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DEG 8 Enzimas
DEG 8 Enzimas
Enzimas
Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular
Biology, 7ed. Página 581-
o = Vmax[S]
Km + [S]
Onde Vmax é o valor máximo da velocidade inicial quando todos os sítios ativos estão
ocupados, Km é a constante de Michaelis e [S] é a concentração do substrato. Em baixas
concentrações do substrato a ocupação dos sítios ativos das enzimas é baixa e a
velocidade da reação é diretamente relacionada ao número de sítios ocupados. Isto é,
próxima da cinética de primeira-ordem em que a velocidade é proporcional à
concentração do substrato. Em concentrações altas do substrato, todos os sítios ativos
são ocupados e a reação torna-se independente da concentração do substrato, pois não
há como formar mais complexos enzima-substrato (ES), observando-se assim uma
cinética de ordem-zero ou de saturação em relação ao substrato. Sob estas condições a
velocidade da reação é somente dependente da conversão do complexo enzima-
substrato, ES, em produto (P) e da difusão dos produtos a partir da enzima.
Pode ser observado a partir da equação 15.1 que quando o =0.5 Vmax, Km=[S]. Então,
Km é numericamente igual à concentração do substrato quando a velocidade inicial é
igual à metade da sua velocidade máxima (Figura 15.3) tendo como unidade a
molaridade. Valores de Km estão na faixa de 10-2 a 10-5 M e são importantes pois
permitem calcular a concentração do substrato necessária para saturar todos os sítios
ativos da enzima. Quando a [S]>>Km, a equação 15.1 é reduzida a o Vmax, mas um
simples cálculo revela que quando [S] = 10 Vmax, o é somente 90% Vmax e que quando
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[S] = 100 Km, o =99 % Vmax. Apreciações deste tipo são importantes para os ensaios
enzimáticos.
k1[E][S] = k-1[ES]
Portanto,
Ks = [E][S] = k-1 = 1
[ES] k1 Ka
Pode ser observado que quando o Ks é numericamente grande, o equilíbrio está a favor
das formas E e S livres. Por outro lado, quando o Ks é numericamente pequeno, o
equilíbrio está a favor da formação do complexo ES. Portanto, Ks é inversamente
proporcional à afinidade da enzima pelo substrato.
Km = k2 + k-1 = Ks + k2
k1 k1
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estas duas constantes torna-se mais complicada pelo fato de que para algumas reações
enzimáticas dois produtos (P1 e P2) são gerados sequencialmente, cada um deles
controlado por constantes de velocidade diferentes. Portanto, cuidados devem ser
tomados na interpretação do significado de Km em relação ao Ks. A relação matemática
entre Km e Ks e Km e afinidade da enzima pelo substrato só pode ser apreciada
totalmente somente quando o mecanismo completo da reação é conhecido.
Embora a equação de Michaelis e Mentem possa ser usada para o cálculo de Vmax e Km,
seu uso é sujeito a dificuldades na determinação experimental de o em altas
concentrações de substrato, em outras palavras, na extrapolação da curva hiperbólica
para obtenção de um valor exato de Vmax. Transformações lineares da equação de
Michaelis e Mentem são alternativas comumente utilizadas. O mais popular destes é a
equação de Lineweaver-Burk obtida tomando-se o recíproco da equação de Michaelis
e Mentem.
1 = Km 1 + 1
o Vmax [S] Vmax
O gráfico de 1/o (y) versus 1/[S] (x) resulta em uma reta, onde a inclinação é Km/Vmax,
o intercepto no eixo 1/o é igual a 1/Vmax e o intercepto no eixo 1/[S] é igual a -1/Km.
Gráficos alternativos são baseados na equação de Hanes e na de Eadie-Hofstee.
Também existem softwares de regressão não linear como o DynaFit (www.biokin.com)
e BRENDA (www.brenda-enzymes.info), os quais são utilizados preferencialmente em
casos onde se requer dados precisos de cinética.
kcat = Vmax
[Et]
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Pode ser observado para reações enzimáticas monosubstrato que eles obedecem a
cinética de Michaelis e Mentem:
o = k2[E][S]
Km + [S]
E, portanto,
o = k2 [E]
(Km/[S]) + 1
o = k2 [E]
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CH2COOH CH2COOH
CH2COOH COOH
Ácido succínico (Substrato) Ácido malônico (Inibidor)
Todos os inibidores reversíveis são caracterizados por uma constante de dissociação, Ki,
chamada de constante de inibição, que pode estar relacionada com a constante de
dissociação de EI (KEI) ou de ESI (KESI). Para inibidores competitivos as duas equações
seguintes pode ser escritas como:
E+S ES E+P
E+I EI sem reação
Como a ligação do substrato e do inibidor ocorrem no mesmo sítio, o efeito do inibidor
pode ser desfeito aumentando-se a concentração do substrato. O resultado é que o Vmax
não se altera, mas a concentração necessária para atingir o Vmax é aumentada de forma
que quando o = 0.5 Vmax:
[S] = Km 1 + [I]
Ki
Pode ser observado pela equação acima que Ki é igual à concentração do inibidor que
aparentemente dobra o valor de Km. Com este tipo de inibidor, Ki é igual a KEI, enquanto
KESI é infinito pois ESI não é formado. Na presença de inibidor competitivo, a equação
de Lineaweaver-Burk torna-se:
1 Km 1 [I] 1
= 1+ +
0 Vmax [S] Ki Vmax
entanto, valore mais preciso é obtido através de um segundo gráfico (Figura 15.6,
página 593). A reação é conduzida para várias concentrações do substrato na presença
de algumas concentrações de inibidor, e em seguida constrói-se um gráfico de
Lineawever-Burk para cada concentração do inibidor. Um segundo gráfico é construído
plotando-se os diferentes valores de inclinação ou de Km aparente [Km’, que é igual a Km
(1+ [I]/Ki) e que pode ser determinado através do intercepto no eixo 1/[S] ] versus
concentração do inibidor. Em ambos os gráficos o intercepto no eixo de [I] dá o valor de
–Ki.
1 Km 1 1 [I]
= + 1+
0 Vmax [S] Vmax Ki
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Para alguns inibidores o complexo ESI possui alguma atividade catalítica ou o KEI e
KESI não são iguais e nem infinitos. Nestes casos são obtidas cinéticas de inibição do
tipo misto. Na inibição mista as retas obtidas nas reações sem inibidor e com inibidor
sofrem intersecção acima ou abaixo do eixo 1/[S]. O valor de Ki pode ser determinado
através de um segundo gráfico de inclinação ou de 1/Vmax’ versus a concentração do
inibidor. Em ambos os gráficos o intercepto no eixo de [I] dá o valor de –Ki. A inibição
não-competitiva pode ser classificada como um tipo especial de inibição mista.
Inibição irreversível