses de fármacos. Para constituir
cada experimento, com o número adequado de indivíduos experimentais por grupo, são
feitos procedimentos iguais para cada uma das 4 turmas, ou seja, são realizados
experimentos de um mesmo protocolo nas 3as e 5as feiras de duas semanas consecutivas,
para que todos alunos participem de cada um dos protocolos e para que se possa coletar o
número suficiente de dados de cada protocolo.
Coletados os dados, os alunos se dividem em grupos de até seis alunos para compor
banco de dados em Excel e recebem treinamento em análise estatística (programas Primer
e Sigma Stat), orientação para elaboração de trabalho científico e para apresentação de
trabalhos em congressos científicos. Para cada um dos experimentos há um professor
orientador e um ou dois monitores orientadores. Os monitores orientadores são
previamente treinados pelos professores e são os primeiros contatos de orientação para os
grupos, mantendo reuniões sistemáticas com os professores. Os grupos podem agendar
reuniões com o professor e monitor sempre que desejarem.
No início do semestre subsequente estes trabalhos são apresentados em uma
atividade curricular denominada de “Encontro de Farmacologia Pré-Clínica dos alunos da
Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre”. Esta atividade é
realizada com toda a turma, cada subgrupo apresenta o seu trabalho oralmente em 5
minutos, havendo mais 5 minutos de arguição pela platéia e pela banca de avaliação. Esta
banca é contituida de 2 monitores, 2 alunos de Pós-Graduação em Farmacologia e 2
professores. A banca confere um conceito pelas apresentações que compõe 50 % da nota
da avaliação. O trabalho, em moldes de manuscrito para ser submetido à Revista Pesquisa
Médica, deve ser entregue por escrito, em duas vias. Este trabalho é lido por dois
professores. A nota da avaliação é uma média da nota conferida ao trabalho escrito e da
apresentação oral. Uma via dos trabalhos escritos é devolvida ao alunos e a outra é
disponibilizada na biblioteca do SISP-Farmacologia-FFFCMPA.
 Aspectos éticos:
Todas as atividades com os animais de laboratório são feitas em presença de
professores, técnicos de laboratório e monitores com experiência em atividades práticas de
Farmacologia.
Há orientação permanente e/ou mediante escala e agendamento por professores e
por monitores e estagiários durante os meses de dezembro, janeiro e fevereiro para a
realização de trabalho em moldes científicos.

Avaliação:
A participação de cada aluno nas atividades práticas é avaliada pelos monitores
através da Ficha de Avaliação abaixo.
Ao grupo de alunos que apresentar o melhor trabalho de Farmacologia Pré-Clínica
é oferecido um prêmio com Diploma de Menção Honrosa.
Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre
Disciplina de Farmacologia Básica e Clínica –
Ficha de Avaliação de Aulas-Práticas
Monitor Responsável: ..........................Data:............. Turma: ........... Mesa: .........
Nome dos Alunos da Mesa – nº _________

Sim Não
1. O aluno está ciente do protocolo
2. O aluno demonstra ter estudado o assunto do protocolo
(medicamentos, procedimentos, validade do modelo)
3. O aluno demonstra interesse durante todo período da aula-prática
4. O aluno participa de forma efetiva, colaborando com o grupo
5. O aluno demonstra ser organizado durante a execução dos
experimentos
6. O aluno é capaz desenvolver todas as fases do experimento:
a) cálculo de doses
b) preparação das injeções
c) imobilização do animal
d) aplicação do medicamento
e) coleta dos dados
7. O aluno solicita/aceita orientação do monitor e professor
8. O aluno é capaz de discutir os resultados encontrados
9. O aluno está usando avental
 MATERIAL E MÉTODOS GERAIS

Animais: São utilizados animais adultos, machos ou fêmeas: ratos da cepa Wistar
ou camundongos das cepas Balb, CF1, C57, C3H criados no Biotério da FFFCMPA.

Drogas: As drogas utilizadas podem ser as mais variadas, dentro dos estudos
citados na lista acima.
Quando utilizada em ratos são preparadas na proporção de DOSE /kg de peso do
animal/ml. Para camundongos, utiliza-se apreparação de DOSEx10/kg de peso do
animal/ml. Com isto se facilita a aplicação dos medicamentos, bastando utilizar as
correlações:
Ratos- peso do animal em kilo  volume do fármaco em ml
Camundongos- peso do animal em kilo x 10  volume do fármaco em ml

Toma-se cuidado para não permitir que os alunos manipulem agentes eventualmente
tóxicos por contato. Evita-se permitir que os alunos tenham livre acesso aos
psicofármacos.

Procedimentos:
No início da aula prática o professor descreve os procedimentos a serem executados
no dia, apresentando um protocolo e uma folha de anotações de dados para cada mesa.
Durante a aulas prática, os monitores previamente treinados, demonstram o
procedimento experimental e auxiliam a execução dos experimentos, permitindo que os
alunos desenvolvam as habilidades, sob orientação. O professor deve ser chamado em
todos os momentos de dúvidas.
Os procedimentos experimentais são divididos abaixo como: I- métodos gerais; II-
modelo animal de doença crônica; III-testes experimentais específicos. Em todos os
experimentos teremos a combinação de procedimentos, como, p.ex: o rato (de um modelo
de doença crônica) será contido para administração de um fármaco por gavagem; após x
minutos será observado no teste do labirinto em cruz elevada; e depois será coletado
sangue para dosagens bioquímicas.
 I- MÉTODOS GERAIS

CONTENÇÃO DOS ANIMAIS

CAMUNDONGOS: Camundongos podem ser levantados pelo rabo da gaiola até a

bancada onde o animal será manipulado. Caso o tempo até alcançar na bancada seja um
pouco mais longo, os camundongos devem ser apoiados nos membros inferiores, porque
senão eles sobem pelo rabo e podem morder o pesquisador.
A contenção do camundongo é feita colocando-o sobre uma superfície rugosa ou
gradeada, com o rabo seguro pelo pesquisador (mão direita) para que, com a outra mão ( a
esquerda) a pele da nuca (logo abaixo das orelhas) seja presa entre o indicador e o polegar.
A seguir, o rabo é colocado entre o 4º e o 5º dedos.
O camundongo é imediatamente virado, ficando com as patas para cima.

RATOS: Ratos devem ser pegos de suas gaiolas pelo seu tronco, colocando-se o
polegar da mão direita no lado esquerdo do pescoço, o indicador no lado direito do
pescoço e o 3º dedo atrás da pata direita. Caso os ratos sejam mais ariscos ou agressivos
pode-se imobilizá-los mais facilmente colocando-se o polegar e o 3º dedo da mão direita
em cada lado do pescoço e pegando o tronco do rato logo em seguida, para levantar o rato.
Em último caso o rato poderá ser pego pela base da cauda (se segurarmos a ponta da cauda
do rato a pele oposta poderá ser desprendida, lesionando o animal) para ser rapidamente
apoiado na bancada.
A contenção do rato é feita segurando a cauda do animal com a mão direita, para
pinçar a pele do pescoço, logo abaixo das orelhas, com o polegar e o indicador da mão
esquerda e logo a seguir, pinçar a pele do dorso com os 3º, 4º e 5º dedos contra a palma da
mão, o rato é imediatamente elevado do apoio, após a contenção, virando-se as patas para
cima.

ADMINISTRAÇÃO DE DROGAS
Via Oral
 Consumo Espontâneo - Substâncias hidrossolúveis que devem ser administradas
continuamente serão diluídas na água de bebedouro na proporção da dose diária
(mg/kg/dia) diluído no volume a ser consumido voluntariamente (± 30ml para ratos de
300g).
 Gavagem - Introdução de um tubo metálico ou cânula plástica, de diâmetro de 3 mm,
ligado a uma seringa, através do esôfago do roedor. O animal é elevado da bancada após o
pinçamento na base do pescoço com a mão esquerda, deixando-se o peso do corpo alinhar o
tronco com a força da gravidade. Naturalmente o rato abre a boca e a cânula pode ser
introduzida, ao ser conduzida a partir do lado da boca do animal.
Via intraperitoneal - O animal é contido conforme o procedimento descrito em
CONTENÇÃO DOS ANIMAIS e a agulha é introduzida no quadrante inferior direito ou
esquerdo (evitar linha média) em direção à região cefálica. Aspirar para confirmar que não
perfurou vaso sangüíneo ou alça intestinal
Via Subcutânea - O pescoço do roedor é pinçado como em CONTENÇÃO DOS
ANIMAIS, mas o animal não é suspenso da bancada, ficando então contido entre a palma
da mão e a bancada, para que a agulha perfure a pele em ângulo de 90º. Aspirar.
Via intramuscular - A técnica, para injeção por esta via, consiste na imobilização
do rato em decúbito ventral, com a palma da mão, contra a bancada. É feita a extensão de
um dos membros posteriores e injeção da solução anestésica na região postero-lateral da
coxa do membro estendido, estando o animal com a cabeça em direção ao braço do
pesquisador. O músculo da pata posterior (direita ou esquerda) do roedor é pinçado para a
introdução da agulha a um ângulo de 90 graus. Aspirar.

MENSURAÇÃO DA TEMPERATURA CORPORAL

A mensuração da temperatura corporal dos ratos é feita pela via retal. Os ratos são
contidos gentilmente de encontro à bancada, de forma semelhante àquela para aplicação
IM nas patas posteriores, a cauda é elevada e 1 ,5 cm da ponta de termômetros clínicos
digitais, lubrificados com óleo mineral, são mantidos no reto por 1 minuto.

COLETA DE SANGUE
 Poderá ser feita de diferentes maneiras. A coleta sem eutanásia pode ser feita pelo
lancetamento da cauda, para coleta de gotas de sangue. Quando volumes maiores são
necessários será preciso anestesiar levemente o animal com um anestésico volátil e coletar
sangue pela punção do plexo venoso retro ocular. Pode-se, então, imobilizar a cabeça do
animal pinçando o crânio entre o polegar e o indicador da mão esquerda e introduzir cânula
de vidro no canto medial do olho, em um ângulo de 90º de linha média, mantendo a cânula
paralela à bancada. É possível obter volumes de 0,5 a 1 ml de sangue desta forma. Este
volume pode ser reposto sob a forma de salina i.p. Este procedimento deverá ser feito por
pesquisadores treinados.

COLETA DE TECIDOS
A eutanásia por decapitação é a forma mais rápida e mais humana descrita para
roedores. Pode-se, então, coletar o sangue do tronco do corpo do animal e os demais
tecidos (cérebro, músculo, fígado, etc...). Sacrificio por destroncamento cervical pode ser
realizada quando não é necessária a coleta simultânea de sangue.

AVALIAÇÃO DA MUCOSA GÁSTRICA

Para observação da mucosa gástrica é realizada, pós-mortem, uma laparotomia

mediana de aproximadamente 4 cm, seguida de dissecção da loja gástrica. Após
pinçamento do estômago é realizada a gastrectomia total. No estômago, é feita uma incisão
ao longo da pequena curvatura e a mucosa gástrica é lavada com solução fisiológica 0,9%.
Os estômagos são colocados abertos sobre as bancadas do laboratório para posterior
visualização e análise macroscópica do grau de hiperemia (de 0 a +++, sendo 0 ausente e +
++ acentuada) e o número total de focos hemorrágicos e estrias.

AVALIAÇÃO DA MOTILIDADE INTESTINAL

Animais em jejum de 36 a 48 horas recebem 0,5 ml de suspensão de carvão ativado

a 20% por gavagem. Após 15 min a 60 min. são submetidos a eutanásia, o estômago e o
intestino são retirados e abertos longitudinalmente. Após a abertura os órgãos são
colocados sobre papel filtro com a mucosa para cima e é medida, com régua, a marca de
carvão ativado do piloro até o ponto mais distante distal em que pode ser observado.

EUTANÁSIA
Vários métodos de eutanásia são descritos, sendo os mais bem aceitos:
a) eutanásia por decapitação- é o método menos traumático para o animal, não
requerendo anestesia. Requer uma guilhotina específica para pequenos animais. Deve
ser feito com bastante higiene, lavando o material após a morte de cada animal, longe
da presença de outros animais, visto que foi observado que se existem outros animais
na mesma sala da decapitação, nestes há aumento significativo de corticosterona e
prolactina, denotando estresse extremo. Só é aplicável quando o número de animais é
relativamente pequeno.
b) eutanásia por deslocamento cervical- Só é aplicável quando o número de animais é
relativamente pequeno e quando não é preciso coletar tecido cerebral. Melhor aplicável
para camundongos.
c) Eutanásia por asfixia- animais podem ser colocados em câmara de gás, conectada a
uma fonte de CO2. Pode ser aplicada a um grande número de animais.
d) Eutanásia por dose máxima de anestésico- pode ser cara pelo preço do anestésico e
pode não ser aplicável quando os tecidos coletados não podem conter anestésicos.

TÉCNICA ANESTÉSICA
Pelo fato do anestésico volátil éter ser inflamável, aumentando os riscos de acidentes
nos laboratórios, poder volatizar para o ambiente, intoxicando os pesquisadores e irritante
das mucosas, o que estressa os animais, com aumento importante de corticosterona
circulante, este deve ser evitado. Pode ser difícil substituir o éter por outro anestésico
volátil como enflurano, que volatiliza com mais dificuldade e é mais caro.
A “anestesia” com barbitúricos deve ser abolida dos nossos laboratórios, assim como
foi abolida como anestésico em humanos, por não ocasionar analgesia, somente evitando
que os animais reajam à dor, o que traz sofrimento inumano aos indivíduos e podendo
interferir sobre os resultados das atividades experimentais.
Os anestésicos para pequenos animais mais bem aceitos a nível internacional são a
XILAZINA e CETAMINA, utilizadas em associação.
 A via de administração, clássica, para o uso da associação de xilazina e cetamina, em
ratos, é a intramuscular. A técnica, para injeção por esta via, consiste na imobilização do
rato em decúbito ventral, a extensão de um dos membros posteriores e injeção da solução
anestésica na região postero-lateral da coxa do membro estendido. Esta via possui uma
absorção bastante errática, podendo ocasionar necrose muscular, devido ao baixo pH da
solução, em procedimentos de sobrevivência. A via intraperitoneal, é menos utilizada,
mas não produz lesão significativa na cavidade peritoneal, quando é usada a técnica
correta, entretanto a punção acidental de grandes vasos pode ocorrer, levando à morte do
animal.
A associação de xilazina/cetamina possui uma ampla faixa de doses utilizadas,
sendo que a determinação da dose depende da via de administração, a espécie animal e o
tempo de anestesia desejado. As vias intramuscular e intraperitoneal possuem tempo de
anestesia semelhante, sendo que esse é menor na via intraperitoneal, contudo, isso pode ser
corrigido pelo aumento da dose uma vez que a duração da anestesia é diretamente
proporcional a dose.
A solução padrão da associação, utilizada na disciplina de farmacologia da
FFFCMPA, é de 50 mg/kg de cetamina e 20 mg/kg de xilazina, cada uma delas em seringa
separada.
 II- MODELOS ANIMAIS DE PATOLOGIAS

 MODELO DE INDUÇÃO DO DIABETE

OBJETIVO: Obtenção de animais diabéticos insulino-dependentes
MATERIAL ESPECÍFICO: solução tampão citrato (pH 4,3); estreptozotocina (Sigma.
Co); aparelho Glucotrend, glicofitas, bisturi).
PROCEDIMENTO:
Indução: Após jejum de 12 horas, os ratos são injetados, via intra peritoneal., com uma
solução de 60 mg/kg de estreptozotocina (Sigma Co.) recentemente preparada em tampão
citrato (pH 4,3). Os ratos controle, se houver, são também submetidos ao jejum e recebem
apenas solução tampão citrato, no mesmo volume. Logo após a injeção, todos os ratos são
colocados, preferencialmente, em gaiolas individuais com água e alimento a vontade.
Transcorridas 48 horas, os ratos são avaliados para confirmar a indução de diabete através
da análise da glicemia.
Confirmação: Para confirmar o diabético não é necessário que os animais estejam em
jejum. É feita uma pequena punção na porção distal da cauda do rato, com auxilio de um
bisturi, com a coleta de uma gota de sangue sobre a gicofita. A glicemia é então
confirmada no aparelho Glucotrend (Boeringher Institute, Mannheim, Germany). Os
animais com glicemia  200 mg/dL são considerados diabéticos e aqueles com glicemia
menor são descartados do experimento. Outra observação importante para avaliar o diabete
é o elevado consumo de água, redução de peso, alteração na pelagem e intensa diurese. O
número de mortes pode ser reduzido pela limpeza quase diária das caixas e manutenção
constante de água nas garrafas. Pesagem e confirmação do diabete são feitas
semanalmente.

 MODELO ANIMAL DE CIRROSE

OBJETIVO: Obtenção de animais com cirrose hepática
MATERIAL ESPECÍFICO: tetracloreto de carbono (Delaware, Brasil) preparado em
solução de 1:7 em óleo mineral (Nujol, Schering, Brasil) ou óleo mineral (Nujol, Schering,
Brasil) (solução controle).Essas drogas são administradas por via intraperitoneal em dose
fixa de 0,5ml, aplicada uma vez ao dia. Os animais foram divididos em três grupos de seis.
Administra-se, no total, 25 doses dos respectivos tratamentos, sendo que as dez primeiras
obedeceram a um intervalo de cinco dias durante 50 dias, as dez seguintes, um intervalo de
quatro dia durante 40 dias e as cinco últimas, um intervalo de três dias durante 15 dias,
perfazendo um total de 105 dias.

 MODELO ANIMAL EPILEPSIA DE LOBO TEMPORAL

OBJETIVO: Obtenção de animais em estado de mal epiléptico ou com epilepsia crônica de
lobos temporal. O modelo de epilepsia pela pilocarpina consta de 3 fases bem definidas a
saber: fase aguda caracterizada por status epilepticus (SE) que pode durar de 2-12 horas;
fase silenciosa na qual o animal não apresenta manifestações epilépticas, com duração de
até 45 dias; fase crônica definida por crises epilépticas espontâneas e recorrentes e que se
prolonga por todo o tempo de vida do animal. A história natural dos animais tratados com
pilocarpina assemelha-se àquela dos pacientes com epilepsia do lobo temporal, bem como
a resposta terapêutica aos fármacos antiepilépticos
MATERIAL ESPECÍFICO: pilocarpina 300-380 mg/ml dissolvida em solução salina;
atropina 44 g/ml;
PROCEDIMENTO: Trinta minutos antes da administração da pilocarpina, os animais são
medicados com atropina de forma a reduzir os efeitos colinérgicos periféricos. Pilocarpina
300-380 mg/Kg/ml é administrada ip. Seguem-se alterações comportamentais que
culminam, após cerca de 30 a 60 minutos em crises clônicas contínuas caracterizando o
SE. Todos os comportamentos, bem como a latência para instalação do SE são registrados .
Os animais que permanecem em SE após 4 horas da indução, são medicados com
fenobarbital 20 mg/Kg/ml seguido de clonazepam 1mg/Kg/ml quando necessário, de forma
a controlar as crises e reduzir a mortalidade. Durante as primeiras 48 horas após a indução,
os animais são mantidos em gaiolas individuais para cuidados intensivos de alimentação e
hidratação. Após a recuperação completa, são reagrupados em gaiolas com 4 indivíduos
cada.
 III- TESTES EXPERIMENTAIS ESPECÍFICOS

 TESTE DE ESQUIVA PASSIVA

OBJETIVO: Avaliar a interferência de fármacos sobre processos de consolidação de
memória recente. O teste de esquiva passiva é classicamente descrito para estudo da ação
de fármacos e outros procedimentos sobre a memória de ratos. Baseia-se no princípio
segundo o qual, após executar determinado comportamento que induz estímulo nocivo ou
desagradável, o animal evitará a repetição deste comportamento. A administração de
drogas previamente à sessão de treinamento objetiva estudar a interferência destas drogas
estudar o aprendizado.
EQUIPAMENTO: O equipamento da esquiva-passiva é constituído por duas caixas de
acrílico justapostas, ligadas através de uma abertura que pode ser fechada. A caixa menor é
revestida com papel branco, a tampa é transparente e está localizada sob uma fonte
luminosa. A caixa maior é totalmente revestida com papel preto. Esse aparelho é colocado
sobre uma plataforma gradeada conectada a uma fonte de eletricidade (Albarsch).o
aparelho para testagem da esquiva passiva consta de 2 compartimentos quadrados, o maior
(aresta de 30 cm) com paredes de madeira escura e o menor com paredes de acrílico (aresta
de 18 cm), que se comunicam entre si através de uma abertura nas paredes contíguas de
ambos, de tamanho suficiente para permitir a passagem do rato, cuja abertura e fechamento
é controlada pelo pesquisador através de uma pequena porta-guilhotina removível. O
compartimento maior é escuro e fechado, exceto pela abertura descrita. O menor, é
iluminado através de uma lâmpada colocada sobre ele e tem paredes de acrílico
transparentes. A base do aparelho é constituída por uma grade de metal por onde é
transmitido um choque elétrico produzido por um gerador de energia que permite ao
pesquisador controlar a intensidade (0,1 a 2 mA), o tempo de duração, as características do
choque (contínuo ou intermitente) e o momento em que deve ser aplicado.
Procedimento: O teste de treinamento para indução do aprendizado é realizado no primeiro
dia e inicia colocando-se o rato no compartimento iluminado por 10 segundos, após os
quais, a porta-guilhotina é aberta, permitindo o livre acesso do animal ao compartimento
escuro. Ao entrar com as quatro patas no compartimento escuro, a porta-guilhotina é
fechada e é aplicado choque de 0,6 mA por 2 segundos. O rato é, então, imediatamente
retirado do compartimento, retornando à gaiola de origem. O teste de memória é conduzido
no segundo dia, aproximadamente 24 horas depois do treinamento. O procedimento é
realizado da mesma maneira anterior, com exceção do choque, que não é aplicado quando
o rato entra novamente no compartimento escuro. Mede-se a latência, que é definida como
o tempo, em segundos, que o animal leva para entrar (com as quatro patas) no
compartimento escuro a partir da abertura da porta guilhotina. O tempo de corte foi de 60
segundos na sessão de treinamento e de 300 segundos na sessão de teste, 24 horas após.

 TESTE DO RECONHECIMENTO ESPONTÂNEO DE OBJETOS:

OBJETIVO: O teste do reconhecimento espontâneo de objetos (SORT) é utilizado para o
estudo da memória de reconhecimento em roedores. Se baseia na exploração espontânea e
diferencial de objetos novos e familiares e o desempenho de reconhecimento é derivado do
tempo gasto na exploração dos 2 estímulos. Os resultados podem ser utilizados para
avaliação do estado da memória de reconhecimento de curta e longa duração, ou memória
declarativa episódica e, também da memória de habituação ou procedimental de curta e
longa duração.
EQUIPAMENTO: Se utiliza uma caixa de teste, 65x45x45 cm em cor neutra e opaca e
forrada com serragem; e objetos em triplicata, de volume em torno de 200 ml, com
formatos externos diferentes e que sejam suficientemente pesados par não serem
deslocados;
PROCEDIMENTO: Como pré-testagem, os animais são submetidos a 2 sessões de
habituação ao aparato do teste, com duração de 3 minutos cada e sem objetos, 24 horas
antes do teste.
Na sessão de treinamento, 2 objetos idênticos (A1 e A2) são colocados nos cantos
opostos da arena, separados por espaço suficiente para exploração de todas as suas faces. O
rato é colocado na região mediana da arena, de costas para os objetos e pode explorá-los
livremente durante 3 minutos. A exploração é definida como dirigir o nariz a uma distância
igual ou menor a 2 cm do objeto, ou tocá-lo com o nariz. É retornado à sua gaiola-moradia.
Após 2 minutos, na sessão de teste, os objetos da arena são trocados por um idêntico
aos anteriores, que será chamado de A3 e por um objeto novo chamado B, colocados nas
mesmas posições da sessão de treino.
Após intervalo de tempo pré-determinado (1 minuto a 24 horas), o rato é novamente
colocado na arena de testagem por 3 minutos de forma a explorar a nova dupla de objetos
(A3 e B1), sessão de reteste,.
 A exploração global dos objetos é a soma dos tempos de exploração de A1+A2 na
sessão de treino e de B+A3 no teste. A habituação é aferida pela diferença da exploração
entre a sessão de treino e o teste ([A1+A2]-[B+A3]). A simples medida de
reconhecimento ou discriminação é a diferença entre o tempo gasto na exploração do novo
estímulo (B) e o tempo gasto na exploração do estímulo familiar (A3), ou seja, B-A3.
Entretanto, para minimizar influência dos níveis totais de exploração, é mais preciso
utilizar a diferença no tempo de exploração dividida pelo tempo de exploração total: B-
A3/B+A3.
Exploração Habituação Discriminação
Treino (A1 e A2) E1=A1+A2 E1-E2 B-A3 ou
Teste ou reteste E2=A3+B1
B-A3/B+A3.
(A3 e B1)

 TESTE DO NADO FORÇADO

OBJETIVO: Avaliar o efeito antidepressivo de fármacos, avaliar comportamento tipo
depressivo em animais com doenças crônicas
EQUIPAMENTO: O equipamento consiste de um aquário (22x22x35 cm) contendo 27 cm
de altura de água à temperatura de 251ºC . (filmadora, vídeo cassete, fita de vídeo,
cronômetro, termômetro, régua para medir altura de água, toalhas para secar os ratos).
PROCEDIMENTO: No 1o dia, após 15 minutos (treino) no aquário, o rato é removido,
seco com toalha limpa e recolocado na sua gaiola. Passadas 24 horas, o animal é
recolocado no aquário nas mesmas condições, por 5 minutos (teste). O fármaco a ser
investigado é administrado em uma série de 3 injeções i.p., 24, 5 e 1 horas antes do teste.
Todos os movimentos, tanto no 1º quanto no 2º dia são filmados e registrados em vídeo
cassete. O comportamento dos ratos colocados no nado são posteriormente analisados
quanto ao tempo e freqüência de imobilidade total, mobilidade total, mergulhar e agitar a
cabeça ("head shake"). A imobilidade total é resultado da soma dos movimentos de
congelamento (freezing) e flutuação. O congelamento é considerado quando o rato bóia na
água sem executar qualquer movimento, como se estivesse congelado e a flutuação é
considerada quando o rato faz movimentos apenas para se manter com a cabeça fora da
água. O comportamento de mobilidade é sub-dividido em nado e escalar (climbing). O
escalar é considerado quando o rato nada ativamente tentando fugir pelas paredes do
aquário enquanto que o nado é considerado a tentativa de fuga no centro do aquário. O
mergulhar é avaliado pela tentativa de fuga pelo fundo do aquário e o agitar a cabeça é a
observação de movimentos bruscos da cabeça na tentativa de retirar água do ouvido.

 TESTE DO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE)

OBJETIVO: Avaliar o efeito ansiolítico de fármacos; avaliar comportamento tipo
ansiedade em animais com doenças crônicas
EQUIPAMENTO: (Labirinto; filmadora; vídeo cassete; fita de vídeo; cronômetro)
O labirinto consiste de 2 braços abertos (10x50 cm), sem qualquer anteparo, dispostos em
oposição um ao outro e 2 braços fechados (50x10x40 cm), também opostos, formando uma
cruz. Essa cruz é montada em madeira escura, sobre uma base elevada a 50 cm de altura A
sala do experimento é iluminada por uma lâmpada fluorescente vermelha de 80 watts a
2,60 m de altura.
PROCEDIMENTO: O animal é colocado no centro da cruz, com a cabeça voltada para o
braço aberto, e os seus movimentos observados e gravados com filmadora em fita de vídeo
cassete por um período de 5 minutos. Entre a exposição de um rato e outro é necessário a
limpeza do LCE com álcool, secando bem e deixando circular um pouco de ar. Os
parâmetros avaliados posteriormente são: o tempo de permanência nos braços fechados e
nos braços abertos, freqüência de entradas nos braços abertos ou fechados, levantar,
limpar, esticar e espiar. Considera-se que o rato entra num dos braço quando ele está com
as 4 patas fora do centro da cruz (área neutra). O limpar é considerado pelo número de
vezes ou tempo que o animal executa movimentos dirigidos à cabeça ou ao corpo com as
patas dianteiras. O movimento de esticar é observado quando o rato, estando na área
neutra, estica seu corpo em direção ao braço aberto, introduzindo nele apenas as patas
dianteiras. O espiar é considerado quando o rato, estando no braço aberto, inclina sua
cabeça além da borda aberta, para o vão.

 TESTE ALGESIMÉTRICO DE TAIL FLICK

OBJETIVO: Avaliar a sensibilidade à dor em pequenos animais e o efeito antinociceptivo
de fármacos
EQUIPAMENTO: (Aparelho de Tail-flick)
O aparelho de "tail-flick" (Albarsch) consiste de uma fonte de calor radiante, uma
fotocélula, um cronômetro e uma fonte de energia. A cauda do animal a ser testado é
colocado sobre o orifício de onde a luz emerge, abaixo da fotocélula, impedindo o impacto
da luz sobre a mesma. No momento em que o interruptor é acionado, a luz incide sobre a
cauda do animal que, ao sentir dor, remove-a. A luz atinge, então, a fotocélula que
imediatamente desativa o sistema, interrompendo o cronômetro. A intensidade da luz e o
tempo de exposição máximo são fixados previamente.
PROCEDIMENTO: Os ratos são avaliados individualmente. Antes da exposição feita uma
marca preta a 1 cm da porção média ou terminal da cauda do rato onde a luz incidirá, com
o objetivo de aumentar a intensidade do estímulo radiante. O rato é avaliado em dois ou
mais momentos, sendo que a primeira exposição é feita sem administração da droga teste e
as demias em vários momentos após o uso do fármaco. O protocolo atual estabelece a
intensidade de luz como sendo 150 watts e o período máximo de exposição ao estímulo
como sendo de 10 segundos. O período de retirada da cauda é a variação entre o momento
1 e os subsequentes. Se avalia se houve aumento do tempo de reflexo de retirada da cauda
exposta a estímulo nocivo térmico, que caracteriza analgesia ou, se este tempo foi
reduzido, teremos caracterizado hiperalgesia.

 TESTE ALGESIMÉTRICO DA CHAPA QUENTE

OBJETIVO: Avaliar a sensibilidade à dor em camundongos e o efeito antinociceptivo de
fármacos
o
EQUIPAMENTO: Chapa metálica em cima de banho-maria a 52 C, sobreposta por
cobertura transparente
PROCEDIMENTO: Os camundongos são avaliados individualmente. O camundongo é
avaliado em somente um momento. È colocado sobre a chapa quente ao mesmo tempo em
que é acionado um cronômetro. Este cronômetro é desligado assim que o animal lamber as
patas anteriores pela primeira vez. O animal é retirado da chapa quente em seguida. Caso o
animal não esboce o comportamento de dor (lamber as patas) em 30 seg, é retirado do
equipamento para evitar lesão tecidual
Se avalia se houve aumento do tempo de reflexo de dor a estímulo nocivo térmico, que
caracteriza analgesia.

 TESTE DO ELETROCHOQUE MÁXIMO TRANSCORNEAL

OBJETIVO: Avaliar o limiar convulsivante ou o efeito anticonvulsivante de fármacos para
convulsões tônico-clônico generalizadas
EQUIPAMENTO: Fonte de Eletrochoque, com controle de intensidade e de duração do
eletrochoque, ligada a eletrodos corneais.
PROCEDIMENTO: O eletrochoque máximo é aquele que induz convulsão tônico-clônica
em todos os animais e é obtido ao se utilizar corrente alternada de 60H, 150 mA por 0,2?
segundos). A região orbital do animal é molhada com salina para aumentar a transmissão
do eletrochoque e prevenir lesão de partes moles e os eletrodos são posicionados de
encontro às córneas doas animais. Emitido o eletrochoque, observou-se a latência da
contação das patas anteriores e posteriores isoladamente e a duração da contração tônica
das patas posteriores.
Segundo o projeto de Triagem com Anticonvulsivantes (Anticonvulsivant Screening
Project) desenvolvido pela National Institute of Neurological Disorders and Stroke , o teste
de eletrochoque máximo deve ser realizado na identificação pré-clínica da atividade
anticonvulsivante de drogas. A abolição do componente extensor tônico dos membros
inferiores denota efeito anticonvulsivante da droga.

TESTE DO CAMPO ABERTO

OBJETIVO: Avaliar a locomoção de animais ou a reatividade emocional de ratos tratados
com diferentes fármacos. Maior emocionalidade dos animais se manifesta em ambiente
amplos, onde os roedores por instinto, se locomovem perto das paredes, onde se sentem
mais protegidos. Agentes ansiolíticos aumenta a passagem doas animais pelo centro desta
arena e diminui a defecação.
EQUIPAMENTO: (aparelho de campo aberto; filmadora, vídeo cassete, fita de vídeo,
cronômetro)
O aparelho do campo aberto é constituído por um circulo de acrílico de 90 cm de diâmetro,
com paredes de 35 cm de altura recobertas por papel branco. O fundo desta arena é
marcado por 3 círculos concêntricos, cortados por 2 retas dividindo a arena em 16
retângulos disformes. A iluminação do ambiente é feita com uma lâmpada fluorescente
vermelha de 80 watts na altura de 2,60 m do centro da arena.
PROCEDIMENTO: O animal é colocado no centro da arena e exposto, individualmente,
ao campo aberto por um período de 5 minutos, durante os quais os comportamentos são
registrados por uma filmadora e gravados em fita de vídeo cassete. Na análise etológica
dos comportamentos são avaliados: a freqüência e a duração do andar, levantar e limpar,
além do número de bolos fecais. O andar é medido pelo número de retângulos invadidos,
com as 4 patas, pelo animal. O levantar é considerado como o apoio apenas sobre as patas
traseiras. O limpar ("grooming") é considerado pelos movimentos dirigidos à cabeça ou ao
corpo, efetuados com as patas dianteiras. Os bolos fecais são contados após a retirado do
animal da arena. Entre a exposição de um rato e outro é necessário a limpeza do chão da
arena com álcool, secando bem e deixando circular um pouco de ar.

 TESTE DE ENDIREITAMENTO AÉREO

OBJETIVO: Avaliar a reatividade motora de roedores
EQUIPAMENTO: Barra de madeira, paralela à bancada, podendo ser elevada a 10 cm, 25
cm, ou 50 cm
PROCEDIMENTOS: A cada momento do teste o animal é colocado com a quatro patas
em cima da barra na altura de 10 cm, de 20 cm e de 50 cm. Quando o animal está
equilibrado esta barra é girada para que o animal caia, sendo observado se o animal
apresentou ou não o reflexo de endireitamento aéreo, ou seja, se ele demonstrou a
capacidade de cair com as 4 patas sobre a bancada. È anotada a altura da qual o animal
caiu e demonstrou endireitamento aéreo. Quanto menor reatividade motora o animal
estiver apresentando, maior a altura necessária para apresentar o reflexo de endireitamento
aéreo.

 TESTE DE LOCOMOÇÃO
OBJETIVO: Avaliar a hiperatividade ou a sedação de animais
EQUIPAMENTO: Caixa de locomoção para ratos é de madeira escura, com fundo
gradeado e composta de 3 células fotoelétricas conectadas a um contados digital.
PROCEDIMENTO:As caixas são mantidas em ambiente escuro e o animal é colocado na
caixa pelo tempo necessário de observação. Mede-se o número de vezes que o animal
atravessa as células fotoelétricas em períodos específicos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BARROS, HMT – Efeitos dopaminérgicos da carbamazepina. Relação com sua atividade

anticonvulsivante e antidepressiva, 1986. (Tese de Doutorado – Escola Paulista de
Medicina).

BERNARDI, RB – Estudo etológico do reconhecimento de objetos por ratos epilépticos

crônicos tratados com carbamazepina, 2000. (Dissertação de Mestrado – Fundação
Faculdade de Ciências Médicas de Porto Alegre).

FERIGOLO, M – Participação da feniletilamina no mecanismo de ação antidepressivo de

inibidores seletivos da monoaminooxidase. Porto Alegre, 1996. (Dissertação de Mestrado
– Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre).

GOMEZ, R – Efeito do clonazepam sobre a depressão e ansiedade em diabéticos: um

estudo com modelos animais. Porto Alegre, 1997. (Dissertação de Mestrado – Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre).

RHODEN, CR – Estudo das alterações comportamentais e de lipoperoxidação em um

modelo de cirrose induzida por tetracloreto de carbono, em ratos. Porto Alegre, 2000.
(Tese de doutorado – Universidade Federal do Rio Grande do Sul).