FO

Fotometria e dosagens de
proteínas totais por método
espectrofotométrico

BIOMEDICINA
 AUTORES

ALEXANDRA FERREIRA
ANA LETÍCIA
ELISANDRA MENDONÇA
PATRÍCIA MENDONÇA
PATRÍCIA BARBIERI
NIVALDO MARQUES
 SUMÁRIO

Capítulo 1

Componentes básicos da fotometria.....................................................1

Transmitância....................................................................................................... .2
Absorbância.............................................................................................................3
Medida da transmitância e absorbância..........................................................4
Métodos fotométricos na análise quantitativa...............................................5

Capítulo 2

Espectrofotômetro...............................................................................................6
Componentes de um espectrofotômetro......................................................7
Princípios e funcionamento de um espectrofotômetro...........................10

Capítulo 3
Aplicação do método de Biureto
para dosagem de Proteínas Totais..............................................................12

Bibliografia.......................................................................................................14
 CAPÍTULO 1

COMPONENTES BÁSICOS DA
FOTOMETRIA

A fotometria possui componentes básicos, são eles:

1 – Fonte de energia elétrica – fornecedora de energia regulada,

constante e apropriada para a operação do instrumento.
2 – Fonte de energia radiante – capaz de medir uma mistura de
comprimentos de onda.
3 – Fenda de entrada da luz.
4 – Monocromador – utilizado para isolamento da porção desejada do
espectro.
5 – Fenda de saída da luz.
6 – Cubeta - recipiente que recebe o líquido da reação a ser medido.
7 – Detector – utilizado para receber a energia radiante transmitida
através da solução e transformá-la em energia elétrica.
8 – Circuito medidor – recebe a energia elétrica emitida pelo detector
apresentando-a ao operador sob uma forma útil de medida:
absorbância ou concentração.

A Figura esquematiza os componentes básicos da fotometria

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 Transmitância

O que é Transmitância?

A transmitância ocorre quando um raio de luz monocromática de

intensidade inicial definida (I0) incide sobre uma solução colorida, a
intensidade da luz emergente (I1) é menor que a luz incidente (I0), ou seja,
parte da luz foi absorvida:

O quociente I1/I0 é denominado transmitância (T). Se I0 for igual a

100%, a intensidade de luz emergente poderá ser medida como
percentagem de transmitância (%T): %T = T × 100

2
 ABSORBÂNCIA
A absorbância exprime a fração da energia luminosa que é
absorvida por uma determinada espessura de um material. Ou seja, a
capacidade de absorver a luz. A absorbância de uma solução está
relacionada com a transmitância. Quando a absorbância de uma
solução aumenta, a transmitância diminui.

A medida de absorção: é a absorvância (A).

Tem-se que A = quantidade de luz absorvida e T = fração total da luz
transmitida;
Desse modo, A e T estão inversamente relacionadas. Como a
absorção da luz é uma função logarítmica, a relação básica entre A e T
é a seguinte: A = −log %T/100 A = −(log %T – log 100) A = −(log %T + 2)
A = −log %T + 2 A = 2 − log %T.

A absorvância não é uma quantidade medida diretamente, mas é

obtida por meio do cálculo matemático a partir dos valores da trans-
mitância.

3
 MEDIDA DA TRANSMITÂNCIA E
ABSORBÂNCIA
A transmitância e a absorvância das soluções coloridas são medidas
por meio de instrumentos denominados fotômetros.

Estes instrumentos empregam como fonte luminosa uma lâmpada

incandescente produtora de luz branca. Potencialmente, pode-se
empregar qualquer comprimento de onda da região visível. Para a
resolução da luz em determinado comprimento de onda desejado, são
utilizados monocromadores que consistem em filtros interferentes ou de
absorção (fotômetros de filtro), prismas ou retículos de difração
(espectrofotômetros). A luz atravessa uma solução colorida presente em
uma cubeta; parte é absorvida (esta absorção depende da intensidade de
cor da solução). A luz transmitida (detectada por uma fotocélula) tem
intensidade menor que a luz incidente.

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 MÉTODOS FOTOMÉTRICOS NA ANÁLISE
QUANTITATIVA

O principal uso dos métodos fotométricos é na quantificação de

substâncias. Em anexo se encontra um protocolo que mostra como
que estes métodos podem ser utilizados para a determinação da
concentração de um cromóforo, a partir de soluções com
concentrações conhecidas ou então com a utilização da constante e
para as condições nas quais se está fazendo a determinação.

Na construção de uma curva de calibração é importante utilizar

todas as condições nas quais se encontra a amostra cuja
concentração se deseja determinar, pois pequenas alterações no
solvente, pH ou força iônica podem produzir alterações nas
propriedades dos cromóforos

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 CAPÍTULO 2
ESPECTROFOTÔMETRO

O Espectrofotômetro é um aparelho amplamente utilizado em

laboratórios, cuja função é a de medir e comparar a quantidade de
luz (energia radiante) absorvida por uma determinada solução.

Ou seja, ele é usado para medir (identificar e determinar) a

concentração de substâncias, que absorvem energia radiante, em
um solvente. O espectrofotômetro é muito sensível e qualquer
interferência pode mostrar um resultado errado. As cubetas têm
papel fundamental e sua limpeza e correta utilização são essenciais
para a obtenção de resultados corretos e confiáveis.

Os espectrofotômetros modernos geralmente utilizam feixes

duplos produzidos através de espelhos semitransparentes, sendo
que um feixe passa através da amostra enquanto o outro feixe não,
e a comparação entre a intensidade destes dois feixes produz a
leitura final do equipamento. Isto elimina problemas como
flutuações na fonte, diferente detecção para diferentes ls, et

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 COMPONENTES DE UM
ESPECTROFOTÔMETRO

Os componentes do espectrofotômetro são:

1 - fonte:

A fonte de energia eletromagnética precisa fornecer radiação

estável e com intensidade razoavelmente constante por toda a faixa
de l na qual se pretende usar. Devido a essas exigências, geralmente
utiliza-se um lâmpada para a região do visível e do IV e outra
lâmpada para o UV. A fonte de radiação visível e IV mais utilizada é a
lâmpada incandescente de tungstênio, que devido a sua alta
temperatura (2600-3000ºC) fornece uma radiação razoavelmente
constante entre 350 a 2500 nm. No caso da radiação UV, as fontes
mais utilizadas são as lâmpadas fluorescentes de hidrogênio e hélio,
que fornecem radiações com l de 180 a 350 nm.

2 - prisma para seleção do lâmbida:

Nos espectrofotômetros utiliza-se geralmente prismas ou grades

de difração para uma seleção mais precisa do l. Diferentes ls viajam
com velocidades diferentes através da matéria, sendo que ls
menores sofrem mais difração do que ls maiores. Usando-se um
prisma móvel juntamente com lentes adequadas e uma fenda se
consegue selecionar ls com a precisão de até 1 nm. Outra forma de
seleção do l é o uso de uma grade de difração7 , que nada mais é do
que uma superfície irregular que consegue refletir a luz. A
interferência desta luz 7 um bom exemplo de grade de difração são
os discos de CD, que contém uma infinidade de minúsculos furos,
que funcionam como as diferentes superfícies de reflexão.

7
3 - Fenda:

Existem nos espectrofotômetros várias lentes e fendas, que tem

como objetivo colimar e selecionar os feixes de luz apropriados.

4- Cubeta:

A característica fundamental da cubeta é que ela seja

transparente à radiação. No caso da radiação UV utiliza-se quatzo ou
sílica fundida enquanto que na região do visível podem ser utilizados
materiais mais baratos como o vidro ou plásticos. Geralmente as
cubetas possuem um caminho óptico (espessura) de um centímetro,
tamanho padronizado na lei de Lambert-Beer.

Sempre é bom lembrar que estas cubas devem ser

rigorosamente limpadas para que sujeiras ou mesmo a gordura dos
dedos não interfira na leitura. É conveniente que as cubetas sejam
regularmente limpas com agentes oxidantes como por exemplo
solução sulfocrômica para retirar qualquer traço de sujeira.

5 - Detectores:

Existem várias formas de se detectar ondas eletromagnéticas,

sendo que todas estão baseadas na conversão da energia radiante
em energia elétrica, que podem então ser detectados por um
equipamento convencional. Os três tipos diferentes de detectores
mais utilizados sãod discutidos a seguir. As células fotovoltaicas
baseiam-se na geração de força eletromotriz quando se ilumina uma
placa metálica recoberta com uma camada de material
semicondutor como o selênio e o óxido de cobre. As células
fotovoltaicas são utilizadas principalmente no caso de uma
iluminação alta, pois a amplificação deste tipo de célula é difícil de
ser conseguida.
8
 As células fotoelétricas tem como princípio o efeito fotoelético,
que consiste na liberação de um elétron de uma superfície
(geralmente constituída de óxidos alcalinos) quando um fóton de luz
visível ou UV atingir a placa.

Estes elétrons liberados podem ser captados por um ânodo, o

que produzirá uma corrente elétrica detectável. Uma modificação
das células fotoelétricas, denominados fotomultiplicadores, utilizam
a emissão induzida por fótons e elétrons para amplificar o sinal. O
fóton bate na primeira placa e 2 a 5 elétrons secundários são
emitidos, que são atraídos pela placa seguinte (dínodo) através de
uma voltagem de aproximadamente + 90V. Cada qual destes
elétrons podem por sua vez produzir 2 a 5 outros.

Fotomultiplicador 12 elétrons e assim sucessivamente. Com a

utilização de 9 a 16 dínodos, cada qual com uma voltagem de +90 V
em relação ao anterior, pode se conseguir uma amplificação de até
108 , considerando-se que cada passo tenha um fator multiplicador
de 4,5. Desta forma é possível detectar uma quantidade ínfima de
luz. Devido a sua alta sensibilidade, os tubos fotomultiplicadores não
podem ser utilizados para intensidades de luz muito elevadas.

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PRINCÍPIOS E FUNCIONAMENTO DE UM
ESPECTROFOTÔMETRO

O espectrofotômetro é o equipamento utilizado para

determinar os valores de transmitância (luz transmitida) e
absorbância (luz absorvida) de uma solução em um ou mais
comprimentos de onda.

Ele mede a quantidade de fótons (a intensidade da luz)

absorvida depois de passar pela amostra. A quantidade de uma
substância química conhecida (concentração) também pode ser
determinada.

O princípio básico é que cada composto absorve ou transmite

luz em uma certa amplitude de comprimento de onda. Assim, a
medida também pode ser usada para medir a quantidade de
uma substância química conhecida.

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 O funcionamento dos espectrofotômetros é muito simples.
A fonte de radiação emite luz (UV, visível ou IR) e essa luz é
fracionada pelo monocromador (prisma ou rede de difração)
nos comprimentos de onda que a compõem, ou seja, ela sofre
refração.

A faixa de comprimentos de onda, inicialmente

selecionada, é dirigida para a amostra (soluções, filmes finos,
pós). Parte dessa luz é absorvida e parte é transmitida. A luz
que é transmitida chega ao detector e lá é transformada em
um sinal elétrico. Finalmente, o sinal elétrico é recebido pelo
computador que transmite esses dados em forma de espectro
(absorção x comprimento de onda).

Os espectrofotômetros são compostos basicamente por

cinco partes: a fonte de radiação, o monocromador, o porta-
amostras, os detectores e o indicador de sinal. Existem diversos
tipos de cada componente de um espectrofotômetro. Abaixo
estão listados alguns deles.

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 CAPÍTULO 3

APLICAÇÃO DO MÉTODO DE BIURETO

PARA DOSAGEM DE PROTEÍNAS TOTAIS.

O método de biureto tem sido aplicado para determinar a

concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles:
soro ou plasma sangüíneo, líquido cérebro espinhal (líqüor), urina,
alimentos, saliva, fibrinogênio.

Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não

apresentar grande variação da absortividade específica para
diferentes proteínas, este método não é muito sensível, colocando-
o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por
isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais
sensíveis.

Mesmo assim, o método de biureto continua sendo

recomendado para a determinação da concentração de proteínas
totais em plasma sangüíneo pela Associação Americana de Análises
Clínicas e por diversos autores, bem como para a determinação de
proteínas totais em saliva30 e leite29, quando comparado com
outros métodos.

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 PRINCÍPIO
As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a
proposta inicial de Autenrieth, em 1915, posteriormente diversos
autores propuseram modificações do mesmo, sendo, atualmente, a
proposta metodológica de Gornall e cols9. a mais utilizada. O
método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído
de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante
que estabiliza o cobre em solução, sendo o tartarato de sódio o
recomendado por Gornall e cols.9.

O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um

complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O produto de
reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e
outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentar
em seis vezes a sensibilidade do método do biureto14, a banda na
região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque
diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios
analisados, absorvem na região de 270 nm causando muita
interferência no método.

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 BIBLIOGRAFIA

https://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-4-UV-VIS_1o-Sem-2014.pdf
https://cdn.awsli.com.br/600x450/1/1128/produto/26414420/0d21cdf183.jpg
https://labtest.com.br/wp-
content/uploads/2016/09/FOTOMETRIA_E_PADRONIZACAO.pdf
https://kasvi.com.br/espectrofotometria-analise-concentracao-solucoes/
http://www.ufrgs.br/biofisica/Bio10003/Metfoto.pdf
http://cursobioquimica.iq.usp.br/paginas_view.php?
idPagina=503&idTopico=1060#.YFUWslVKjIU
https://ar.pinterest.com/pin/659425570413630019/
https://www.docsity.com/pt/espectrofotometro-2/4714060/
http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc35_1/06-EEQ-79-11.pdf
https://slideplayer.com.br/slide/3468271/
https://www.sinergiacientifica.com.br/espectrofotometro-para-que-serve-como-
funciona-quais-sao-seus-componentes/
https://www.docsity.com/pt/espectrometros-e-espectrofotometros/4778425/

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