Disciplina RGM 5802 Citogenética I Guia Prático de Preparo de Soluções e Reagentes

Programa de Pós-Graduação em Genética – FMRP/USP SOLUÇÃO DE LISE ESTOQUE

Reagentes:
Docente responsável: NaCl (2,5M) --- 146,1 g
EDTA (100mM) --- 37,2 g
Profa. Dra. Catarina Satie Takahashi Tris (100mM) --- 1,2 g
H2O destilada --- q.s.p 1 L
pH --- 10,0
Preparo:
AULA PRÁTICA: ENSAIO COMETA Dissolver primeiro o NaCl e o Tris em uma parte da água e posteriormente
adicionar o EDTA. Acertar o pH para 10,0 usando NaOH (“pellets” ou
micropérolas). Tranferir a solução para um balão volumétrico e completar com o
Considerações Gerais: restante da água para 1 L. Conferir novamente o pH e abrigar em um frasco
O Ensaio Cometa é um método versátil e sensível para a detecção de protegido da luz devidamente identificado.
Observações:
quebras de fita simples e dupla no DNA. Ele tem sido amplamente utilizado como - o EDTA começa a se dissolver próximo de pH 8,0; sendo assim, faça essa
uma ferramenta para a avaliação das respostas celulares aos danos no DNA, solução com calma adicionando lentamente o NaOH;
- existe a possibilidade de se adicionar 10 g de N-Lauroyl Sarcosine após o pH ter
podendo ser aplicado em estudos de genotoxicidade, biomonitoramento, sido acertado para 10. Fica como opção usar ou não esse reagente;
ecotoxicológicos e ainda alguns estudos que envolvem saúde humana. - essa solução pode ser conservada em T.A. ou a 4ºC por mais de um mês. Esteja
atento ao aspecto geral da solução quando for utilizar, pois ela pode apresentar
Uma das maiores vantagens do Ensaio Cometa é a possibilidade de sua algumas precipitações que interferem no ensaio.
aplicação em diferentes tipos celulares que não necessariamente estejam em
SOLUÇÃO DE LISE USO
proliferação, tanto in vitro quanto in vivo. As possibilidades de agregar ao Ensaio Reagentes:
Cometa o uso de enzimas, a modificação de pH durante a eletroforese e o uso de Triton-X 100 --- 1 mL
DMSO --- 10 mL
sondas gênicas e/ou cromossômicas (Comet-FISH) permitem uma ampla Solução de lise (estoque) --- 89 mL
variedade de abordagens como a detecção específica de quebras de fita simples, Preparo:
Misturar todos os reagentes e manter essa solução protegida da luz. Deve ser
quebra de fita dupla, purinas e pirimidinas oxidadas e sítios álcali-lábeis. preparada poucas horas antes de ser usada e deve ter a temperatura estabilizada
Basicamente, o método consiste em isolar células individualizadas em a 4ºC.
Observação:
uma matriz de agarose e submetê-las a uma etapa de lise onde restará apenas o - essa solução não pode ser preparada com muita antecedência.
conteúdo do DNA nuclear aderido a essa matriz. Posteriormente, esses núcleos
SOLUÇÃO DE EDTA (A) PARA ELETROFORESE
(nucleóides) são submetidos a uma eletroforese de baixa voltagem onde as Reagentes:
quebras do DNA migram em direção ao ânodo. Na etapa seguinte as lâminas são EDTA --- 14,89 g
H2O destilada --- 200 mL
coradas e analisadas. pH --- 10,0
Preparo:

1
Misturar o EDTA e a água e acertar o pH para 10,0 utilizando NaOH. Conservar Agarose “standard” --- 1,5 g
em geladeira. PBS 1X --- 100 mL
Preparo:
SOLUÇÃO DE NaOH (B) PARA ELETROFORESE Misturar a agarose e a água e levar ao microondas até que a agarose esteja
Reagentes: totalmente dissolvida.
NaOH --- 200 g Observações:
H2O destilada --- 500 mL - Durante o preparo das lâminas essa solução deve estar em aproximadamente
Preparo: 60ºC;
Adicionar o NaOH à água vagarosamente até dissolver por completo. - Essa solução pode ser armazenada em geladeira e ser reutilizada por até três
Observação: vezes.
- guardar essa solução em frasco plástico em um local protegido da incidência de
luz.
GEL DE AGAROSE DE BAIXO PONTO DE FUSÃO
SOLUÇÃO DE ELETROFORESE (USO) Reagentes:
Reagir 5 mL da solução de EDTA (A) com 30 mL da solução de NaOH Agarose de baixo ponto de fusão --- 0,5 g
(B), completando para 1000 mL de H2O destilada. Conferir o pH que deve estar PBS 1X --- 100 mL
maior ou igual a 13. Deixar estabilizar a temperatura para 4ºC. Preparo:
Misturar a agarose e a água e levar ao microondas até que a agarose esteja
SOLUÇÃO TAMPÃO DE NEUTRALIZAÇÃO totalmente dissolvida.
Reagentes: Observação:
Tris (0,4M) --- 48,5 g -fazer alíquotas de 5 ou 10 mL e armazenar em geladeira por tempo
H2O destilada --- q.s.p. 1 L indeterminado.
pH --- 7,5
Preparo: SOLUÇÃO DE PBS 10X (livre de Ca++ e Mg++)
Dissolver o Tris na água a acertar o pH para 7,5 usando HCl P.A. (12 N). Reagentes:
Conservar em T.A. ou na geladeira por 1 mês. NaCl --- 8 g
Observação: Na2HPO4.7H2O --- 21,07 g
Estar atento ao aspecto da solução no momento do uso, pois é uma solução que KH2PO4 --- 6 g
facilmente pode fungar. H2O destilada --- q.s.p. 1 L
Preparo:
SOLUÇÃO DE COLORAÇÃO Diluir todos os reagente na água e completar para 1 L. Autoclavar.
Estoque Observação:
Reagentes: -fazer pequenas alíquotas e congelar por tempo indeterminado.
Brometo de Etídio --- 10 mg
H2O destilada – 50 mL SOLUÇÃO TAMPÃO DE REAÇÃO DA ENZIMA hOGG1 (TAMPÃO F)
Preparo: Reagentes:
Adicionar o brometo à água, homogeneizar e abrigar protegido da luz. HEPES (40 mM) --- 9,53 g
Uso KCl (0,1 M) --- 7,45 g
Diluir 100 µL da solução estoque de brometo em 900 µL de H 2O destilada. EDTA (0,5 mM) --- 0,18 g
Proteger da luz. BSA --- 0,2 g
H2O destilada --- q.s.p. 1 L
GEL DE AGAROSE PARA COBERTURA DAS LÂMINAS pH --- 8,0
Reagentes: Preparo:

2
Diluir todos os regentes em água e acertar o pH para 8,0 utilizando KOH
(“pellets”). Conservar a 4ºC em frasco protegido da luz por até um mês.
DILUIÇÃO DA ENZIMA hOGG1 PARA O USO
A enzima proveniente do fabricante (New england Biolabs) contém 80 unidades,
sendo que são utilizadas 0,08 unidades de enzima por lâmina de Cometa. A
enzima é diluída no próprio tampão F,
Guia Prático de Preparo de Lâminas, Lise, Tratamento com enzima hOGG1
Eletroforese, Neutralização e Coloração
Preparo de lâminas:
As lâminas que recebem a primeira camada de agarose (1,5%) devem
ser previamente limpas com extran e água destilada e secas à temperatura
ambiente ou estufa 37ºC. Essas lâminas não podem estar oxidadas, precisam ter
uma das extremidades lapidada e preferencialmente ser uma lâmina de boa
qualidade.
Para fixar a primeira camada de agarose nas lâminas basta mergulhar,
uma a uma, as lâminas no gel de agarose (1,5%) a aproximadamente 60ºC. Os
excessos de agarose devem ser limpos e as lâminas devem permanecer em
temperatura ambiente na posição horizontal até que estejam completamente
secas.
Etapa intermediária: a viabilidade celular
-retirar uma alíquota de 15 µL de suspensão celular;
-adicionar 10 µL de solução de azul de trypan (0,4%);
-homogeneizar e esperar uns 5 minutos;
-contar 100 células: as viáveis não se coram e as células mortas ficam coradas de
azul;
-a porcentagem de células vivas deve estar acima de 70%.
Fixação do material biológico às lâminas:
A suspensão celular de estudo deverá ser homogeneizada à 100 µL
agarose de baixo ponto de fusão. De modo geral são utilizados de 10 a 20 µL
suspensão celular por lâmina. A literatura recomenda que a quantidade média
células por lâmina seja 1x104.
O procedimento se dá da seguinte forma:
-transferir para um microtubo 10 a 20 µL de suspensão celular;
-adicionar 100 µL de agarose de baixo ponto de fusão à 37ºC;
-misturar vagarosamente até que a mistura fique homogênea;
-pipetar esse material sobre uma lâmina previamente coberta com agarose
ponto de fusão normal;
-cobrir com uma lamínula evitando a formação de bolhas;
-levar à geladeira por 5 minutos;
-retirar a lamínula cuidadosamente e mergulhar as lâminas na solução de lise
(uso);
Etapa de lise, tratamento com enzima, eletroforese e coloração:
-deixar as lâminas descansando na solução de lise por pelo menos 12 h (pode
ficar até 1 mês);
-transferir as lâminas da solução de lise para outra cuba e lavá-las com PBS 1X a
4ºC por 5 minutos;
-lavar as lâminas duas vezes com tampão F a 4ºC por 5 minutos;
-retirar as lâminas da cuba e adicionar a enzima em cada uma das lâminas de
Cometa.
A enzima proveniente do fabricante (New england Biolabs) contém 80 unidades. A
diluição da enzima é realizada no próprio tampão F, sendo que para cada lâmina
de cometa, são adicionados 50 μL do tampão F contendo 0,08 unidades de
enzima.
-em seguida, cobrir as lâminas com lamínula (24X40mm) e incubá-las em uma
câmara úmida (Hybrite, Vysis) por 20 minutos a 37ºC;
-retirar as lâminas da câmara úmida e mantê-las em um freezer (-20ºC) por 20
segundos, para facilitar a retirada das lamínulas;
-deixar as lâminas descansando em uma cuba contendo tampão de eletroforese
(4ºC) por 20 min;
-transferir as lâminas para uma cuba de eletroforese contendo o tampão de
eletroforese (4ºC);
-correr a eletroforese por 20 min (25V, 300mA);
-retirar as lâminas da cuba de eletroforese e mergulhá-las no tampão de
neutralização por 15 min;
-deixar as lâminas secarem à T.A.;
-fixar as lâminas em etanol absoluto por 3 minutos;
-deixar as lâminas secarem à T.A.; armazenar até o momento da análise.
-adicionar de 30-50 µL de solução de coloração uso em cada lâmina;
-cobrir com uma lamínula e analisar em seguida.
de
de
de Guia prático de análise das lâminas
A análise das lâminas é feita em microscópio de fluorescência, filtro 516-
560 nm, barreira de filtro de 590 nm e aumento total de 400X. A extensão de cada
imagem significa a distância de migração da fita de DNA danificada. Essa análise
pode ser feita de diferentes modos:
de
1 - modo visual subjetivo por classificação das imagens em categorias
estabelecidas onde,
3
 0 1 2 3 4
0 - sem danos (< 5%);
1 - baixo nível de danos (5-20%);
2 - médio nível de danos (20-40%);
3 - alto nível de danos (40-95%);
4 - dano total (> 95%)
São analisados 100 nucleóides que são classificados nas categorias estabelecidas
acima.
Essa análise permite a obtenção do Índice de Danos no DNA (IDN) pela seguinte
fórmula:

IDN =
nº cels classe 0x0+ nº cels classe 1x1 nº cels classe 2x2+ nº cels classe 3x3+ nº
cels classe 4x4

_________________________________________________________________
Nº de células analisadas

Utilizando-se um sistema de captura de imagens acoplado a um software de

análise:
● Perceptive Instruments Ltd.;
● Meta Systems;
● Loats Associates, Inc.;
● The TriTek Corporation;
● Andor Bio-Imaging Division

Bibliografia
Olive, P.L. and Banáth, J. P., 2006. The comet assay: a method to measure DNA
damage in individual cells. Nature Protocols.