Curso de

Disciplina: Microbiologia Clínica

Prof. Dra. Milce Costa

TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS BÁSICAS

INTRODUÇÃO:

Para um bom desempenho no laboratório de Microbiologia Clínica é necessário que os profissionais tenham um mínimo
de conhecimento em técnicas básicas (confecção de esfregaços, coloração de lâminas, preparo de meios de cultura e
inoculação de amostras), comuns desta disciplina. A habilidade nestas técnicas são críticas para o sucesso no diagnóstico
em microbiologia clínica.

A. CONFECÇÃO DE ESFREGAÇOS

ESQUEMA REPRESENTATIVO

De um material líquido De um material sólido (amostra

(amostra ou meio de cultura) ou meio de cultura)

1. Com a alça de platina, colocar 2 gotas do 1. Com a alça de platina, colocar 1 gota de
material no centro da lâmina limpa, seca e H2O destilada ou salina estéril no centro
desengordurada. da lâmina limpa, seca e desengordurada.

2. Transferir amostra ou colônias do meio

2. Fazer movimentos circulares com a alça com a alça para a gota de H 2O ou salina.
para espalhar o material por ± 2/3 da Fazer movimentos circulares com a alça
lâmina. para espalhar o material por ± 2/3 da
lâmina.

Fixação do material

3. Esperar o esfregaço secar.

4. Flambar o esfregaço na chama do bico de
Bunsen por ± 2 ou 3 vezes.

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B. COLORAÇÃO DE LÂMINAS

Devido ao fato da bactéria ser transparente quando observada no seu estado natural, é necessário que esta seja
submetida a um processo de coloração para se tornar possível o estudo de sua morfologia microscopicamente.
Existem vários tipos de coloração em bacteriologia, sendo as três mais comumente realizadas no laboratório de
Microbiologia Clínica a coloração de Gram, coloração de Ziehl Neelsen e coloração de Fontana Tribondeau.
1. COLORAÇÃO DE GRAM
Esta coloração tem o propósito de classificar as bactérias segundo suas características morfotintoriais (morfologia:
forma, tamanho e detalhes de sua estrutura); (características tintoriais: Gram positivo; Gram negativo), de acordo com as
diferenças de composição da parede celular.
a) Características morfológicas:
– cocos (isolados, aos pares, tétrades, cadeia, cachos, encapsulados)
– bacilos (aos pares, longos, em cadeia, cocobacilos etc)
b) Características tintoriais: – Gram positivo (violeta ou roxo). Ex: Staphylococcus aureus
– Gram negativo (vermelho ou rosa pink). Ex: Escherichia coli
Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve nunca ser utilizada como um
diagnóstico definitivo. Este teste serve para um diagnóstico rápido presuntivo de um agente infeccioso.

2. COLORAÇÃO DE ZIEHL NEELSEN

Esta técnica, também conhecida como coloração para bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), é utilizada para
identificação de micobactérias. As bactérias dos grupos Micobactéria não podem ser classificadas pela coloração de
Gram devido à diferença na composição da parede celular destes grupos.
A coloração de Zielh-Neelsen demonstra a capacidade que certas bactérias coradas têm de resistirem à
descoloração por álcool/ácido, propriedade esta, relacionada ao alto conteúdo de lipídios (ácidos micólicos) que envolve
sua parede celular.
a) Características tintoriais: – BAAR positivo (vermelho ou rosa pink) Ex: Mycobacterium sp
– BAAR negativo (azul).

3. COLORAÇÃO DE FONTANA TRIBONDEAU

A coloração de Fontana Tribondeau é usada para pesquisar a presença de bactérias espiroquetas, como o
Treponema pallidum, em material de lesão genital masculina ou feminina ou mais raramente em outras localidades
(mucosa oral, reto, etc.), que ocorre durante a fase primária da sífilis.
As espiroquetas são bactérias que se impregnam pela prata, quando tratadas com nitrato de prata, que está
presente na coloração de Fontana Tribondeau.
a) Características tintoriais: – Fontana Tribondeau positivo (marrom): espiroquetas impregnadas pela prata.
– Fontana Tribondeau negativo (incolor): material não impregnado pela prata.

C. MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura usados no laboratório de Microbiologia consistem de quantidades e medidas com precisão de
substâncias necessárias (aminoácidos, carboidratos, minerais, sais, vitaminas, etc.) ao crescimento bacteriano. Podem
ser sólidos, semi-sólidos ou líquidos, dependendo da quantidade de ágar que contém. O ágar é formado por extrato de
algas marinhas, ficando líquido quando aquecido e sólido quando resfriado. Esta característica proporciona que o meio
pode ser colocado tanto em tubos, quanto em placas de Petri.
Nos meios sólidos podem ser evidenciadas as características das colônias formadas (formato, cor, tamanho,
presença de hemólise, etc.), enquanto que nos meios líquidos observa-se a principalmente a produção de gás e turvação
do meio produzido pelas bactérias.
Os meios de cultura são divididos em 4 grupos:

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1. MEIOS DE SUPORTE OU NÃO SELETIVOS: meio básico contendo nutrientes simples, como proteínas, extrato
(peptona, triptona), derivados enzimaticamente de carne, leite, soja, que servem como suporte para o crescimento de
micro-organismos não exigentes. Ex: ágar nutriente, ágar Mueller Hinton.

2. MEIOS DE ENRIQUECIMENTO: possui substâncias adicionais para permitir o crescimento de micro-organismos

exigentes. São meios de suporte acrescido de suplementos como sangue ou produtos de soro, ovo e/ou vitaminas e
minerais. Ex: ágar sangue, ágar chocolate.

3. MEIOS SELETIVOS: meio básico ou de enriquecimento adicionado de antibióticos, antifúngicos ou outras

substâncias químicas, como sais biliares, que inibem o crescimento de alguns micro-organismos e acentuam o
crescimento de outros, ou seja, são elaborados para favorecer o crescimento do m.o de interesse, impedindo o
crescimento de outros.
Ex: ágar Salmonella-Shigella (ágar SS), ágar de sal de manitol, Ágar Sabouraud.

4. MEIOS DIFERENCIAIS: este tipo de meio contém corantes, indicadores de pH e outros componentes que
possibilitam a expressão de características do metabolismo do micro-organismo permitindo sua diferenciação. Ex: ágar
MacConkey, ágar eosina-azul de metileno (EMB).

Exemplo: Preparo de Ágar Nutriente: ÁGAR NUTRIENTE, pH 6.0 COM 0.8% DE NaCl (500 gramas) – BIOSYSTEMS

Ágar Nutriente: Fórmula g/L

Peptona bacteriológica 5,0
Extrato nutritivo 1,0
Extrato de levedura 2,0
Cloreto de sódio 5,0
Àgar 15,0

Cálculo para preparação do meio:

Verificar rótulo e proceder o cálculo. Hidratar com água destilada.

Rótulo do meio de cultura: 28 gr--------1000mL água destilada

X gr-------- y mL (verificar previamente quanto vai precisar)

* ÁGAR SABOURAUD (para cultivo de fungos): Usar Antibiótico (cloranfenicol)

Obs: ¼ para 1 L (após autoclavar). Verificar rótulo e proceder o cálculo.

Procedimento
1) Verificar rótulo da embalagem
2) Calcular a quantidade a ser feita (embale as placas/tubos suficientes)
3)Pesar o meio de cultura
4)Completar o volume com água destilada
5)Dissolver o meio no balão usando o bico de Bunsen e a tela de amianto
6)Avalie o pH do meio utilizando fitas de papel indicador. O pH deve ser = ~ 6,8 – 7,0
7)Esterilizar em autoclave (autoclave: 121 ºC – 1 atm – 20 min)
8)Distribuir os meios de cultura em placas de Petri ou tubos de ensaio esterilizados
9)Após resfriar, armazenar em geladeira

Estocagem dos meios: (pode variar segundo o fabricante, verificar no rótulo do meio).
- Devem ser mantidos protegidos da luz e em geladeira.
- Validade: tubos com tampa de algodão - 3 semanas; placas de Petri lacradas em plástico – 4 semanas
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Atenção: Distribuição do meio na capela – Procedimento do operador:

- lavar as mãos com água e sabão e passar álcool 70%

- ligar a luz ultra-violeta da capela 15 min antes de iniciar
- limpar a superfície de trabalho com álcool (70%) ou hipoclorito de Na
- ligar e manter o bico de Bunsen aceso durante o procedimento

- manter as placas e os frascos abertos por pouco tempo

- não passar o braço ou a mão sobre a área de trabalho; não conversar
- ao terminar, desligar o bico de Bunsen, limpar e desligar a capela.

Esterilização através de AUTOCLAVE (calor/vapor úmido):

A esterilização por autoclave a vapor tem se apresentado como o método que reúne mais vantagens. As
vantagens deste método baseiam-se na sua maior segurança, menor dano aos materiais e menor tempo gasto. A
desvantagem encontra-se na impossibilidade de esterilização de materiais termossensíveis ou não resistentes ao calor,
como por exemplo, materiais plásticos delicados.
- A esterilização através de vapor sob pressão pode ser realizada em diferentes ciclos, com diversidades de tempo e
temperatura, dependendo do tipo, tamanho e marca da autoclave e dependendo dos tipos de instrumentais e materiais. O
ciclo mais utilizado e preconizado pelo Ministério da Saúde é de 20 minutos a 121 oC (1 atm).
- O calor úmido causa desnaturação de proteínas (Setlow, 1995; Setlow and Setlow, 1998) e desorganização da
membrana plasmática (Crisan, 1973), mas não causa mutações ou dano do DNA do micro-organismo (Setlow and
Setlow, 1998).
- Todos os materiais devem ser esterilizados dentro de pacotes pequenos, utilizando embalagens de papel ”kraft”. Os
pacotes devem ser fechados com fita adesiva comum ou com fita indicativa. Os pacotes devem ser colocados dentro da
autoclave deixando espaços entre eles, permitido a circulação do vapor. A esterilização deve ser repetida se o pacote
estiver danificado (rasgado, furado, aberto).

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ESQUEMA REPRESENTATIVO DA TÉCNICA DE PREPARO DE MEIO DE CULTURA

D. TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO DE AMOSTRAS

Semear ou inocular significa introduzir artificialmente uma quantidade de amostra (inóculo) em um meio de cultura
adequado, com a finalidade de iniciar um cultivo microbiano. Após a inoculação, o meio de cultura é incubado a uma
temperatura adequada para o crescimento. A inoculação pode ser realizada em meio líquido, sólido ou semi-sólido,
utilizando-se uma alça de platina estéril.

- Cultivo em meio líquido

Habitualmente se realiza em tubos ou em frascos como erlenmeyers. O crescimento da população microbiana é
evidenciado pela turvação do meio, por formação de película ou por formação de sedimento.
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- Cultivo em meio sólido: Pode ser conduzido em tubos ou em placas.

a) Tubos com ágar inclinado: Para inoculação, move-se suavemente a ponta da alça sobre a superficie do ágar com um
movimento em zig-zag do fundo até a parte superior, com cuidado para não danificar (ferir) a superfície do meio.
b) Tubos com ágar não inclinado: Inocula-se introduzindo a ponta de uma alça em agulha no centro do meio.
c) Inoculação em placas de Petri: Pode ser em superfície ou em profundidade.

Incubar as placas na posição invertida, uma vez que a elevada concentração de água no meio pode provocar
condensação durante a incubação.

No meio sólido, cada célula viável dará origem a uma colônia, portanto a inoculação em placas de Petri pode ser utilizada,
não somente para cultivar micro-organismos, como também para contar e isolar.

Semeadura:
Regras para evitar a contaminação dos meios de cultura por micro-organismos ambientais.

1) A alça de platina (alça bacteriológica) deve ser flambada antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para
tanto, devem ser passada na chama de 2 a 3 vezes. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um
ângulo de 45°C em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen.

2) Para retirar o material, quer seja para a realização de um esfregaço, quer para semeadura, esfriar previamente a alça.
Esta deverá ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri.

3) Toda vez que se fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente
à retirada do tampão de algodão. Este deverá ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão que está segurando a alça.
Após a retirada do material com a alça, flambar a alça após o uso.

4) As placas de Petri deverão ser abertas próximas ao bico de Bunsen para evitar contaminação com micro-organismos
do ar. Uma vez semeadas, as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.

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ESQUEMA REPRESENTATIVO DAS TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO EM MEIOS DE CULTURA

1. TÉCNICA DA VARREDURA: Tem por objetivo promover o crescimento e a contagem de

colônias presentes na placa. A amostra deve ser semeada pelo método de varredura em
Meio Não Seletivo (Ex: ágar CLED) - para contagem de colônias.

2. TÉCNICA DO ESGOTAMENTO DE ALÇA: Tem por objetivo a obtenção de colônias

isoladas de bactérias em meio sólido. Inoculação do inóculo em meios sólidos dispostos
em placas para isolamento das colônias bacterianas, para que estas possam ser
posteriormente subcultivadas em outros meios. Procedimento:
a.) flambar a alça; b.) remover o tampão de algodão; c.) introduzir a alça na cultura de
bactéria; d.) com a alça, delicadamente, semear na placa de Petri; e.) flambar novamente a
alça; f.) a partir de um ponto já semeado, distribuir o material na placa, fazendo estrias no
restante da placa.

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1. INOCULAÇÃO EM TUBOS COM MEIOS SÓLIDOS E SEMI-SÓLIDOS

MEIO SÓLIDO: fazer estrias delicadamente MEIO SEMI-SÓLIDO: Introduzir a agulha dentro
sobre a superfície do meio. do meio até ± ½ do meio e a seguir, retirá-la.

2. INOCULAÇÃO EM TUBOS COM MEIOS LÍQUIDOS

MEIO LÍQUIIDO: inclinar o tubo vertendo o

líquido delicadamente, transferir o inoculo da
alça para parede do tubo e posteriormente,
homogeneizar.

Bibliografia:

Murray P.R. Microbiologia Médica. 5ª ed. (2006) Ed. Mosby Elsevier.

Tortora Funke & Case. Microbiologia 6ª ed. (2000) Artmed.
Microbiologia, Fundamentos & Aplicações - Métodos em Microbiologia - © 2007 Paulo E. Moretti
Ann C. Smith & Marise Hussey, Dept. of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland; imagem licenciadas
para uso, ASM Microbe Library.
- Manual de Desinfeccção UERJ e UFBA
- Associação paulista de estudos e controle de infecção hospitalar (APECIH). Esterilização de Artigos em Unidades de
Saúde. São Paulo, 1998.
- COSTA, A.O.; CRUZ, E.A.; GALVÃO, M.S.S.; MASSA, N.G. Esterilização e desinfecção: Fundamentos básicos,
processos e controles. São Paulo. Cortez, 1990.

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