Centro de Química de Proteínas

CENTRO DE QUÍMICA DE PROTEÍNAS – FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO

PRETO - USP
HEMOCENTRO DE RIBEIRÃO PRETO

Lewis Joel Greene

Gustavo Antonio de Souza
Sandra Rodrigues Pereira
Vitor Marcel Faça
ELETROFORESE

É um método de separação de biomoléculas que tem papel fundamental no

desenvolvimento de pesquisa em bioquímica, biologia, química de proteínas,
farmacologia, medicina forense, investigações clínicas, controle de qualidade de
alimentos e biologia molecular, entre outras.
Existem várias modalidades de eletroforese, e dependendo do tipo de problema
em estudo deve-se escolher uma adequada ao seu experimento. Entretanto, o princípio
da técnica é o mesmo para todos os tipos de moléculas biológicas. Nesta apostila será
enfatizada a eletroforese aplicada a separação de proteínas.

Princípio da técnica
A eletroforese está baseada no fenômeno do movimento que é produzido em
uma determinada molécula carregada quando um campo elétrico é aplicado sob a
mesma. Desta forma moléculas carregadas negativamente são arrastadas para o pólo
positivo do campo elétrico e as positivas para o pólo negativo como mostra abaixo, num
exemplo de eletroforese de papel.

Separação de aminoácidos em
eletroforese de papel.

Eletroforese de proteína

Como proteínas são compostas por aminoácidos e alguns destes apresentam

carga, cada proteína tem uma carga líquida determinada pela sua composição em
aminoácidos e portanto mobilidade eletroforética característica. A separação das
proteínas pode ser realizada em solução ou em gel (mais freqüentemente). O gel de
eletroforese consiste de uma matriz porosa que oferece uma pequena resistência ao
movimento das moléculas através do mesmo, como conseqüência, as mesmas são
separadas segundo a sua carga na eletroforese nativa e segundo a sua massa na
eletroforese com detergente dodecilsulfato de sódio (SDS), uma vez que nesta
modalidade a relação carga/massa é a mesma para todas as proteínas.
Eletroforese nativa

Esta modalidade de eletroforese separa as proteínas principalmente em sua

carga total. A esse respeito é um dos métodos mais poderosos para estudar a
homogeneidade e estrutura de proteínas nativas, especialmente quando sua atividade
deve ser preservada para futuros estudos e detecção. A eletroforese nativa também é
utilizada para estimativas de peso molecular de proteínas nativas e para separar
pequenos fragmentos de DNA e oligonucleotídeos.
A escolha de utilizar um gradiente ou um gel homogêneo vai depender da
complexidade da amostra e da aplicação. Os gradientes são empregados para
visualizar melhor componentes de misturas complexas por oferecer maior resolução,
fazendo com que as bandas apresentem-se mais estreitas durante a separação.
Entretanto para estimativas de peso molecular, géis homogêneos em uma série de
concentrações de acrilamida são utilizados para construir gráficos que permitem
comparações de proteínas cujos pesos moleculares são desconhecidos com a
migração de padrões conhecidos.
A migração na eletroforese nativa depende do número de resíduos carregados,
sendo a carga total da proteína dada pela equação abaixo, para pH 7,0.
∑Lys + ∑ Arg + ∑ His − ∑ Asp − ∑Glu = c arg a _ líquida
Onde Lys=lisina; Arg = arginina; His=histidina; Asp= ácido aspártico e Glu= ácido
glutâmico.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA EM FASE REVERSA (RP-

HPLC).

Existem várias técnicas de purificação de proteínas e peptídeos disponíveis

atualmente. Entretanto, a cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-
HPLC) tornou-se a ferramenta mais utilizada para purificação e análise de biomoléculas.
A cromatografia de alta eficiência separa proteínas e peptídeos baseado na
reversibilidade de suas interações com a superfície hidrofóbica da matriz
cromatográfica, ou seja, quanto mais hidrofóbico a proteína ou peptídeo, mais forte será
sua interação com a matriz. Assim, polipeptídeos e proteínas de seqüências muito
semelhantes podem ser separados.
A matriz cromatográfica, formada por partículas de sílica, é caracteristicamente
hidrofóbica porque apresenta ligado em cada partícula uma cadeia de hidrocarbonetos.
Estas cadeias poder ser compostas de 4, 8 ou 18 carbonos, e a escolha de uma destas
resinas depende da amostra a ser analisada. Peptídeos pequenos (resultantes de uma
degradação enzimática, por exemplo), e polipeptídeos pouco hidrofóbicos, devem ser
analisadas em resinas C18, pois estas são bastante hidrofóbicas. Proteínas íntegras ou
polipeptídeos com mais de 10,000 Da podem ser passadas em resinas C4, C8, e em
alguns casos, C18.
A amostra geralmente é aplicada em meio aquoso, permitindo que esta se ligue
a matriz cromatográfica, sendo posteriormente eluída com o aumento da concentração
de um solvente orgânico no meio. A eluição dos diferentes componentes da amostra se
dá mediante a competição de hidrofobicidade entre a matriz cromatográfica e o solvente
orgânico (fase móvel). Logo, componentes pouco hidrofóbico necessitam de uma
pequena concentração do solvente orgânico para eluirem, enquanto que componentes
mais hidrofóbicos necessitam de concentrações maiores.
 As figuras abaixo são exemplos de resultados obtidos usando-se esta técnica:

Separação cromatográfica das

cadeias de hemoglobina de
Liophis miliaris. Os picos
identificados representam cada
uma das cadeias da proteína. O
gradiente utilizado esta
representado no gráfico

Separação cromatográfica de peptídeos obtidos da digestão tríptica da cadeia B

da hemoglobina de Liophis miliaris. Foram hidrolisados 2,4mg de cadeia
utilizando relação enzima:substrato de 1:50.
ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS PELO SISTEMA DE PTC – DERIVADOS.

Em química de proteínas a análise de aminoácidos proporciona informações

bastante relevantes para a estratégia de seqüenciamento e, desde que o peso
molecular da proteína seja conhecido, pode-se estimar a proporção em moles de
aminoácido por mol de proteína, concentração de proteína na amostra analisada,
avaliar a homogeneidade de preparados, caracterizar hidrolisados, acompanhar
modificações na amostra, entre outras aplicações. A análise de aminoácidos fornece as
razões molares entre os aminoácidos presentes em determinada proteína (mol%). Caso
o peso molecular não seja conhecido, somente será possível expressar-se as
quantidades relativas dos resíduos, geralmente normalizada pelo resíduo de
aminoácido presente em menor quantidade, definido como fórmula mínima.
O método utilizado na determinação do conteúdo de aminoácidos baseia-se no
procedimento descrito por Bindlingmeyer, que consiste na prévia derivação dos
aminoácidos seguidos da separação cromatográfica e detecção baseada na
absorvância no ultravioleta (254nm). A principal reação deste método consiste na
ligação entre o aminoácido livre e o fenilisotiocianato (PITC), em meio básico, com
produção do derivado de aminoácido, feniltiocarbamil-aminoácido (PTC-aminoácido).
Inicialmente realiza-se a hidrólise ácida (fase vapor) da proteína ou peptídeo em tubos
de borosilicato, livre de sais, açúcares, lipídeos ou detergentes. Após a hidrólise, o
ácido é removido através de secagem e neutralizada com solução aquosa de base
orgânica (trietilamina). A reação de derivatização dos aminoácidos é realizada com o
reagente PITC.

Reação de hidrólise da proteína/peptídeos e de derivatização de aminoácidos.

A separação cromatográfica dos PTC-aminoácidos é realizada em sistema

dedicado de cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) composto por duas bombas,
espectrofotômetro, utilizando coluna cromatográfica do tipo Picotag C18 (fase-reversa)
A quantificação de cada análise é realizada através da injeção prévia de solução
padrão contendo 100pmol de cada aminoácido, derivado simultaneamente com as
amostras. Um típico diagrama de eluição para o padrão é dado na figura a seguir,
juntamente com os detalhes do gradiente de eluição (na legenda). Cada amostra é
analisada em 30 minutos, que corresponde ao tempo de corrida cromatográfica. O limite
mínimo de detecção do método é de 5pmol, correspondente ao nível de contaminação
presente nos reagentes utilizados (background).
Realiza-se a integração de cada pico obtido para as amostras de acordo com
suas áreas e tempos de retenção, comparando-os com o padrão de calibração.
Outros pontos importantes a se destacar se referem às limitações do método. A
reação de derivação com PITC é sensível à presença de grandes quantidades de sais e
carboidratos, produzindo subprodutos que interferem na identificação dos aminoácidos.
A hidrólise das amostras devem ser feitas em fase vapor, visto que os métodos
tradicionais de hidrólise líquida liberam silicatos dos tubos de vidro utilizados, que
também interferem na reação de derivação. Um outro interferente do método é a
amônia, que elui na mesma posição que o aminoácido prolina, no gradiente utilizado.

Análise de aminoácidos pelo método da derivatização prévia a separação

cromatográfica. Em A é apresentado o perfil de eluição para 100pmol de
aminoácido, em B é apresentado o perfil cromatográfico obtido para 25pmol do
inibidor de tripsina SETI-II. Foi hidrolisado 1nmol (3,5µg) de peptídeo diluído em
500µL do tampão e injetados 20 µL (2,5%) no sistema cromatográfico.
SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁTICO

Todo o processo de seqüenciamento é utilizando-se microseqüenciador de

proteínas automático Procise, da Applied Biosystems, modelo 491. O equipamento
utiliza o processo químico de seqüenciamento por clivagem N-terminal, derivado do
método desenvolvido por Pehr Edman nos anos 50.
Este processo é subdividido em três etapas: (figura ao lado) acoplamento,
clivagem e conversão. Na etapa de acoplamento, o grupo amínico do aminoácido N-
terminal da cadeia polipeptídica reage com PITC, sendo este aminoácido removido por
TFA (anidro), na etapa de
clivagem, deixando o
restante do polipeptídeo
intacto. O aminoácido
derivado da reação com
PITC (ATZ-aminoácido) é
convertido à PTH-
aminoácido que é então
cromatograficamente
separado, identificado por
absorvância a 269 nm, e
quantificado em um
sistema de HPLC
“microbore” (coluna PTH
C18, 2,1x220mm com
partículas de 5µm).
A identificação e a
quantificação é realizada
com base em padrão de
10pmol de PTH-
aminoácidos. O perfil de
separação do padrão é
mostrado abaixo.
 Padrão de 10pmol de PTH-Aminoácidos

Este processo é repetido, obtendo-se a seqüência do polipeptídeo (dentro de

certos limites de detecção). O equipamento fornece, através de seu sistema de coleção
de dados, a seqüência obtida. Entretanto a recuperação cai com o número de ciclos
como é ilustrado na figura abaixo.

Logaritmo da recuperação de PHT-aminoácido. Duzentos picomoles de

cadeia globina de Glossoscolex paulistus intacta foram submetidos a degradação
automatizada de Edman.
 Este é um dos motivos pelo qual se realizam clivagens seletivas para obtenção
de peptídeos, cuja superposição forneça uma seqüência única e não ambígua.
A tabela abaixo apresenta algumas enzimas e o modo de clivagem e reagente
empregado em clivagem química.

Enzima / reagente Ação

CNBr C-terminal de Met
Tripsina C-terminal de Lys e Arg
Endo-Lys C-terminal de Lys
Endo-Glu C-terminal de Glu

São obtidos desta forma, peptídeos de seqüências e sítios de clivagem distintos,

o que permite a superposição dos mesmos. A figura abaixo mostra a superposição de
uma seqüência integralmente seqüenciada em nosso laboratório para a qual foram
utilizadas duas clivagens enzimáticas com Endo-Lys e Endo-Glu. Note que os peptídeos
gerados tem número de resíduos inferior a 50 resíduos e que foi possível a
superposição dos mesmos para determinar-se a seqüência completa da proteína.

N-terminus (proteína intacta) 10 20 25

( )
K1 K2
E1 E2 E3 E4
D D C S I L E L L K V K N Q W R E A F G E G H H R
30
N-terminal (proteína intacta) 40 ( ) 50
K2 K3 K4 K5
E4 E5 E6
V Q F G L E L W K R F F D T H P E V K G L F K G V

60 K6 70 75
K5
E6 E7 E8
N G D N I Y S P E F A A H A E R V L S G L D M T I
80 90 100
K6 K7 K8
E8 E9
G L L D D T N A F K A Q V T H L H S Q H V E R S I
110 120 125
K8 K9 K10
E9 E10 E11
N P E F Y E H F L G A L L H V L P K Y L G T K L D
130 140
K10 K11
E11
Q D A W T K C F H T I A D G I K G

Para a detecção dos resíduos de cisteína, faz-se necessária uma modificação

deste aminoácido, denominada reação de piridiletilação. Esta reação é realizada após a
redução das pontes de dissulfeto, geralmente com ditiotreitol (DTT) em excesso molar
de 30-50 vezes por 4 horas a 50ºC. Em seguida são adicionados 5µL de 4-vinilpiridina,
o qual reage com os grupamentos –SH livres, sob nitrogênio, ao abrigo da luz por 4
horas a temperatura ambiente.

A figura abaixo mostra o diagrama do aparelho de seqüenciamento automático.

Diagrama esquemático do sequenciador de proteínas

A amostra é aplicada no cartucho de reação, onde ocorre o acoplamento e a

clivagem, em seguida o derivado anilinotiazolinona-aminoácido (ATZ-aa) é transferido
para o frasco de conversão, onde é convertido a feniltiohidantoína-aminoácido (PTH-aa)
e finalmente é transferido para o sistema de injeção do HPLC.
Os solventes e reagentes utilizados em cada etapa são dados na tabela abaixo
na ordem em que eles são utilizados.
Reagentes e respectivas funções na degradação de Edman.

Acoplamento
Reagente Função
PITC em n-heptano Derivatiza o terminal amínico da R1 e R2 são alternados de
(R1) proteína modo a favorecer o
N-metilpiperidina/ Basifica o meio de acoplamento rendimento da reação.
água/metanol (R2) pelo PITC.
Acetato de etila (S2) São utilizados em conjunto após o acoplamento para a
Cloreto de butila (S3) extração do excesso de PITC e subprodutos.
Clivagem
Ácido trifluoroacético Cliva o resíduo recém acoplado, produzindo o ATZ-aa
(TFA) (R3) liberando o penúltimo resíduo para o próximo ciclo.
Transferência do ATZ-aa
Acetato de etila (S2) Extrai o ATZ-aa levando para o frasco de conversão.
Acetonitrila a 20% em É adicionada ao frasco de conversão para receber o ATZ-aa
água (S4) evitando a exposição às paredes quentes do frasco (em 64ºC)
Conversão
TFA 25% em água Converte ATZ-aa a PTH-aa. Esta etapa é realizada após a
com ditiotreitol (R4) evaporação dos solventes utilizados na transferência para o
frasco de conversão.
Acetonitrila (R5) Dissolve os PTH-aa e é o solvente de injeção no HPLC.

A próxima figura mostra os gráficos de saída do seqüenciador automático (vide

cromatogramas na próxima página), ao final de cada ciclo de reações é obtido um
cromatograma que permite a identificação do resíduo em questão, os cromatogramas
definem a seqüência do peptídeo.
A seqüência obtida por estes cromatogramas foi DDXSILELL, o X como discutido
anteriormente foi uma cisteína não detectada, dado que a amostra não estava
piridiletilada.
BIOINFORMÁTICA

A utilização da informática na pesquisa biomédica tem sido de grande utilidade,

podendo chegar a ser imprescindível em alguns setores da bioquímica e biologia
molecular, como nos estudos de genomas e proteomas. A principal aplicação da
bioinformática se encontra na organização e processamento da gigantesca quantidade
de dados gerados, os quais são armazenados em bancos de dados, de forma que as
informações geradas em laboratórios do mundo inteiro podem ser comparadas.
Os bancos de dados podem armazenar dados de seqüências de DNA, RNA e
proteínas, imagens (no caso de estudos de proteoma) e informações estruturais de
proteínas.
Como exemplo da aplicação da bioinformática na química de proteínas, está a
identificação de proteínas desconhecidas. A partir da obtenção da seqüência de
aminoácidos parcial de uma determinada proteína, N-terminal ou de um fragmento
interno, submete-se este resultado para comparação com banco de dados de
seqüências já conhecidas. As informações são cruzadas e uma relação de seqüências
similares com aquela submetida é gerada, permitindo a identificação da proteína
“desconhecida”.
Outra aplicação importante da bioinformática se encontra nos estudos da
relação entre a estrutura e função das proteínas. A observação de estruturas
tridimensionais de proteínas permite o entendimento de seu funcionamento, que por sua
vez pode ser aplicado no desenvolvimento de novos medicamentos, por exemplo.
Durante este curso, várias aplicações da bioinformática serão ilustradas para o
entendimento de sua importância na pesquisa atual.
 EXPERIMENTOS A SEREM REALIZADOS NO CENTRO DE QUÍMICA DE
PROTEÍNAS – GRUPO C

Os experimentos terão enfoque na utilização das técnicas de química de

proteínas para identificação e caracterização de diferentes tipos de hemoglobinas
humanas.
As amostras serão distribuídas aos grupos e serão tratadas como
“desconhecidas”. O objetivo dos experimentos será o de identificar e quantificar cada
uma das amostras.
O diagrama abaixo ilustra toda a abordagem que será utilizada.

4 AMOSTRAS
"DESCONHECIDAS" (Hb
humanas)

2º Aula 2º Aula 1ºAula

Quantificação por Separação das cadeias cada

Eletroforese Hb (NATIVA)
densitometria Hb (Cromatografia em HPLC)

2º Aula 2º Aula

Estimativa de Massa
Eletroforese Cadeias (SDS)
Molecular

3º Aula

Quantificação de Proteína -
Análise de Aminoácidos

4º Aula 4º Aula

Identificação das cadeias

Seqüenciamento N-terminal
Bancos de Dados e Estrutura
Aula 1 – Separação de proteínas
A mistura de proteínas de interesse (de cerca de 100µ g) será separada em
equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência composto por duas bombas
acopladas a um controlador de gradiente, um espectrofotômetro de fluxo e um
registrador gráfico.
Para a separação, será utilizada uma coluna C18 de dimensões 4,6X 250mm,
eluída com fluxo de 1ml/min utilizando como solventes solução aquosa de ácido
trifluoracético (TFA) 0.1% (v/v) (solvente A) e solução aquosa de TFA 0.09% e
acetonitrila (ACN) 80% (v/v) (solvente B). O monitoramento da separação será realizado
pelo espectrofotômetro utilizando-se duplo comprimento de onda: 220nm para detecção
de ligações peptídicas e 280nm para detecção de anéis aromáticos (tirosina).
As proteínas separadas serão coletadas manualmente para utilização nos
experimentos seguintes.

Aula 2 – Eletroforese de proteínas

Serão utilizados nos experimentos de separação das hemoglobinas (eletroforese
nativa) e suas cadeias (SDS-PAGE), um gel homogêneo 20% (PhastGel), com 32 mm
de comprimento e 0,45 mm de espessura num sistema tampão de acetato 0,112M e tris
0,112M em pH 8,8. A corrida será realizada a 12,5mA, com 600V, por um período de
tempo de 1h, com aproximadamente 4 µg de proteína por poço.
Os resultados da eletroforese nativa fornecerá resultados para a caracterização
das amostra como provenientes de indivíduos homozigotos ou heterozigotos. O padrão
de migração das hemoglobinas ainda indicará as prováveis mutações de suas cadeias.
Será utilizada a eletroforese em meio desnaturante (SDS-PAGE) para a
estimativa de massa molecular das cadeias de Hb separadas na cromatografia.
A quantificação e medidas de migração serão calculadas através da
densitometria pelo software Image Master.

Aula 3 - Análise de Aminoácidos

As cadeias de Hb separadas por HPLC serão caracterizadas e quantificadas
pela metodologia da análise de aminoácidos descrita anteriormente nesta apostila
Inicialmente realiza-se a hidrólise ácida (fase vapor) 10µg de proteína ou
peptídeo em tubos de borosilicato (500µL), livre de sais, açúcares, lipídeos ou
detergentes. Estes tubos são acondicionados em um frasco maior (40mL), ao qual se
adiciona de 300 a 400µL de ácido clorídrico 6M, bi-destilado a 104ºC, contendo fenol
0,1%. Passa-se corrente de nitrogênio no frasco maior e posteriormente é feito vácuo
por 20 minutos. As amostras são então hidrolisadas em fase vapor a 110ºC por 22h.
Após a hidrólise, o ácido é removido através de secagem a 40ºC por 90min em
concentrador Speedvac. A amostra é neutralizada com solução aquosa, contendo 40%
em metanol e 20% em trietilamina (TEA, v/v), sendo novamente seca em Speedvac. A
derivação dos aminoácidos é realizada à temperatura ambiente (22-24ºC) por 20
minutos com uma solução metanólica contendo água 10%, TEA 10% e PITC 5% (v/v).
Após a reação, as amostras são completamente secas em Speedvac durante 1h a
40ºC.
A separação cromatográfica é realizada em sistema dedicado de cromatografia
de fase reversa (RP-HPLC) composto por duas bombas, espectrofotômetro, utilizando
coluna cromatográfica do tipo Picotag C18 (3,9×150mm). Utiliza-se solução (solvente A)
de acetato de sódio 0,14M, pH 5,6 e TEA 0,5% (v/v) e solução (solvente B) aquosa de
acetonitrila 60% (v/v); para eluição dos derivados em gradiente de10 a 54% de solvente
B. A separação é realizada a 37ºC. As amostras são diluídas (100-500µL) em solução
de acetato de sódio 0,14M, pH 7,5, contendo 5% de acetonitrila, aplicando-se 20µl no
equipamento, desta forma do total hidrolisado apenas 2,5-20% são utilizados na
análise. Esta porcentagem de injeção minimiza os efeito de background.
A quantificação de cada análise é realizada através da injeção prévia de solução
padrão contendo 100pmol de cada aminoácido, derivado simultaneamente com as
amostras

Aula 4 - Seqüenciamento E Bioinformática

As proteínas separadas por cromatografia serão submetidas ao seqüenciamento
N-terminal para a identificação das cadeias e também para a detecção de mutações
característica de anemia falciforme. Os dados de seqüência serão submetidos aos
bancos de dados de seqüência (BLAST P) para confirmação das seqüências.
A partir da estrutura da hemoglobina, serão feitas as observações referentes a
posição do aminoácido responsável pela anemia falciforme para um melhor
entendimento da sua função na estrutura da hemoglobina.