PLANTS WITH PHYTOTOXIC POTENTIAL: WOLLEMI PINE (WOLLEMIA NOBILIS)

Plantas com potencial fitotóxico: Pinheiro Wollemi (Wollemia nobilis)

Um pequeno estande de Wollemia nobilis W.C. Jones, K.D. Hill e J.M. Allen
(pinheiro Wollemi), foi descoberto na década de 1990 perto de Sydney, Austrália.
Anteriormente, essa espécie, que pertence às Araucariaceae, era considerada extinta. Desde
sua redescoberta, muitas pesquisas se concentraram em elucidar a estratégia de sobrevivência
dessa espécie e examinar sua composição química e genética. De acordo com Jones et al.
(1995) e Hill (1996), o pinheiro Wollemi é considerado uma das espécies arbóreas mais raras
em todo o mundo. Existem várias hipóteses sobre como o pinheiro Wollemi resistiu ao fogo e
outros desastres naturais. Offord et al. (1999) sugerem que o pinheiro Wollemi foi protegido
de incêndios florestais devido à sua localização, nas profundezas de um cânion. A
característica de autocorte, sendo capaz de se regenerar assexuadamente gerando vários
troncos de botões dormentes no tronco da árvore, também foi sugerida como uma estratégia
de sobrevivência chave do pinheiro Wollemi (Hill, 1997; Offord et al., 1999) McGee et al.
(1999) encontraram micorrizas arbusculares (AM) e ectendomicorrizas (EM) nas raízes do
pinheiro Wollemi.
Esses fungos micorrízicos costumam estabelecer associações mutualísticas com as
plantas e podem aumentar a absorção de água e nutrientes pelas plantas. Esta pode ser uma
estratégia de sobrevivência importante, uma vez que o povoamento de pinheiros Wollemi
ocorre em solo de baixa qualidade em um ambiente sombreado de floresta tropical (McGee et
al., 1999).
O pinheiro Wollemi coexiste com outras espécies da floresta tropical, como lírios
(Acmena smithii), coachwood (Ceratopetalum apetalum), sassafrás (Doryphora sassafras) e
várias espécies de fetos (Jones et al., 1995). É relatado que várias dessas espécies
desenvolveram diferentes defesas potenciais, tanto físicas quanto químicas, muitas para
impedir a herbivoria. Por exemplo, coachwood contém vários alcalóides amargos (Iddles et
al., 2003), assim como sassafrás (Carroll et al., 2001; Iddles et al., 2003). Para que o pinheiro
Wollemi resista à herbivoria e sobreviva neste ambiente, ele também pode ter desenvolvido
algumas defesas físicas e / ou químicas. O pinheiro Wollemi não possui tricomas, nem
espinhos, no entanto, alguns relatórios sugerem que ele contém constituintes químicos
interessantes (Brophy et al., 2000; Fonseca et al., 2000; Cordenunsi et al., 2004; Olawore e
Ogunwande, 2005). Além de Wollemia, a família Araucariaceae também contém dois outros
gêneros, Agathis e Araucaria. Brophy et al. (2000) examinaram os produtos químicos
encontrados nos óleos essenciais de pinheiro Wollemi e espécies relacionadas da família
Araucariaceae. Vários compostos foram relatados nessas espécies, muitos deles possuindo
considerável bioatividade. Além disso, em um estudo desenvolvido para descobrir novos
compostos de plantas com propriedades herbicidas, Haig et al. (2005) determinaram que o
pinheiro Wollemi é altamente fitotóxico. Devido à sua natureza inovadora e aos seus
potenciais constituintes químicos bioativos, esta espécie foi selecionada para este estudo
como uma boa candidata para a triagem de sua capacidade herbicida, tendo o azevém anual
(ARG, Lolium rigidum Gaudin) como espécie-alvo.

ARG é a erva daninha mais importante que infesta as plantações de trigo no sul da
Austrália e é considerada a erva daninha economicamente mais importante da Austrália
(Powles et al., 1997; Pannell et al., 2004). O custo da perda de rendimento como resultado da
infestação de ARG foi estimado em $ 500 milhões (Pratley, 2008). As opções de controle para
esta erva daninha são limitadas devido ao desenvolvimento de resistência a herbicidas em
ARG, biótipos dos quais são resistentes a vários grupos de herbicidas principais (Preston et
al., 1999; Neve et al., 2004; Broster e Pratley, 2006). Uma opção a ser explorada é o
desenvolvimento de um herbicida natural derivado de novos compostos de plantas com
propriedades herbicidas. Devido às suas múltiplas funções, afirma-se que os compostos
naturais também seriam menos propensos a induzir resistência a herbicidas em populações de
ervas daninhas (Wink, 1993). Em um desses estudos, Haig et al. (2005) examinaram mais de
130 culturas, ervas daninhas e espécies de plantas nativas quanto à sua fitotoxicidade contra
ARG, incluindo várias espécies com propriedades alelopáticas ou farmacêuticas. Os extratos
de três espécies resultaram em altos níveis de inibição do crescimento da raiz ARG e foram
selecionados para análise posterior. Um desses extratos, o extrato de folha de pinheiro
Wollemi, inibiu quase completamente o crescimento da raiz de ARG em concentrações de
extrato acima de 25% (100% = 100 g / L) (Haig et al., 2005). Dada a raridade dessa espécie
nativa pouco conhecida, pode haver novas químicas de herbicidas envolvidas. Neste estudo, o
extrato de pinheiro Wollemi foi avaliado quanto à sua fitotoxicidade, especificamente contra
duas espécies de plantas tipicamente presentes como ervas daninhas em plantações de
inverno, para determinar o potencial mais amplo dos compostos encontrados no extrato de
pinheiro Wollemi para o manejo futuro de ervas daninhas em plantações de broadacre
australiano. Usando fracionamento guiado por bioensaio, a fitotoxicidade potencial de
extratos aquosos puros foi avaliada e os constituintes bioativos potenciais foram identificados
via GC / MS.
2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Preparação de extrato

O material de folha de pinheiro Wollemi obtido de um pequeno povoamento

descoberto perto de Sydney foi seco por 72 horas a 40 ° C e depois cortado em um joio fino
para passar por uma tela de 40 mesh. Dez gramas de material vegetal moído foram
adicionados a 100 mL de água destilada estéril em uma garrafa Schott de 250 mL,
embrulhada em papel alumínio e armazenada em uma Incubadora de Baixa Temperatura
Modelo 818 de Precisão ajustada a 20 ° C por 72 h. O extrato foi então filtrado através de
duas camadas de pano de algodão e centrifugado por 20 min a 15.000 rpm usando uma
centrífuga SOVAL. Esta concentração de extrato (10 g / 100 mL) foi considerada para futuras
comparações como o extrato não diluído (ou seja, 100%). A diluição em série foi então
realizada usando água destilada estéril para obter concentrações de extrato de 50, 25, 10, 5, 1
e 0,1%. Água destilada estéril foi usada como controle. O pH de todas as concentrações foi
determinado usando um medidor de pH digital TPS, e a condutividade elétrica (CE) foi
medida usando um medidor de condutividade de bolso Activon. Todos os procedimentos após
a centrifugação do extrato foram realizados em uma cabine de fluxo laminar de fluxo cruzado
para minimizar a contaminação. A coleta foi esterilizada superficialmente com NaClO 2% por
1 min e enxaguada sete vezes com água destilada estéril. As sementes foram então colocadas
em placas de Petri de 9 cm forradas com papel de filtro (Whatman # 1) umedecido com 4 mL
de água destilada estéril. As placas foram colocadas em uma incubadora com ciclo de 14h
dia / 10h noite por 48h. Pratos de rabanete foram embrulhados em papel alumínio, pois isso
facilitou uma maior germinação.

2.3. Bioensaios

Os bioensaios foram conduzidos em cada espécie de teste individualmente. Quatro

mililitros de cada concentração de extrato foram adicionados a béqueres esterilizados de 250
mL que foram revestidos com papel de filtro Whatman # 1. Dez sementes pré-germinadas
foram então adicionadas ao béquer e o béquer coberto com parafilme. Três repetições foram
arranjadas em um delineamento de blocos completos casualizados nas condições
experimentais mencionadas acima.

Os bioensaios também foram conduzidos com sementes que não haviam sido pré-
germinadas. Neste caso, as sementes foram esterilizadas à superfície como descrito acima,
mas foram semeadas imediatamente nos béqueres com as soluções de teste. O comprimento
da raiz e do caule da muda mais longa foram medidos com uma régua cinco dias após a
semeadura. Assim, o tempo total para bioensaios utilizando sementes germinadas e não
germinadas foi de cinco dias. No caso do rabanete selvagem, onde a germinação é melhor no
escuro, os béqueres foram embrulhados em papel alumínio por dois dias. Todos os bioensaios
foram repetidos para verificar os resultados. O extrato de pinho Wollemi também foi testado
contra sementes ARG de populações conhecidas por serem resistentes ao glifosato (Grupo M)
e diclofop metil (Grupo A fops) obtidas por meio do serviço de teste de resistência a
herbicidas na Universidade Charles Sturt. Esta semente é doravante referida como ARG
resistente a herbicidas.

2.4. Atividade no 'solo'

Para determinar se os efeitos fitotóxicos do extrato de pinheiro Wollemi seriam

mantidos no "solo", ensaios adicionais foram realizados em uma incubadora ajustada a 20 ° C
com 14h dia / 10h noite. Neste estudo, o meio utilizado foi 50:50 (areia: musgo de turfa),
doravante denominado solo, sendo uma mistura comumente utilizada em ensaios de
resistência a herbicidas conduzidos na Universidade Charles Sturt por mais de 10 anos. As
bandejas do berçário (8 9 grades, cada quadrado de 3 cm 3 cm) foram preenchidas com solo e
colocadas em uma grande cuba rasa cheia de 1 cm de água destilada. Cinco sementes ARG
pré-germinadas foram plantadas por quadrado logo abaixo da superfície do solo e então
pulverizadas com água destilada para umedecer o solo. Três dias depois, 5 mL de cada
tratamento de extrato foram adicionados por quadrado. Os tratamentos incluíram um controle
de água destilada, 100, 200 e 400% de soluções de extrato e 100% de extrato enriquecido com
um dos dois agentes umectantes: Hot Up1 (340 g / L não iônico + 190 g / L de óleo mineral +
140 g / L de sulfato de amônio ) (taxa de 1 mL / L) ou BS 10001 (alcoxilato de álcool 1000
g / L) (taxa de 2,5 mL / L). As soluções de 200 e 400% foram preparadas por evaporação
rotativa da solução estoque 100% usando um evaporador rotativo Buchi com uma temperatura
máxima da água de 40 ° C. Três repetições foram dispostas em um bloco completo ao acaso.
Após sete dias, foram medidos o comprimento do rebento das mudas e a massa fresca do
rebento.

2.5. Extração de solvente e fracionamento

Utilizando o método de preparação do extrato mencionado anteriormente, foram

obtidos 650 mL de extrato 100% de pinho Wollemi. O método de extração e fracionamento
com solvente usados aqui foi ligeiramente modificado de Weston et al. (1987). Para precipitar
qualquer material proteico, 2 L de acetona foram adicionados ao extrato e, em seguida,
agitados lentamente por 48 h a 2° C. O precipitado foi filtrado através de duas camadas de
papel de filtro Whatman # 1 e Whatman # 42, e a acetona foi evaporada usando um
evaporador rotativo Buchi. O extrato aquoso remanescente foi então submetido a uma série de
extrações por solvente, em ordem de polaridade. O extrato foi particionado quatro vezes com
alíquotas de 300 mL de cada solvente: hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol. As
frações combinadas do solvente foram evaporadas em rotação sob vácuo a uma temperatura
máxima de 40° C e sopradas até a secura com nitrogênio. Cada fração de solvente seco foi
armazenada a 4° C antes do uso.

2.6. Bioensaios de frações de solvente

O material obtido de todas as quatro frações de solvente foi usado nos bioensaios.
Neste caso, apenas ARG suscetível a herbicida foi usada como espécie de teste. Uma
concentração de estoque de 4000 ppm para cada fração de solvente foi feita dissolvendo uma
quantidade apropriada de material seco em metanol de grau de HPLC. Concentrações
adicionais de 2.000, 1.000 e 100 ppm foram feitas por diluição em série em metanol. Um
mililitro de cada solução foi adicionado a um copo estéril de 250 mL forrado com papel de
filtro Whatman # 1 e deixado evaporar até a secura em um fluxo laminar. No caso do
controle, 1 mL de metanol puro foi adicionado e deixado evaporar. Quatro mililitros de água
destilada estéril foram então adicionados aos béqueres. Isso resultou em concentrações de
1000, 500, 250 e 25 ppm nos béqueres. Cada copo foi semeado com dez mudas ARG pré-
germinadas. Três repetições foram arranjadas em um delineamento de blocos completos ao
acaso sob as condições experimentais descritas acima. Os comprimentos da raiz e da parte
aérea de ARG foram medidos após três dias.

2.7. Análise química de frações - instrumentação

 Diversas abordagens foram utilizadas para a análise química de cada fração de
solvente obtida do pinheiro Wollemi. Isso incluiu a correspondência de espectros de massa
(MS) detectados nas amostras de fração com entradas no banco de dados da biblioteca NIST
2005, usando a referência de Adams (1995) contendo os tempos de retenção (rT) e MS para
muitos componentes do óleo essencial e injeção de compostos puros para obter rT e MS
individuais.
A análise química foi conduzida em um cromatógrafo de gás Varian 3400CX
equipado com uma coluna capilar de sílica fundida J & W Scientific DB-5 (30 m de
comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 mm de filme) acoplado a um
espectrômetro de massa de armadilha de íons Varian Saturn 2000 usando um programa de
temperatura idêntico a Adams (1995). A temperatura do injetor era de 220 ° C. A temperatura
inicial da coluna foi constante a 60 ° C e aumentou para 240 ° C a uma taxa de 3 ° C / minuto
até o final da execução de 38 minutos. O hélio foi o gás portador com velocidade linear de 34
cm / s. A faixa de varredura de massa foi definida em 41-300 m / z no modo de ionização por
impacto de elétrons (EI) de 70 eV.
Usar o mesmo tipo de coluna e um programa de temperatura idêntico permite a
comparação entre a amostra rT e aqueles relatados em Adams (1995). Isso é essencial porque
vários terpenos têm MS muito semelhante e em uma amostra de compostos desconhecidos, rT
são necessários para identificações positivas. Os dados foram analisados usando o software
Saturn Chromatography Work Station da Varian (Walnut Creek, Califórnia) (Versão 1.3).

2.8. Análise química de frações - construção da biblioteca MS e rT

Poucos trabalhos relataram os constituintes químicos do pinheiro Wollemi e outros

membros das Araucariaceae. Da literatura limitada, 17 metabólitos secundários foram
selecionados e compostos de referência puros foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Austrália),
a saber ( - ) aromadendrene, canfeno, p-cimeno, ácido ferúlico, ( - ) globulol, a-humuleno, 3-
ácido hidroxibenzóico, ácido 4 hidroxibenzóico, álcool 4-hidroxi-3-metoxibenzílico, ácido
isovanílico, limoneno, (+) α-pineno, (+) β-pineno, ( - ) β-pineno, Y-gterpineno, α-terpinol e
terpinoleno. Estes compostos puros foram dissolvidos em metanol de grau de HPLC a 20 ppm
e aplicados por injeção sem divisão em alíquotas de 1 mL para obter o MS e o rT de cada
composto. No caso de padrões fenólicos, 1 mL de bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida
(BSTFA) foi adicionado a um reativo de 2 mL junto com o padrão e aquecido em um forno
60 8C por 20 min antes da injeção para garantir que a amostra foi totalmente derivatizada.
 2.9. Análise química de frações - identificação de compostos

Cada fração de solvente foi dissolvida em metanol de grau de HPLC para obter
soluções de 1000 ppm e injetada (sem divisão) no GC / MS em alíquotas de 1 mL. Um
mililitro de cada fração foi soprado até a secura em um reativo usando nitrogênio e
derivatizado como descrito acima usando BSTFA para converter quaisquer compostos
fenólicos desconhecidos presentes na fração em derivados trimetilsilil voláteis. A
identificação de picos de GC foi auxiliada pelo uso de bibliotecas de padrões de referência
puros. As identificações positivas foram feitas se o pico na amostra da fração tivesse um valor
de ajuste espectral de pelo menos 750 de 1000 possíveis, além de uma correspondência de rT.
Bem como a identificação usando bibliotecas de referência personalizadas, a comparação de
MS com entradas no banco de dados NIST 2005 também foi usada para identificar compostos
presentes nas frações. Por fim, foram feitas comparações entre o MS e o rT relatado em
Adams (1995) e os de picos cromatográficos nas frações do solvente. Este último método foi
usado para aqueles compostos não disponíveis comercialmente, como germacreno-D e 16-
caureno, dois compostos principais encontrados no óleo essencial de pinho Wollemi (Brophy
et al., 2000).

2,10. Estatísticas
Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) usando Genstat 7. Para
os bioensaios, as médias replicadas do comprimento da raiz e do caule e o peso do caule
foram convertidos em porcentagem do controle. As diferenças mínimas significativas (l.s.d.)
em p = 0,05 dos dados de comprimento da raiz percentual de controle foram calculadas para
permitir comparações entre as concentrações. Graficamente, 50% de inibição da raiz nos
bioensaios ocorreu em uma região onde as curvas são aproximadamente lineares. Assim, a
análise de regressão linear dessas porções lineares das curvas de resposta à dose pode ser
usada para estimar os valores de dose efetiva (ED50) para o extrato bruto de pinho Wollemi e
cada uma das frações de solvente do extrato. As estimativas foram feitas determinando a
inclinação desta linha onde Y = mX + b. A inclinação é representada por 'm' e 'b' representa a
interceptação Y. Usando esta equação, um valor correspondente para a dose (X) no valor de
resposta Y = 50% pode ser estimado.