Determinação da Eficácia de Sistemas de Barreira Estéril contra desafios

microbianos durante transporte e armazenamento

Hartmut Dunkelberg, MD; Ulrich Schmelz, MD

Tradução livre:Rosana Sampaio

Objetivo. O nível de garantia de esterilidade de 10 -6 é um padrão estabelecido que

define a qualidade dos produtos estéreis. O objetivo do estudo foi desenvolver um
método que correlacionasse os resultados dos testes de barreira microbiana de
sistemas de barreira estéril flexíveis com o desafio microbiano estimado que a
embalagem encontra durante o armazenamento e transporte.

Métodos. A eficácia da embalagem de barreira microbiana foi determinada pela

utilização de um teste de exposição da câmara com 20 variações de temperatura
atmosféricas periódicas de 37,5mmHg e 52,5 mmHg. Embalagens para esterilização
flexíveis foram utilizadas como sistemas de barreira estéreis. O valor de redução
logarítmica de um sistema de barreira estéril foi calculado com base em resultados
experimentais e comparado com o valor de redução logarítmica requerido pelos
desafios microbianos para manter a esterilidade durante o transporte e o
armazenamento.

Resultados. Para embalagens feitas de papel e material de filme plástico, o valor

de redução logarítmica de 5,4 foi obtido com base em 30 de 99 lâminas que se
tornaram não estéreis após exposição a uma diferença em variações de pressão
atmosférica periódicas de 37,5 mmHg. Para embalagens feitas de papel e material
de filme plástico, um valor de redução logarítmica de 5,2 foi obtido com base em
48 de 100 lâminas que se tornaram não estéreis após exposição a uma diferença
de pressão atmosférica de 52,5 mmHg. Para embalagens feitas de material tecido
não tecido e material de filme plástico, o valor de redução logarítmica de 6,38
(exemplo 3 de 99 lâminas se tornaram não estéreis após exposição a uma
diferença de pressão de 37,5 mmHg) e 6,07 (exemplo 3 de 99 lâminas que se
tornaram não estéreis após exposição a uma diferença de pressão de 52,5 mmHg)
foram obtidos. Ao calcular um desafio microbiano esperado durante o transporte e
armazenamento que requer propriedades de barreiras que correspondem a um
valor de redução logarítmica de 5,83 e levando em conta o nível de garantia de
esterilidade, concluímos que somente as embalagens feitas de material tecido não
tecido atenderam aos padrões Europeus EN 556-1.

Conclusões. Ao utilizar os dados obtidos em um teste de exposição microbiana

com uma taxa de fluxo específica de um aerossol bacteriano, concluímos que a
eficácia do sistema de barreira estéril contra o desafio microbiano atual pode ser
examinada e avaliada no nível de garantia de esterilidade de 10-6.
Um requisito essencial para sistemas médicos de embalagens esterilizadas é que
deve-se manter a esterilidade dos objetos fechados pelo tempo de prateleira
especificado durante o transporte e armazenamento. Na prática, há tipos bem
diferentes de sistemas de barreira estéreis (exemplo: embalagens para
esterilização flexíveis de papel ou de material tecido não tecido e filme plástico,
bolsas de esterilização de papel de grau médico poroso e alumínio de reuso rígido
ou caixas de esterilização de aço inoxidável). A forma específica dos produtos
médicos, seu uso pretendido, os procedimentos de esterilização considerados, e as
condições de transporte influenciam a escolha do material para os sistemas de
embalagem. Em hospitais, pratica-se a esterilização por meio de vapor, óxido de
etileno ou processos de oxidação. O sistema de barreira estéril possui um
componente permeável que permite a entrada do agente esterilizante. Por
exemplo, o papel para embalagens deve estar de acordo com os requisitos do
Padrão Europeu EN 868-3 (exemplo, o diâmetro do poro médio deve ser menor ou
igual a 35 µm, com um diâmetro do poro máximo de 50 µm).
No entanto, devido à possibilidade de micro-organismos serem menores que este
limite de tamanho, há um risco que a bactéria penetre na embalagem. O desafio
microbiano para embalar varia bastante de acordo com as condições ambientais.
Ele é afetado por muitos fatores, tais como condições de armazenamento (limpeza
e temperatura) e transporte, que podem ser associados com uma carga microbiana

alta e/ou variações de temperatura e pressão meteorológica.

Pelos meios do teste de esterilidade, alguns estudos tentaram demonstrar que as

embalagens adequadamente protegem o produto contra recontaminação durante o
armazenamento e que elas mantêm a esterilidade. Porém, o teste de esterilidade
sofre com diferentes limitações metodológicas. É verdade que a “esterilidade” é um
termo absoluto, mas a confirmação de que qualquer produto seja estéril pode
apenas ser definida em termos de uma função de probabilidade. Em concordância,
a esterilidade é definida por um nível mínimo aceitável de garantia de esterilidade,
que limita a probabilidade de uma unidade não estéril a 10-6. Um total de 3,8
milhões de itens tiveram que ser testados para que se confirmasse que o lote de
um produto estava estéril em conformidade com o nível de garantia de esterilidade
(com 95% de intervalos de segurança [IQ]). Além disso, os testes de esterilidade
acarretam riscos de contaminação microbiana acidental que resultam em leituras
falso-positivas. Com referência a essas limitações o US Food and Drug
Administration determinou que “os testes de esterilidade não são recomendados
como componente do programa de estabilidade para confirmação da continuidade
da esterilidade durante a vida de prateleira de um produto ou período de validade”.
Métodos alternativos podem ser mais confiáveis para confirmar a integridade de
uma caixa e um sistema de fechamento como um componente de protocolo de
estabilidade para produtos estéreis.
Em alguns artigos anteriores, descrevemos métodos quantitativos para mensuração
de eficácia da barreira de toda a embalagem final através do teste de câmara de
exposição. O objetivo do estudo era desenvolver um método que correlacionasse os
resultados dos testes de barreira microbiana de sistemas de barreira estéril
flexíveis com o desafio microbiano estimado que a embalagem encontra durante o
armazenamento e transporte. Este procedimento tinha a intuito de estabelecer se
as propriedades das barreiras do sistema de embalagem eram suficientes para
manter a esterilidade sob condições específicas de transporte e armazenamento em
um nível de garantia de esterilidade de 10-6.

MÉTODOS
Dois tipos de embalagens para esterilização foram utilizados como sistema de
embalagem médica. Um tipo consistia em um filme plástico de um lado e papel do
outro. O outro tipo consistia em filme plástico de um lado e material tecido não
tecido feito de fibra de polietileno de alta densidade do outro lado. De acordo com o
declarado pelo fabricante, os materiais embalados utilizados eram capazes de
suportar esterilização a vapor a 121ºC. Lâminas termo resistentes descobertas
(diâmetro de 90 mm) preenchidos com 25 mL de casein-peptone soymeal peptone
agar (Oxoid) foram embaladas com tais embalagens. Uma série de testes
compreenderam embalagens nas quais as lâminas de ágar descobertas foram
posicionadas com o lado aberto sob a superfície de papel ou material tecido não
tecido. Em uma outra série de testes, os lados abertos foram posicionados abaixo
do lado do filme plástico. Após seladas, as embalagens foram esterilizadas a 121ºC
por 20 minutos com um ciclo de secagem de 30 minutos (autoclave ELV; Systec). A
execução das máquinas de esterilização foi monitorada periodicamente com
indicadores de vapor biológico (Spore – O – Check; ATI). Após o ágar ter resfriado
para uma temperatura abaixo de 40ºC e solidificado, as embalagens teste foram
removidas da autoclave.
Uma câmara de exposição com capacidade de 0,24m3 foi equipada com um
nebulizador (Pari Juniorboy; PARI) e uma bomba de aspiração (Sartorius MD2;
Sartorius). A pressão na câmara foi medida digitalmente com um medidor de
pressão (Testo 525; Testo). A pressão atmosférica foi periodicamente reduzida a
37,5mmHg ou 52,5 mmHg. Cada período de ciclo durou 6 minutos. Umidade e
pressão foram continuamente registradas. Por meio do nebulizador, 5 mL de uma
suspensão de Micrococcusluteus numa concentração de 108 organismos/mL foi
aplicada para produzir um aerossol microbiano na câmara de exposição.
Quando a válvula foi aberta, no intuito de equalizar a diferença em pressão
atmosférica (a partir daqui, “diferença de pressão”) o aerossol passou a válvula e
se dispersou na câmara. Seis lâminas descobertas estabelecidas com o nutriente
ágar foram expostas como controles nas bandejas dentro da câmara, para detectar
superfícies de cargas microbianas durante o teste.
Para cada grupo de teste, 100 embalagens foram utilizadas. As embalagens foram
submetidas a 20 variações de pressão atmosférica periódicas em 2 horas. Para 1
execução de teste, de 7 a 8 embalagens de 4 grupos de teste por diferença de
pressão (no máximo 32 embalagens) poderiam ser posicionadas dentro da câmara;
13 execuções cada foram necessárias para os testes com diferença de pressão de
37,5mmHg a 52,5 mmHg.
Após a exposição, as embalagens foram incubadas a 36ºC por 48 horas. O
crescimento microbiano foi reportado como unidades de formação de colônia (ufc –
unidades formadoras de colônia) por área de superfície; 95% dos IQ (indicadores
químicos) foram calculados para o número de embalagens não estéreis por grupo
de teste e para a contagem microbiana total.
Se o crescimento da colônia foi observado, uma solução penetrante com tinta foi
aplicada à borda que sela a embalagem para identificar qualquer fenda. Se houver
alguma fenda na borda selada, a leitura é desconsiderada.
A eficácia das embalagens com barreira microbiana foi expressa conforme o valor
de redução logarítmica (LRV). O LRV foi calculado utilizando a seguinte equação:

LRV = logN _logN ,

onde N0 é o número significativo calculado de bactérias presentes no volume total
de ar que passa pelo sistema de poros da embalagem durante as 20 variações de
pressão atmosféricas periódicas de 37,5mmHg ou 52,5 mmHg, respectivamente.
A contagem bacteriana no ar significativa por cm3 na exposição da câmara foi
calculada por meio do consumo da suspensão bacteriana e a saída do aerossol
durante as variações de pressão. Em nosso estudo, não foi empregado um
classificador de ar para monitorar a concentração bacteriana na câmara de
exposição. No entanto, um impinger (impactador) todo de vidro foi utilizado após
tais experimentos, para provar e monitorar os micro-organismos suspensos no ar
na câmara de exposição. N1 é o número de bactéria reportada como ufc nas
lâminas na embalagem após a incubação. O volume de ar na embalagem foi de
aproximadamente 120 cm3. O volume de ar que passa pela embalagem de material
poroso como resultado da mudança de pressão de 37,5 mmHg poderia ser
calculado como 5,64cm3. Um volume total de 112,8cm3 foi obtido para 20 variações
de pressão periódicas. Para uma mudança de pressão atmosférica de 52,5 mmHg,
o volume de ar que passa pela embalagem foi de 7,76 cm3. Utilizando 2 exemplos,
calculamos as propriedades de barreiras requisitadas no que se refere a seu LRV
estimando tanto o volume de ar que potencialmente penetra na embalagem
durante o transporte e o armazenamento quanto na carga microbiana suspensa no
ar (N estimado) deste volume. Um fator de segurança (SF) de 106 foi incluído no
intuito de atingir o nível mínimo aceitável de garantia de esterilidade de 106.
Baseado nestas suposições, a eficácia necessária da embalagem de barreira
microbiana no que se refere a LRV necessário foi calculada da seguinte forma:

LRV necessário = logN estimado _log SF,

onde N estimado é o número estimado de bactérias presentes no volume total de ar
que passa pela parte porosa do sistema de embalagem durante os diferentes
estágios e períodos de tempo de armazenamento e transporte.
No exemplo 1, as seguintes condições foram especificadas: armazenamento de
embalagens em áreas com ar condicionado de um departamento de esterilização
central por 100 dias, 10 variações de pressão atmosférica de aproximadamente
11,2 mmHg e uma concentração total de micro-organismos suspensas no ar de 30
cfu/cm3. No exemplo 2, as seguintes condições foram especificadas:
armazenamento de embalagens em um armazém por 100 dias com variações de
temperatura significativas de aproximadamente 11,2 mmHg e uma concentração
total de micro-organismos suspensos no ar de 1.000 ufc/cm3.
Exemplos de estágios de transporte e armazenamento tipicamente associados à
passagem de ar pelo material poroso da embalagem são os seguintes: variação na
pressão do ar durante o armazenamento, variações na altitude durante o
transporte em elevadores, rotas de transporte de diferentes altitudes acima do
nível do mar e a passagem de ar na embalagem causada pelas variações da
temperatura do meio ambiente.

RESULTADOS
Após a exposição da embalagem para esterilização flexível (feitos de papel ou
componente tecido não tecido) para variações de pressão de 37,5mmHg ou 52,5
mmHg, não se observou crescimento microbiano nas lâminas se o lado do filme
plástico estivesse posicionado acima da superfície ágar. Este resultado mostra que
o lado do filme plástico não era permeável aos micro-organismos. Posicionar as
superfícies ágar descobertas sob o lado do papel resultou em um aumento no
número de lâminas recontaminadas, para ambos os tipos de embalagens e para
exposição de ambas variações de pressão de 37,5mmHg e 52,5 mmHg. Para 99
lâminas cobertas por papel e material filme plástico (1 embalagem foi excluída da
análise devido a uma fenda na borda selada da embalagem), a exposição a uma
diferença de pressão de 37,5mmHg resultou em 30 lâminas não estéreis (95% de
Indicadores Químicos - 20,2 a 39,0 lâminas não estéreis). Para 100 embalagens
feitas de papel e material de filme plástico, a exposição a uma diferença de pressão
de 52,5 mmHg resultou em 48 lâminas não estéreis (95% de Indicadores Químicos
– 38,2 a 57,8 lâminas não estéreis).
Para as 99 embalagens feitas de material tecido não tecido ou material de filme
plástico (1 embalagem foi excluída da análise devido a uma fenda na borda selada
da embalagem) a recontaminação de 3 lâminas foi observada (95% de Indicadores
Químicos - 0 a 6,3 lâminas) que foram expostos a uma diferença de pressão de
37,5 mmHg. Para as 100 embalagens feitas com material tecido não tecido ou
material de filme plástico que foram expostas a uma diferença de pressão de 52,5
mmHg, a recontaminação foi observada em 7 lâminas (95% de Indicadores
Químicos - 2 a 12 lâminas). A carga microbiana da superfície significativa foi de
3,141 ufc por lâmina determinada (95% de Indicadores Químicos – 2,999 a 3,285
ufc por lâmina determinada) para execuções de teste expostas a uma diferença de
pressão de 37,5 mmHg e 3,516 por lâminas determinadas (95% de Indicadores
Químicos – 3,425 a 3,607 ufc por lâmina determinada) para execuções de teste
expostas a uma diferença de pressão de 52,5 mmHg.
FIGURA: Resultados obtidos para determinar a eficiência das embalagens de papel
e filme plástico e as embalagens de filme plástico e material tecido não tecido
contra os desafios microbianos, por meio do teste da câmara de exposição.
Barras cinzas, números de embalagens avaliadas (axial esquerda); barras
paralelas, número de embalagens nas quais o lâmina de ágar tinha crescimento
microbiano (axial esquerda); setas e dados numéricos nas caixas, número total de
unidades de formação de colônias (ufc) nas lâminas.

O valor de ar que passa pela embalagem exposta a uma diferença de pressão de

37,5 mmHg foi de 5,64 cm3. O volume de ar que passa pela embalagem exposta a
20 variações de pressão periódicas foi de 112,8 cm3. Com uma concentração de
micróbios significativa calculada na câmara de exposição de 6,5 x 108 ufc/cm3 para
testes que empregaram uma diferença de pressão de 37,5 mmHg, a carga de ar
significativa (N0) em um volume de 112,8 cm3 foi de 73,320 ufc. Para testes
empregando uma diferença de pressão de 52,5 mmHg, a concentração microbiana
significativa calculada foi de 5,3 x 108 ufc/m3. Utilizando um número significativo
de 1,02 ufc (N1) por embalagem de papel e filme plástico em um teste que
empregou uma diferença de pressão de 37,5 mmHg, um LRV de de 4,9 foi obtido.
Se o LVR não foi calculado pelo número de micro-organismos de entrada na
embalagem, mas pelo número de embalagens não estéreis (exemplo 30 de 99
lâminas), um LRV de 5,4 foi medido. Com uma diferença de pressão de 52,5
mmHg, LRVs de 4,6 e 5,2, respectivamente, foram resultados sob as mesmas
condições de teste com o mesmo tipo de embalagem. Para embalagens feitas de
material tecido não tecido e material de filme plástico, LRVs de 6,38 (exemplo 3 de
99 lâminas se tornaram não estéreis após serem expostos a 52,5 mmHg de
diferença de pressão) foram obtidos.
Os dois exemplos com condições de exposição diferentes foram utilizados para
avaliar os desafios microbianos originais durante transporte e armazenamento. A
eficiência necessária da embalagem com barreira microbiana em termos de LRV
necessário correspondente ao exemplo 1 foi calculada da seguinte forma: uma variação
de pressão atmosférica de 11,2 mmHg levou a uma variação no volume de
1,751cm3. O volume total do ar que passa pela embalagem porosa foi de 17,51
cm3, e é composta de uma carga microbiana de 0,0005253 ufc ou log Nestimado = -
3,28. De acordo com exemplo 1, as propriedades de barreira da embalagem
necessárias foram LRVnecessário = 2,72 (log 0,0005253 + log 106 = 2.72). Uma
comparação das propriedades de barreira em termos de LRVnecessário para condições
de armazenamento encontradas no exemplo 1 (com os resultados determinados
experimentalmente pelos meios do teste da câmara de exposição) mostra que as
embalagens com o componente de papel assim como as embalagens com o
componente tecido não tecido inequivocadamente preenchem a necessidade do
Padrão Europeu EN 556-1.
No caso do exemplo 2, os seguintes resultados foram obtidos para o volume de ar
que passou pela embalagem. Ao armazenar as embalagens em um armazém por
100 dias com variações de temperatura diárias significativas de 15ºC utilizando a
fórmula

V = V0 (1 - t/273,15)
Onde V é o Volume após a mudança de temperatura, V0 é o volume na temperatura
inicial e t é a mudança de temperatura em graus Celsius, concluímos que ΔV
temperatura = 659cm3, onde ΔV temperatura é o volume total do fluxo de ar dentro da
embalagem durante 100 dias esperado para uma variação de temperatura. Houve
10 variações de pressão atmosférica de aproximadamente 11,2 mmHg que
resultaram em ΔV clima p 17,51 cm3, onde ΔV clima é a mudança no volume de ar
esperado em uma variação de clima (exemplo: mudança de pressão atmosférica).
O volume total de ar medido fluindo dentro da embalagem foi de 676,5 cm 3. A
carga microbiana correspondente a 1.000 ufc/m3 foi de 0,6765 ufc(log 0,6765 = -
0,1697). Ao calcular as propriedades de barreira necessárias (LRVnecessário) de
acordo com o exemplo 2, encontramos LRV necessário = 5,83. Ao comparar tais
resultados com os dados experimentais, concluímos que a embalagem de papel e
de filme plástico ( com LRVs de 5,4 e 5,2 baseado em diferença de pressão de
37,5mmHg e 52,5 mmHg, respectivamente) não possui uma eficácia de barreira
suficiente para o transporte e armazenamento fornecidos, de acordo como exemplo
2. No entanto, a embalagem de material tecido não tecido e filme plástico com
LRVs de 6,38 e 6,07 baseados em diferença de pressão de 37,5mmHg e 52,5 mm
Hg, respectivamente, claramente preenchem as necessidades do Padrão Europeu
EN 556-1.

DISCUSSÃO
A carga microbiana do ar ambiente é objeto de inúmeras influências do meio
ambiente, tais como atividades ocupacionais, fatores sazonais e que dependem do
clima, assim como recursos de ar condicionado dentro dos prédios. Nas salas dos
hospitais, a concentração de micro-organismos varia em sua maioria entre 102 e
103 ufc/m3, com exceção das salas altamente limpas, tais como unidades de
tratamento intensivo e salas de cirurgia. A fração da carga microbiana com um
tamanho particular inferior a 3,0 µm variou entre 17% e 31% durante um período
de investigação de 1 ano. As espécies mais frequentemente isoladas em prédios de
hospitais foram cocci gram-positivo, tais como Staphylococcus epidermidis e
Staphylococcus homini. A carga microbiana suspensa no ar pode ser um importante
fator no desafio microbiano dos sistemas de barreira estéreis.
Uma observação crítica deve ser feita: a precisão dos resultados obtidos no estudo
presente é limitada, porque um classificador de ar não foi utilizado para monitorar a
concentração bacteriana na câmara de exposição.
Uma data de expiração (validade) é utilizada frequentemente por hospitais para
garantir a esterilidade de produtos médicos esterilizados e embalados. No entanto,
em certos estudos, têm sido mostrado que a desatualização dos eventos
relacionados tem sido apoiada, devido aos benefícios de custo especial. A conclusão
extraída dos resultados destes estudos que relaciona a vida na prateleira dos
materiais industrializados esterilizados foi que a embalagem permaneceu
esterilizada indefinidamente ou até que um evento tenha comprometido a
integridade da embalagem. A esterilidade seria mantida se um evento especial
(exemplo: gotas, falhas, umidade) que comprometesse a integridade da
embalagem não pudesse ser identificado. Portanto, mudanças proeminentes
relativas são conhecidas como “eventos”. Esta abordagem assume que a
embalagem é normalmente uma barreira impermeável absoluta para micro-
organismos e ignora o fato de que a embalagem esterilizada por meio de vapor ou
óxido de etileno tem um componente vapor permeável e gás permeável com
diâmetros do poro significativos até 35 µm e uma permeabilidade requerida para ar
de 11,02 mmHg de 3L/minuto, para uma área de 100 cm 2 (exemplo: EN 868-3).
Deve-se notar que, neste contexto, os padrões EN se aplicam à Europa, mas não
aos Estados Unidos. Conforme mostramos nos trabalhos anteriores e no estudo
presente, a recontaminação é, de necessidade, não apenas de processos
relacionados a eventos mas também sempre de um processo que depende de
tempo, considerando o material médico de grau poroso. É influenciado por
propriedades de barreira da embalagem – por exemplo, o número de camadas na
caixa da embalagem ou a qualidade do material da embalagem – e as condições do
ambiente, tais como conteúdo microbiano interno e externo no ar, mudanças de
temperatura e pressão atmosférica e pressão mecânica durante o manuseio.
Estes estudos mostram que todos os fatores ambientais são efetivamente “eventos”
e que nem uma data relacionada a evento exclusivamente, nem uma data de
expiração relacionada a tempo é apropriada. A desatualização deveria ser
representada baseando-se na determinação do risco científico que considere as
propriedades de barreira da embalagem, por um lado, e por outro lado, a eficiência
apropriada da embalagem de barreira necessária pelas influências ambientais
inevitáveis específicas. O padrão internacional ISO 11607-1 especifica que o
fabricante dos sistemas de barreiras estéreis deva fornecer informações no que se
refere a qualquer restrição conhecida (exemplo: condições ambientais), manuseio
ou utilização, e no que se refere a freqüência e natureza da manutenção das
medidas aplicáveis ao reuso de materiais ou a sistemas de barreira estéril pré
formados.
No nosso estudo, mostramos que o conceito de LRV que caracteriza a eficácia da
embalagem de barreira pode ser aplicado com sucesso ao cálculo da eficácia da
embalagem de barreira necessária que resulta dos desafios microbianos e a
condição de exposição relevante para transporte e armazenamento. Desta forma,
pode-se estabelecer se as propriedades de barreira da embalagem são suficientes
para os desafios microbianos específicos, de acordo com os padrões qualitativos do
nível de garantia de esterilidade. Nós, portanto, recomendamos que os fabricantes
e usuários de sistemas de barreira estéril apresentem dados sobre a eficácia da
embalagem de barreira microbiana. A compatibilidade da embalagem com
condições físicas específicas (exemplo: temperatura e mudança de pressão
atmosférica e condições microbiológicas durante o transporte e armazenamento
pode ser determinadas). Produtos médicos estéreis embalados em embalagens
porosas podem ser confiavelmente manuseados de forma responsável somente se
estes dados estiverem disponíveis.